腎元顆粒對db/db糖尿病腎病小鼠血管鈣化的改善作用及其機制

王 嵐，朱國雙，孫 龍，王小琴

(1. 湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430061；2. 湖北省中醫院腎內科 湖北省中醫藥研究院腎病研究所，湖北 武漢 430061)

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy，DN) 作為糖尿病(diabetic mellitus，DM)最嚴重的微血管并發癥之一[1]，在發達國家是終末期腎臟病(end stage renal disease, ESRD)患者的首要病因[2]。在中國，DN發病率逐年升高，而在DN中普遍存在的心血管并發癥與血管鈣化密切相關，是影響患者生存質量和生存時間的獨立危險因素[3]。關注并加強DN血管鈣化發病機制的研究具有重要臨床意義。鈣磷代謝異常是導致DN患者血管鈣化的重要環節，其發生與腎臟產生的克老素(Klotho)蛋白和骨骼分泌的成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor 23，FGF23)表達異常有關聯[4-5]。由于FGF23主要作用于腎臟，因此伴隨著腎臟受損，腎臟中Klotho蛋白隨之減少，導致體內鈣磷代謝出現紊亂，最終誘發血管鈣化的形成。腎元顆粒是由黃芪、淫羊藿和酒制大黃組成，方中以黃芪為君，補先天元氣以助腎填精，健后天脾氣以助運化水谷，推動血液運行作用。本課題組前期研究[6-7]證實：腎元顆粒(批號：20190602) 可以上調腎臟組織中Klotho蛋白表達，降低體內異常升高的FGF23水平，還可以調控體內鈣磷代謝。本研究的側重點從前期的鈣磷代謝延伸到血管鈣化，通過建立db/db DN小鼠血管鈣化模型，探討給予腎元顆粒藥物后，小鼠胸主動脈病理形態改變以及血清中FGF23水平變化, 并觀察腎臟和胸主動脈組織中Klotho、Pit1、Runx2和SM22α表達水平，為腎元顆粒治療DN胸主動脈鈣化提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級7周齡db/db DM小鼠20只，動物使用許可證號：SCXK(蘇)2015-0001，動物合格證號：32002100006025。同系背景野生型(wild type，WT)小鼠10只，動物生產許可證號：SCXK(蘇)-2015-0001，動物合格證號：32002100006026，均購自南京大學南京生物醫藥研究院。

1.2 藥品、主要試劑和儀器腎元顆粒(湖北省中醫院，批號：20190602)；FGF23 ELISA試劑盒(武漢貝茵萊生物有限公司，批號：201812)，兔抗小鼠Klotho(北京博奧森生物技術有限公司，批號：AH08097988)，兔抗小鼠SM22α (英國Abcam公司，批號：ab14106)，兔抗小鼠Runx2(英國Abcam公司，批號：ab23981)，內參β-actin(上海優寧維生物科技股份有限公司，批號：SV25)，兔抗小鼠Pit-1(美國Novus，批號：NBP1-32252)，山羊抗兔二抗HRP、ABScript Ⅱ cDNA第一鏈合成試劑盒和2×通用型SYBR Green快速qPCR預混液(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：9300014001、9619580410和9619030716)，熒光驢抗兔二抗CY3(武漢賽維爾生物技術有限公司，批號：GB22403)，總RNA提取試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司，批號：HP192402)。Clear First-1000核酸蛋白儀(上海閃譜生物科技有限公司)，MA-6000實時熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(加拿大Molarray生物科技公司)，TGL-16M型高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機設備有限公司)，Supply Mini-Protean3電泳儀、Trans Blor Turho Mini Trans-Blot轉移系統和Universal Hood 11CCD成像系統(美國Bio-Rad公司)，BX43+DP2b Olympus光學顯微鏡、照相系統和Fluoview FV500型激光共聚焦掃描顯微鏡(日本Olympus公司)，EG1150H型自動生物組織包埋機和RM2255型切片機(德國Leica公司)。

