上調TAM受體對實驗性腦脊髓膜炎Th細胞作用的研究①

李曉玲 張 博 張亞嵐 劉 會 孫夢嬌 王滿俠

(蘭州大學第二醫院神經內科，蘭州 730030)

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種中樞神經系統的炎性脫髓鞘疾病，一種自身具有易緩解、復發的臨床特點，女性的發病率高于男性，是引起青壯年神經功能障礙最主要的神經系統疾病[1,2]。實驗性變態反應性腦脊髓膜炎模型(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前公認的MS的理想動物模型，能較好地模擬人類MS的發生、發展和轉歸過程[3]。Tyro3、Axl和Mer受體酪氨酸激酶簡稱 TAM受體，屬于受體酪氨酸激酶亞家族，是Tyro3、Axl和Mer基因表達的產物。具有抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和介導細胞黏附、遷移 、吞噬、凋亡等多種生物學功能[4]。TAM受體是單次跨膜蛋白，由神經細胞黏附分子的胞外配體結合域、跨膜區和有酪氨酸激酶結構域的胞內區組成，所以該家族受體既有黏附分子的特點，又有酪氨酸激酶的活性。TAM受體共同的配體是S蛋白(ProS)和生長停滯特異性基因6(growth arrest specific 6，Gas6)[5]。在表達TAM受體的細胞中，可以通過磷酸肌醇3-激酶PI3K/AKT和JAK/STAT通路促進細胞存活和增殖，同時抑制炎癥的發展[6]。本實驗采用EAE模型予以雷帕霉素(rapamycin，Rap)腹腔注射，上調TAM受體，觀察淋巴細胞相關炎癥因子的表達，進一步探討其在MS發生、發展過程中的免疫保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠36只，雌性，6～8周齡，體質量16～18 g，購自甘肅省中醫藥大學動物研究中心，飼養于甘肅省中醫藥大學動物實驗室(甘肅 蘭州)。按照隨機數字表法分為正常對照組、EAE模型組、雷帕霉素組，每組12只。已通過蘭州大學第二醫院倫理委員會審核。

1.1.2儀器與試劑 VORTEX-6型旋渦混合器購自吉林貝爾儀器公司；D1008型小型低速離心機購自北京大龍公司；Light Cycler96 型RT-PCT儀購自Roche；MOG35-55購自CS Bio公司；完全弗氏佐劑購自Chondrex公司；雷帕霉素購自Lc labaratories；結核菌素H37Ra購自DIFCO公司；百日咳毒素購自LBL公司；RT-PCR所需Trizol試劑、All-in-One-qPCR Mix、All-in-one qPCR Primer均購自Fulengen公司；IL-17、IFN-酶聯免疫試劑盒購自Neobio公司。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備 0.9%的生理鹽水將MOG35-55稀釋至10 mg/ml，加入等體積的完全弗氏佐劑和等量的結核菌素H37Ra，使結核桿菌H37Ra的濃度為4 mg/ml，用注射器抽吸成油包水狀，制成誘導抗原乳劑。于小鼠脊柱兩旁分4點皮下注射0.1 ml乳劑，之后分別在免疫當天及48 h分兩次腹腔注射百日咳毒素0.5 ml作為免疫增強劑。

1.2.2雷帕霉素組模型制備 從EAE模型誘導的第10天開始，每日一次，給予雷帕霉素(2 mg/kg)連續腹腔注射10 d。

1.2.3數據采集 從免疫后第1天開始，采用雙盲法由2名觀察者每天稱量小鼠體質量，采用國際通用的5分評分制對小鼠進行神經功能評分。評分標準：0分：無任何癥狀；1分：尾部張力消失，可見輕度步態笨拙；2分:一側后下肢無力，被動翻身后可以恢復；3分：雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復，但給予刺激后可以挪動；4分：雙后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分：瀕死狀態或死亡。

