RHBDF2基因過表達慢病毒載體的構建和穩定表達RHBDF2細胞系的建立

陳少鳳，李勝男，鄧 福，朱佩儀，李 友

(1.廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室，廣東 湛江 524002；2.廣東醫科大學附屬醫院神經病學研究所，廣東 湛江 524002)

非活性菱形蛋白酶(inactive rhomboids，iRhoms)最早在果蠅中被發現[1]，是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號傳導途徑的主要激活因子[2]。哺乳動物主要表達2種菱形蛋白酶[3]：iRhom1和iRhom2。iRhom2也稱為RHBDF2，是菱形絲氨酸蛋白酶家族成員之一，但缺乏蛋白水解活性，其編碼基因定位于1號染色體長臂(17q25.1)，編碼856個氨基酸。

研究[4]顯示：RHBDF2能控制腫瘤壞死因子α轉化酶(tumor necrosis factor-α-converting enzyme，TACE)激活和運輸，RHBDF2可以結合TACE并促進其從內質網轉運到高爾基體，然后轉運到細胞表面。TACE亦稱為去整合素-金屬蛋白酶17(ADAM metallopeptidase domain 17，ADAM17)，是一種多結構域跨膜蛋白分子，能將無活性TNF-α前體(pro-TNF-α)轉化成可溶、有活性的可溶性TNF-α(sTNF-α)[5]。TACE底物分子眾多，可通過活化TNF-α[6]、腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)、白細胞介素6R(interleukin-6R，IL-6R)、白細胞介素1R(interleukin-1R，IL-1R)、L-選擇素(L-selectin)、C-X3-C基序趨化因子配體1(C-X3-C motif chemokine ligand 1，CX3CL1)[7]、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM1)、血管內皮細胞鈣黏蛋白(Cadherin in vascular endothelial cells，VE-Cadherin)、內皮細胞黏附分子1(endothelial cell adhesion molecule 1，ECAM-1)、血小板內皮細胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecules，PECAM)和連接黏附分子A(junction adhesion molecule A，JAM-A)[8]等廣泛表達于脈管系統細胞表面的底物蛋白分子而參與動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)這一血管炎癥反應。在載脂蛋白E缺乏(apolipoprotein E deficiency，ApoE-/-)的AS模型大鼠中可見ADAM17高表達于AS斑塊表面，且血液中sTNF-α和可溶性TNFR(sTNFR)水平隨AS的進展而升高[9]。急性心肌梗死患者的冠狀AS斑塊表面可見TACE表達水平升高，且TACE表達水平與血液游離TNF-α水平呈正相關關系；自頸動脈和主動脈斑塊表面分離的巨噬細胞表面亦可見TACE呈高水平表達[10]。

研究[11]表明：RHBDF2在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)刺激的巨噬細胞中表達明顯升高，抑制RHBDF2表達可減輕ox-LDL誘導的巨噬細胞炎癥反應。由此本文作者推測：RHBDF2也可能通過調節TACE轉運，促進TNF-α釋放而參與AS的進程，因而可能成為預防和治療AS的潛在靶點。本研究通過構建RHBDF2基因的過表達載體并包裝成慢病毒，感染人臍靜脈細胞融合細胞(EA.hy926細胞)，建立穩定表達RHBDF2的細胞，為進一步研究RHBDF2在AS中的功能作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒、主要試劑和儀器人胚胎腎HEK293T細胞購于中國科學院上海細胞所，EA.hy926細胞購自美國ATCC公司。慢病毒載體質粒pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro購自廣州賽業公司，輔助包裝質粒psPAX2(pHelper1)和pMD2G(pHelper2)購自上海復百澳公司，其中pLV[Exp]-EGFP能表達綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)。大腸桿菌DH5α感受態(北京索萊寶公司)，NcoⅠ酶和T4 DNA連接酶(美國NEB公司)，10×Annealing Buffer(美國OriGene公司)，質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒(北京TIANGEN公司)。DMEM高糖培養基、Opti-MEM培養基、0.05%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、反轉錄試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)，Lipofectamine 2000和TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，2×增強型實時熒光定量PCR預混液(中國GenStar公司)。RHBDF2和GAPDH的PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，Anti-iRhom2抗體(英國Biorbyt公司)，Anti-β-actin抗體(美國Sigma公司)，鼠二抗和兔二抗(美國CST公司)。熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，倒置光學顯微鏡和倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，化學發光檢測儀(美國Azure公司)。