1.3 動物分組和給藥實驗開始前，db/db和WT小鼠于湖北中醫藥大學SPF級屏障環境動物房適應性喂養1周，飼養溫度為(23±2)℃，濕度為44%～65%，日照和夜照比為12 h∶12 h。適應性喂養1周后，將20只db/db小鼠隨機分為模型組和腎元顆粒組，每組10只，另取WT小鼠10只作為空白組，以連續3次空腹靜脈血糖≥16.7 mmol·L-1、尿量大于空白組150%且持續出現白蛋白尿判定為DN造模成功[8]，造模成功后，模型組和腎元顆粒組小鼠給予高磷飼料(含磷1.2%和鈣1.6%)，空白組小鼠給予普通飼料。腎元顆粒組小鼠給予腎元顆?；鞈乙?6.0 g·kg-1，按臨床用藥劑量經動物與人體間的等效劑量換算公式所得[9]，并且在前期動物實驗[7]中已得到驗證)，給藥劑量均為20 mL·kg-1，模型組和空白組小鼠給予等量雙蒸水，連續灌胃12周。

1.4 樣本采集和處理在給藥第12周后，將3組小鼠摘眼球取血，并以4 200 r·min-1離心15 min，取上層血清，保存于-80℃超低溫冰箱中，待用。取血完成后，脫頸處死小鼠，暴露腹腔，摘下左側腎臟組織，置于-80℃超低溫冰箱中保存，備用；移除腹腔組織，沿小鼠脊柱小心快速取下胸主動脈，并剪切取1/3置于4%多聚甲醛中固定保存，用于組織病理形態表現觀察和免疫組織化學及免疫熒光檢測，將剩余部分胸主動脈置于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清FGF23水平取各組小鼠血清，按FGF23試劑盒說明書操作。取出FGF23試劑盒，室溫放置20 min。對標準品、生物抗原和親和素-HRP進行稀釋，配置洗滌液。于標準孔及樣品孔中分別加入稀釋好的標準品和樣品各100 μL，然后分別加入100 μL抗原工作液。洗滌液重復洗板5次，加入親和素-HRP，37℃培養箱中孵育30 min。再次洗滌液洗滌5次，拍干，加入顯色液90 μL，37℃顯色10 min，再加入終止液50 μL?？瞻卓字胁患訕?，僅加入顯色劑和終止液。將加樣后的96孔板放入酶標儀中，于450 nm波長處依次讀取各孔的吸光度(A)值。以標準品的濃度為橫坐標，A值為縱坐標描繪標準曲線，求出回歸方程，根據各樣品A值計算各樣品濃度。

1.6 HE染色和von Kossa染色檢測各組小鼠胸主動脈組織病理形態表現取各組小鼠胸主動脈，行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，60℃烤箱中烘烤0.5 h，脫蠟、乙醇水化處理，蘇木素浸泡5 min，乙醇分化，自來水沖洗，1%伊紅浸泡1 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察拍照。將包埋好的小鼠胸主動脈石蠟切片脫蠟、脫水。2%硝酸銀液浸泡，紫外線下照射25 min，5%硫代硫酸鈉液中浸泡1 min，伊紅溶液復染。再次酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下拍照，觀察各組小鼠胸主動脈組織病理形態表現。

1.7 Real-time PCR法檢測各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α mRNA表達水平每組取5只小鼠腎臟和胸主動脈組織(質量均為50 mg)，根據TRIzol試劑盒說明書進行總RNA提取，并采用核酸蛋白分析儀測定各待測樣本RNA純度。采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，得到擴增前cDNA。以1 μL cDNA為模板按擴增流程進行擴增分析。采用2-△△CT法進行定量分析，每組實驗至少重復3次。本實驗所需引物均由武漢谷歌生物科技有限公司合成提供，選取小鼠β-actin作為內參。本研究所用引物序列見表1。