1.2.4RT-PCR(real-time reverse transcription) 三組小鼠分別于后免疫第7天、14天、21天、30天取腦室旁腦組織標本，無菌操作，70 mg腦組織加入1 ml Trizol試劑，提取總RNA。合成cDNA，PCR 擴增建立,建立20 μl反應體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl,不同濃度的模板cDNA 2 μl,All-in-One qPCR Primer 2 μl,滅菌蒸餾水補至20 μl。反應條件：95℃10 min個循環，95℃10 s，60℃20 s，72℃15 s，40個循環。

1.2.5酶聯免疫法 EAE組小鼠分別于后免疫第7天、14天、21天、30天心臟取血，分離血清，酶聯免疫法測定IL-17、IFN-γ含量。具體方法參照試劑盒說明書。

2 結果

2.1小鼠臨床癥狀評分與體質量變化 EAE組小鼠平均發病時間為(7.7±0.67)d，21 d時達高峰。發病時食欲下降，體質量減輕，皮毛不光滑，伴有神經功能缺損癥狀，起病時尾部張力下降，身體向一側傾倒，雙側后肢無力，逐漸前肢無力，嚴重時死亡。EAE組小鼠14 d神經功能評分為(2.10±1.58)分，21 d神經功能評分為(2.93±1.43)分，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。EAE組小鼠14 d體質量(16.28±0.23)g，21 d時體質量(15.96±0.45)g,30 d 時體質量為(18.28±0.41)g。14 d組與21 d組和30 d相比，差異均有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。正常對照組與EAE組相比，在15 d、21 d、30 d，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

圖1 EAE組小鼠神經功能評分變化趨勢圖 Fig.1 Changes of neurological function scores in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) group

圖2 正常對照組、EAE組體質量變化趨勢圖Fig.2 Weight between control group and EAE group

TimeIFN-γIL-1714 d275.29±37.42227.12±17.3721 d 344.78±24.111)301.07±10.182)30 d134.99±7.99162.07±17.19t2.411.93P0.000.35

Note:1)P<0.01 vs 14 d;2)P<0.05 vs 14 d.

圖3 IFN-γ、IL-17在21 d時雷帕霉素組與EAE組相比Fig.3 Level of IFN-γ and IL-17 between EAE and rapamycin group at 21 dNote: **.P<0.01.

2.2IL-17、IFN-γ的檢測結果(表1) ELISA試劑盒檢測IL-17、IFN-γ的表達。EAE組血清中IL-17 21 d濃度明顯高于14 d和30 d濃度，差異有統計學意義(P<0.05)。IFN-γ濃度在21 d時最高，與14 d和30 d組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。雷帕霉素組21 d時的IFN-γ、IL-17與EAE組比較均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖4 EAE組Tyro3、Mer、Axl的RT-PCR結果Fig.4 Expression of Tyro3，Mer，Axl by RT-PCR in EAE groupNote: *.P<0.05,**.P<0.01, ***.P<0.001.

圖5 TAM在21 d時雷帕霉素組與EAE組比較Fig.5 Expression of TAM between the EAE and rapamycin group at 21 dNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

2.3EAE組TAM受體RT-PCR結果 Tyro3的表達較正常對照組在14 d時略有下降，21 d時升高，30 d時達到最高，較正常對照組比較差異有統計學意義(圖4A)。Mer的表達逐漸升高，在30 d時達到最高，較正常對照組比較差異有統計學意義(圖4B)。Axl的表達在14 d、21 d時均較對照組下降，在30 d時有明顯的升高，較正常對照組比較差異有統計學意義(圖4C)。

2.4雷帕霉素組RT-PCR結果 第21天時雷帕霉素組Tyro3、Axl、Mer均較同一時間點EAE組升高，兩組相比較差異有統計學意義(圖5)。

2.5相關性分析 21 d時EAE組Tyro3、Axl、Mer的mRNA水平與小鼠神經功能評分負相關(r=-0.648,P=0.013,r=-0.325,P=0.024,r=-0.381,P=0.020)。