1.2 細胞培養HEK293T細胞和EA.hy926細胞常規培養于DMEM完全培養基(含10% FBS和1% 青霉素-鏈霉素)，置于37℃、含5% CO2培養箱中培養，待細胞密度大于90%且生長狀態良好時用0.05%胰蛋白酶消化傳代，每隔2～3 d傳代1次。

1.3 引物設計和合成在NCBI上查找目的基因RHBDF2(Gene ID：217344)序列，結合慢病毒過表達載體pLV [Exp]-EGFP閱讀框克隆位點，根據引物設計原則，設計并合成1對兩端包含attB序列的引物。RHBDF2上游引物為5′-CCAGATCTATGGCCTCAGCTGACAAGAATG-3′，下游引物為5′-CCCAAGCTTTTAGTGTAGCACCTGGTCTAG-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2重組質粒的構建和鑒定將合成1對兩端包含attB序列的目的基因引物通過PCR擴增后得到DNA片段，PCR反應體系(20 μL)：DNA模板1 μL，上游引物(5 μmol·L-1)2 μL，下游引物(5 μmol·L-1) 2 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，10×緩沖液2 μL，Taq酶0.15 μL，加入ddH2O至20 μL。PCR反應程序：95℃變性3 min；35個循環(95℃、1 min，55℃、1 min，72℃、1 min)；72℃繼續延伸5 min，4℃保存。擴增得到的DNA片段(含attB位點)和包含attP位點的供載體(pDONR Vector)在BP酶的作用下，發生BP反應得到入門克隆(Entry Clone)，通過菌落PCR，測序篩選出正確的Entry Clone；然后將測序正確的Entry Clone質粒DNA(含attL位點)與目的載體(含attR位點)進行LR重組反應，同時將啟動子EF1A和目標基因RHBDF2連接入受體載體(pLV[Exp]-EGFP)，得到插入了啟動子和目標序列的表達克隆，即重組慢病毒質粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2；酶切產物經回收純化后在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過夜；將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取重組陽性克隆，行PCR和酶切鑒定。將鑒定成功的陽性克隆于37℃恒溫搖床培養過夜，吸取部分菌液采用50%甘油保菌，剩余菌液抽提質粒用于后續實驗。

1.5 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒包裝和病毒滴度測定選取生長狀態良好且匯合度達90%以上HEK293T細胞，采用胰酶消化后重懸細胞液，將細胞接種于10 cm培養皿中，于37℃、5% CO2培養箱中培養至細胞匯合度達60%～70%時開始轉染。慢病毒包裝系統中3種質粒DNA溶液的配置：10 μg慢病毒重組質粒pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2、輔助質粒psPAX2和pMD2G各5 μg；另取1.5 mL Opti-MEM 培養基與50 μL Lipofectamine 2000轉染試劑，輕柔混合均勻，室溫孵育20 min以形成轉染復合物；然后將上述復合物緩慢滴加到細胞培養皿中，混勻后置于37℃細胞培養箱中繼續培養，4～6 h后，將轉染體系更換為完全培養基。轉染48 h后取出實驗組pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2和對照組pLV[Exp]-EGFP細胞，在倒置熒光微鏡下觀察2組細胞中GFP的表達情況并計算感染率。感染率=表達GFP細胞數/總細胞數×100%，感染率大于90%即為轉染成功，判定轉染成功后，收集病毒上清液，4℃、3 000 r·min-1離心5 min，上清液采用0.45 μm濾器過濾，將過濾后的上清于4℃、25 000 r·min-1離心2 h，以500 μL DMEM完全培養基重懸病毒沉淀并于4℃冰箱溶解過夜，部分用于滴度測定，其余分裝至1.5 mL離心管保存于-80℃冰箱備用。采用倍數稀釋法測定病毒滴度，取對數生長期的HEK293T細胞按照每孔1×104個接種于96孔板，體積為100 μL。培養24 h后加入100 μL 不同濃度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8)病毒稀釋液，準備8個無菌1.5 mL離心管，在每個管中加入90 μL含2% FBS的DMEM培養基，取10 μL待測病毒原液加入到第1個離心管中，混勻后，從中取10 μL加入到第2個管中，依次從前一個離心管中取10 μL加入后一個離心管中，直到最后一個管。在96孔板中選取所需細胞孔，棄去90 μL舊培養基，加入90 μL用培養基稀釋好的病毒液，于37℃細胞培養箱中繼續培養。24 h后更換為新的DMEM完全培養基100 μL，48～72 h后觀察GFP表達情況。正常情況下熒光細胞數隨稀釋倍數的增加而減少，病毒滴度(TU·mL-1)=綠色熒光細胞數/相應的慢病毒原液加入量。