1.8 Western blotting法檢測各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α蛋白表達水平每組取5只小鼠腎臟和胸主動脈組織，質量均為50 mg，加入蛋白裂解液，放入組織勻漿機中勻漿，離心，吸取上清，進行蛋白定量分裝，并采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，將電泳分離后的蛋白轉移至NC膜上，脫脂奶粉封閉，分別加入Klotho、Runx2、Pit-1和SM22α一抗稀釋液(1∶500)，4℃搖床過夜，TBST清洗，每次10 min，洗滌3次，二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜，滴加A、B顯色液，凝膠電泳圖像分析儀顯影成像，采用Image J軟件定量分析，以小鼠β-actin作為內參蛋白。計算各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動脈組織中Runx2、Pit-1及SM22α蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

表1 PCR引物序列

1.9 免疫組織化學法檢測各組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平取各組小鼠胸主動脈組織石蠟塊切片，厚度約為4 μm，常規脫蠟，EDTA高壓鍋煮沸抗原修復10 min，3%H2O2消除內源性過氧化物酶20 min，山羊血清37℃封閉45 min后，甩掉封閉液，滴加一抗Pit-1，放入4℃過夜；滴加二抗工作液，37℃恒溫箱孵育30 min；再滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內孵育30 min，DAB顯色45 s，顯微鏡下觀察。隨機選取5個高倍視野，檢測免疫組織化學A值。Pit-1蛋白表達水平=A值/組織面積。

1.10 免疫熒光法檢測各組小鼠胸主動脈組織中SM22α和Runx2蛋白表達水平取各組小鼠胸主動脈組織石蠟塊切片，厚度約為4 μm，2%雙氧水浸泡10 min，TBST漂洗10次，0.3%Triton X-100破膜，3%雙氧水滅活，血清封閉，加入一抗Runx2和SM22α，4℃過夜，加入熒光二抗CY3，避光孵育1 h，DA磷封片，激光共聚焦鏡下拍照，計算胸主動脈組織中Runx2和SM22α免疫熒光A值。SM22α和Runx2蛋白表達水平=A值/組織面積。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清FGF23水平給藥12周后,與空白組比較，模型組小鼠血清FGF23水平升高(P<0.01)；給藥12周后，與模型組比較，腎元顆粒組小鼠血清FGF23水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 給藥12周后各組小鼠血清FGF23水平

GroupFGF23 Blank271.27±35.27Model386.84±41.89*Shenyuan Granule334.23±24.41△

*P<0.01vsblank group；△P<0.05vsmodel group.

2.2 各組小鼠血管病理形態表現空白組小鼠血管內膜平整，中膜細胞排列整齊，中膜彈性纖維和膠原纖維未出現斷裂，無鈣鹽沉積；與空白組比較，模型組小鼠血管內膜不平整，中膜細胞核排列紊亂，彈性纖維斷裂，同時伴有明顯的血管鈣化灶；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠血管內膜稍不平整，中膜彈性纖維未出現明顯斷裂，細胞核排列較不齊整，中膜鈣化灶較模型組少。見圖1(插頁一)和圖2(插頁一)。

2.3 各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α mRNA表達水平與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，胸主動脈組織中Runx2和Pit-1 mRNA表達水平均明顯升高(P<0.01)，SM22α mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，腎元顆粒組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)，胸主動脈組織中Runx2和Pit-1 mRNA表達水平降低(P<0.05)，SM22α mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠腎臟組織中Klotho mRNA和胸主動脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α mRNA表達水平

GroupKlothoPit-1SM22αRunx2Blank2.46±0.370.90±0.280.98±0.151.01±0.11Model1.06±0.22*2.61±0.40*0.38±0.06*1.95±0.21*Shenyuan Granule1.49±0.33△1.77±0.47△0.54±0.07△△1.72±0.16△

*P<0.01vsblank group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

2.4 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達水平與空白組比較，模型組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，胸主動脈組織中Pit-1和Runx2蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，SM22α蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；給藥12周后，與模型組比較，腎元顆粒組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白表達水平升高(P<0.05)，胸主動脈組織中Pit-1和Runx2蛋白表達水平降低(P<0.01)，SM22α蛋白表達水平升高(P<0.01)。見圖3和表4。