3 討論

MS是一種細胞免疫和體液免疫共同參與導致的以腦和脊髓白質損傷為主的中樞神經系統疾病，脫髓鞘是其發病過程中關鍵的病理表現，其發病機制涉及多條細胞信號傳導通路的異常，其中主要包括激酶/信號轉導及轉錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、NF-κB、p38MAPK、IL-2/IL-2R通路等[7-9]。TAM受體在神經系統免疫調節機制中的研究尚不多見,尤其是在MS中的研究[10]。TAM受體屬于受體酪氨酸激酶亞家族之一，廣泛地表達于哺乳動物免疫、血液、生殖和神經系統的多種細胞中[11]。共同的配體是Gas6和ProS[12-15]。MS是一種脫髓鞘性自身免疫病，在Axl或Gas6小鼠飲食中添加cuprizone，神經脫髓鞘癥狀明顯加重，且恢復期凋亡細胞的清除和髓鞘再生都延遲[16]。因此，TAM受體與MS的炎性脫髓鞘密切相關。在本研究建立的EAE模型中，根據RT-PCR的結果可以看到Tyro3、Mer的表達逐漸升高，在30 d時達到最高，較正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。Axl的表達在14 d、21 d 時均較對照組下降，在30 d時有明顯的升高，差異有統計學意義(P<0.01)。EAE組21 d時神經功能癥狀最重，體質量變化明顯，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。由此可見，21 d時Tyro3、Axl、Mer的mRNA水平與小鼠神經功能呈負相關,在EAE的發病過程中發揮了重要的作用。基因敲除的Tyro3-/-Axl-/-Mer-/-小鼠(TAM小鼠)容易患有自身免疫性疾病，TAM受體可以調控天然免疫，下調促炎因子INF-ɑ介導的JAK/STAT1信號通路，從而抑制天然免疫[17]。本研究發現EAE模型小鼠被MOG35-55免疫后，Tyro3、Axl、Mer的水平均開始上調，而IL-17、IFN-γ在21 d時達到最高，之后逐漸下降，差異有統計學意義。這說明在MS的發病機制中TAM受體通過抑制天然免疫發揮了免疫保護作用,抑制了脫髓鞘的發生。

雷帕霉素(Rap)是從吸水鏈霉菌中分離出來的一種新的大環內酯類免疫抑制劑[18]。近年的研究發現它有一定的神經保護、神經營養及抗衰老作用[19]。它作為經典的自噬誘導劑，同時也是針對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)特異性的抑制劑，在EAE模型中的研究比較多見[20]。大部分研究發現雷帕霉素可抑制 AKT/niTOR/P70s6k通路激活自噬活性發揮神經保護作用[21，22]。本研究在免疫后第10天開始予以雷帕霉素治療，結果發現與EAE組比較雷帕霉素組腦室旁腦組織中Tyro3、Axl、Mer的表達水平均上調。這說明在EAE模型上予以雷帕霉素治療可以上調TAM受體的表達，尤其是Axl水平，其發揮免疫抑制作用，促進髓鞘的再生。TAM受體通過INF-α受體相互作用，激活JAK/STAT信號通路，誘導SOCS1和 SOCS3產生，抑制炎癥發展[23]。IFN-γ由Th1細胞分泌，IL-17則是由Th17細胞分泌的炎癥因子[24，25]。Th1 細胞通過分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-12 等細胞因子引起髓鞘的破壞[26，27]。Th17細胞功能亢進，分泌的炎癥因子IL-17、IL-23、IL-21等起到促進炎癥反應的作用[28]。通過比較可見雷帕霉素也可以抑制Th1細胞的活化以及Th17細胞功能的亢進，減輕髓鞘的破壞，更好地發揮免疫抑制作用，調控MS發病機制中的天然免疫，明顯促進EAE小鼠神經功能癥狀的恢復。

本研究發現TAM受體的上調可以在EAE小鼠腦組織的炎癥反應中發揮免疫抑制作用，促進髓鞘修復。同時雷帕霉素可以進一步通過促進Tyro3、Axl、Mer的表達，抑制EAE小鼠的炎性脫髓鞘，發揮神經保護作用。本研究進一步探討了雷帕霉素的新的作用機制，為其在MS免疫調節治療提供研究基礎。