1.6 篩選和建立穩定過表達RHBDF2的EA.hy926細胞采用病毒原液感染EA.hy926細胞，于感染前1 d，選取生長狀態良好的EA.hy926細胞，按照每孔2×105個細胞接種于24孔板，待細胞融合度達50%～70%時開始實驗。慢病毒感染實驗分為2組：實驗組加入200 μL pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒進行感染，對照組加入200 μL pLV[Exp]-EGFP-control慢病毒進行感染。次日去除含病毒的培養基，更換為DMEM完全培養基。感染48 h后換用含3 mg·L-1嘌呤霉素的新鮮培養基進行目的細胞陽性篩選。感染72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，第4天以后隔天換用新鮮的含嘌呤霉素培養基替換含大量死細胞的培養基。待抗性細胞長滿后將細胞轉移至6孔板，繼續用含嘌呤霉素的培養基培養細胞至密度達80%時，收集部分細胞，以備后續實驗。

1.7 熒光定量PCR(qPCR)法檢測EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平分別收集對照組和實驗組EA.hy926細胞，采用TRIzol試劑提取總RNA，以該RNA為模板按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄為互補的cDNA。反轉錄總體系(20 μL)：在0.2 mL PCR管中加入1 μg RNA、5×Reaction Buffer 4 μL、10×dNTP Mixture 2 μL、RNase抑制劑1 μL、M-MLV逆轉錄酶1 μL、Oligo dT逆轉錄引物1 μL，加入不含RNase的ddH2O至20 μL混勻，后離心，42℃、60 min，70℃、5 min，所得cDNA用于qPCR擴增，以GAPDH為內參照，分別檢測對照組和實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA相對表達水平。qPCR反應中RHBDF2和GAPDH的引物序列：RHBDF2-F 5′-TGCTGCTATGACCCCGT-TTT-3′，RHBDF2-R 5′-CTCACGAGTCCACGGACAAA-3′，GAPDH-F 5′-AGGTCAATGAAGGGGTCGTT-3′，GAPDH-R 5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′。qPCR反應體系(10 μL)：cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，2×SYBR Green熒光染料5 μL，無菌蒸餾水補足至10 μL。使用兩步法qPCR擴增程序，反應條件：95℃變性10 min，95℃、15 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算RHBDF2 mRNA表達水平，ΔCT值=目的基因Ct值-內參Ct值，ΔΔCT=實驗組ΔCT值-對照組ΔCT值。

1.8 Western blotting法檢測EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平分別收集對照組和實驗組EA.hy926細胞制備蛋白樣品，按照BCA蛋白質定量試劑盒操作說明檢測并使蛋白樣品濃度一致后加入5×Loading buffer使蛋白變性。取30 μg蛋白樣品采用SDS-PAGE進行檢測，電泳條件為50 V恒壓30 min，100 V恒壓90 min。待電泳結束后取出凝膠，采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，轉膜條件為200 mA恒流100 min。轉膜結束后采用含5% 脫脂奶粉的T-BST液室溫孵育1 h以封閉膜上的非特異結合，封閉完成后采用T-BST洗膜3次，每次10 min。將膜剪切好后分別加入一抗，置于4 C搖床孵育過夜。次日回收一抗，T-BST洗膜3次，加入與一抗對應種屬的二抗，室溫下孵育1 h后，T-BST洗膜3次，利用ECL化學發光劑顯影，并采用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析，計算RHBDF2蛋白表達水平。RHBDF2蛋白表達水平=RHBDF2條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結 果

2.1 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2過表達慢病毒載體成功構建通過Gateway技術將目的基因RHBDF2克隆到其受體載體pLV[Exp]-EGFP上，得到pLV[Exp]-EGFP- RHBDF2慢病毒載體(圖1 A)，該載體上存在NcoⅠ酶的位點(圖1B)，采用NcoⅠ酶進行切割后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析產物片段長度，酶切后電泳結果與預期結果一致(圖1C)，表明目的基因片段已成功插入到陽性克隆中。測序結果與NCBI數據庫RHBDF2序列一致(圖2，見插頁一)，pLV[Exp]-EGFP- RHBDF2慢病毒載體構建成功。

A：Diagram of empty vector pLV[Exp]-EGFP;B:Diagram of recombinant lentiviral vector pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2; C:Electrophoregram of enzyme identification of pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2 lentiviral vector(M:Marker;Lane 1:Empty vector;Lane 2:Recobinant vector).