2.5 免疫組織化學法檢測各組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖4(插頁一)和圖5。

2.6 免疫熒光法檢測各組小鼠胸主動脈組織中Runx2和SM22α蛋白表達水平與空白組比較，模型組小鼠胸主動脈組織中Runx2蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，SM22α 蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，腎元顆粒組小鼠胸主動脈組織中Runx2蛋白表達水平降低(P<0.01)，SM22α 蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)。各組小鼠胸主動脈組織中Runx2蛋白表達見圖6(插頁一)和圖7，SM22α蛋白表達見圖8(插頁一)和圖9。

Lane 1：Blank group；Lane 2：Model group；Lane 3：Shenyuan Granule group.

圖3 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of expressions of Klotho protein in kidney tissue and Pit-1, Runx2, SM22α proteins in thoracic aorta tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠腎臟組織中Klotho蛋白和胸主動脈組織中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表達水平

GroupKlotho protein Pit-1proteinRunx2proteinSM22αproteinBlank0.75±0.080.12±0.010.03±0.010.73±0.09Model0.17±0.02*0.72±0.051*0.72±0.03*0.03±0.01*Shenyuan Granule0.47±0.06△0.64±0.01△△0.60±0.03△0.40±0.03△△

*P<0.01vsblank group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

A：Blank group；B：Model group；C：Shenyuan Granule group.*P<0.05vsblank group;△P<0.01vsmodel group.

圖5 免疫組織化學法檢測各組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平

Fig.5 Expression levels of Pit-1 protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

*P<0.05 vs blank group; △P<0.01 vs model group.

Fig.7 Expression levels of Runx2 protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

3 討 論

*P<0.05 vs blank group; △P<0.01 vs model group.

Fig.9 Expression levels of SM22α protein in thoracic aorta tissue of mice in various groups

DM發生的基本機制為陰虛為本，燥熱為標。隨著病程進展，累及于腎，發為DN。此時，腎精虧虛，腎氣不足，脾運不健，無力推動血液運行，則易脈絡瘀阻，表現為鈣和磷在血管壁異位沉積誘發血管鈣化。針對DN患者血管鈣化腎精虧虛、脾運無力、脈絡瘀阻的病機，治以健脾補腎，活血化濁之法。 腎元顆粒(原名腎安顆粒)是湖北中醫藥大學第一臨床學院用于治療多種慢性腎臟病的制劑(批號：鄂藥制字 Z20070209), 由黃芪、淫羊藿和酒制大黃組成。方中以黃芪為君，補先天元氣以助腎填精，健后天脾氣以助運化水谷，推動血液運行；淫羊藿為臣，補腎化氣，強筋健骨；佐以酒制大黃，取其行瘀破積，蕩滌濁毒之功。三藥共奏健脾補腎，活血化濁之效。本課題組在前期研究[10]中將藥物的有效作用部位大黃蒽醌、淫羊藿苷和黃芪苷分離提取后，加工成無糖顆粒。隨機對照臨床研究[11-12]顯示：腎元顆粒在保護腎功能、改善鈣磷代謝和緩解臨床癥狀方面明顯優于對照組藥物愛西特。對腎性骨病大鼠模型研究顯示：模型組大鼠腎組織中 Klotho蛋白、股骨組織中骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)表達水平較空白組明顯降低，并伴有血鈣水平降低，血磷水平升高。采用腎元顆粒干預后，模型組大鼠腎臟組織中 Klotho蛋白表達水平升高，股骨組織中OPG和BMP-7 表達水平升高，說明腎元顆粒通過調控 Klotho基因表達及骨代謝，從而實現對鈣和磷的調節[13-15]。

血管鈣化是DM最常見的血管病變之一[16]。血管鈣化并非鈣磷被動沉積的過程，其由活躍細胞介導，涉及血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)凋亡和囊泡釋放機制，可使VSMC從收縮型分化為成骨細胞，并使血管中高效的骨誘導因子和成骨細胞形成的早期標志物表達增加。Pit-1作為Ⅲ型鈉磷協同轉運子，主要表達于腎臟、腦、心臟、肺部、肝臟、平滑肌細胞和成骨細胞中[17-18]。在體外，沉默VSMC中Pit-1表達可明顯抑制高磷誘導的VSMC鈣化發生[19]， 表明血管中Pit-1高表達是血管發生鈣化的主要原因之一。在體內，腎臟表達的Klotho蛋白與FGF23結合非常緊密，并與其受體形成三元復合物，參與調節體內活性維生素D的合成和降解，促進尿磷的排泄，增加鈣離子(Ca2+)吸收，調控體內鈣磷代謝[20]。當腎臟受損時，不僅伴隨著Klotho蛋白表達減少，而且還出現血清中FGF23水平明顯升高，這時血管鈣化發生率隨著Klotho蛋白表達減少而急劇增加[21-22]。研究[23]顯示:Klotho基因敲除小鼠中，小鼠不僅伴隨著明顯早衰和臟腑功能減退等表型，同時還伴有血管鈣化表型出現。腹腔注射Klotho蛋白后,小鼠血管鈣化表型可得到明顯的改善[24],表明在血管鈣化的機制中，Klotho具有明顯的抑制作用。研究[25]顯示:這種鈣化表型的出現與體內急劇升高的FGF23水平相關。當腎臟受損時，體內水平升高的FGF23在失去Klotho蛋白的調控后，形成脫靶效應。有研究[26]顯示:向VSMC中加入外源性FGF23可明顯激活Pit-1表達，介導血管平滑肌細胞對磷的吸收，使得血管上磷離子內流增加，導致VSMC向成骨樣細胞轉化[27-28]，并形成血管鈣化。

本研究通過高磷飲食，構建的小鼠體內高磷環境以加速db/db小鼠胸主動脈血管鈣化發生。胸主動脈的von Kossa染色結果顯示：模型組小鼠在高磷飲食條件下，小鼠胸主動脈出現了鈣鹽沉積；血清ELISA檢測結果顯示：模型組小鼠血清FGF23水平明顯升高； Real-time PCR、Western blotting、免疫組織化學和免疫熒光法檢測結果顯示：模型組小鼠胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平明顯升高，而該結果與YAMAZAKI等[26]的研究結果相符。在本研究中隨著FGF23/Pit-1信號通路的激活，模型組小鼠血管中高效的骨誘導因子和成骨細胞形成的早期標志蛋白Runx2表達水平明顯升高，且血管平滑肌標記物SM22α蛋白表達水平明顯降低，表明通過高磷飲食誘導的高磷環境可以誘導db/db小鼠出現胸主動脈鈣化，而這種鈣化的出現與FGF23/Pit-1信號通路的激活有關。經過腎元顆粒干預后，小鼠血清FGF23水平降低，腎臟組織中Klotho蛋白表達水平明顯升高，胸主動脈組織中Pit-1蛋白表達水平降低，成骨細胞形成的早期標志蛋白Runx2表達水平亦減少，血管平滑肌標記物SM22α表達水平升高表明腎元顆粒對小鼠胸主動脈鈣化具有明顯的改善作用，其作用機制可能是腎元顆粒通過增加腎臟組織中Klotho蛋白表達水平，抑制血清FGF23水平，降低胸主動脈中被激活的Pit-1蛋白的表達水平，最終達到改善胸主動脈血管鈣化的作用。

綜上所述，通過高磷飲食可誘導db/db小鼠胸主動脈發生血管鈣化，而其作用機制可能與FGF23/Pit-1信號通路的激活有關。腎元顆?？赏ㄟ^增加腎臟組織中Klotho蛋白的表達，并抑制FGF23/Pit-1信號通路，并抑制VSMC向成骨樣細胞的表型轉化，抑制進而減少鈣化的發生而發揮對血管的保護作用。