圖1 pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒載體的構建和酶切鑒定

Fig.1 Construction of pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2 lentiviral vector and enzyme digestion identification

2.2 2組病慢病毒滴度和EA.hy926細胞中GFP表達將構建好的慢病毒表達載體與輔助質粒共轉染至HEK293T細胞中，轉染48 h后，收集慢病毒并檢測病毒滴度，對照組慢病毒滴度為1×108TU·mL-1，實驗組慢病毒滴度為3×108TU·mL-1(圖3，見插頁二)。

2.3 2組EA.hy926細胞中GFP表達感染72 h后熒光顯微鏡下顯示對照組和實驗組EA.hy926細胞中均表達GFP(圖4，見插頁二)，感染率達95%以上，表明成功建立并篩選出pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒穩轉細胞系。

2.4 2組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平與對照組(1.025±0.072)比較，實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2 mRNA表達水平(3.024±0.171)升高約2倍，組間比較差異有統計學意義(t=10.76，P<0.01)。

2.5 2組EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平實驗組EA.hy926細胞中RHBDF2蛋白表達水平(2.081±0.069)較對照組(1.025±0.153)升高，組間比較差異有統計學意義(t=5.17，P=0.014)。見圖5。

Lane 1:Control group;Lane 2:Experiment group.

Fig.5 Electrophoregram of expressions of RHBDF2 protein in EA.hy926 cells in two groups

3 討 論

AS是一種引起心腦血管疾病的慢性炎癥性疾病，為世界范圍內的主要致死原因。iRhoms是一種保守的蛋白亞家族，與菱形膜內絲氨酸蛋白酶有關聯，其具有獨特的結構域，且無催化活性基序，這表明盡管缺乏蛋白酶活性，但這些蛋白仍具有重要的生物學作用[12]。據報道菱形蛋白具有多種功能：比如iRhom2可以控制ADAM17的激活，在分泌途徑中TACE的運輸需要其與iRhom2結合以促進自身的轉運與活化[13]；當機體遭受病原體入侵時，巨噬細胞會分泌大量TNF-α，這時iRhom2與TACE相互作用，促進TNF-α從TACE上脫落，使活化的TNF-α從內質網排出[14]；如果缺少iRhom2蛋白，TACE則不能離開內質網，因而會明顯降低TNF-α釋放量，削弱免疫保護炎癥反應的強度[15]。此外，iRhom2的磷酸化可調節TACE刺激的蛋白水解脫落，從而從細胞表面釋放TNF-α以觸發炎癥反應[16]。

ADAM17是一種膜表面金屬蛋白酶，是主要的脫落酶，負責釋放炎性細胞因子TNF-α和表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，參與多種疾病的病理生理過程。蛋白外區脫落對細胞間相互作用至關重要，因為ADAM17控制著sTNF-α和EGFR配體的生物利用度，以及許多其他膜蛋白的釋放[17]。MATTHEW[12]發現：ADAM17是對凝血酶、EGFR、溶血磷脂酸和TNF-α刺激的生理信號通路快速反應的分泌酶。細胞表面金屬蛋白酶ADAM17協調細胞與細胞之間的相互作用，在炎癥、發育、類風濕關節炎和癌癥等疾病中發揮關鍵作用[18]。ADAM17負責將促炎細胞因子TNF-α和大多數EGFR配體從膜錨定中釋放出來，從而密切控制TNF-α和EGFR信號通路。LI等[13]發現：iRhom1和iRhom2在小鼠發育過程中是ADAM17依賴性EGFR信號傳導的重要上游調節因子。iRhom2調控小膠質細胞中依賴于ADAM17的TNF-α釋放，可能導致神經炎癥、神經退行性變和睡眠障礙[19]。

目前研究[20]證實：TACE對EGFR配體雙調蛋白的胞外域脫落至關重要，iRhom2對TACE的成熟和轉運到造血細胞表面起至關重要的作用。iRhom2缺陷的小鼠無法抵御單核細胞增多性李斯特菌的感染，因而認為iRhom2是天然免疫的調節子[21]。DARSHINEE等[22]發現：缺乏iRhom2的小鼠和缺乏TNF-α的小鼠同樣獲得了對炎癥性關節炎的免疫力。進一步的機制研究[23]顯示:補體C5a和免疫復合物可以促進iRhom2和TACE依賴的TNF-α釋放，表明iRhom2和骨髓表達的TACE在炎癥性關節炎中起重要作用，iRhom2可以作為治療風濕性關節炎的靶標。iRhom2通過氧化應激損傷誘導巨噬細胞炎癥進而促進AS，CHENG等[11]發現： ox-LDL刺激引起活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，伴隨著丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的增加和巨噬細胞中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性的降低，iRhom2在ox-LDL誘導的巨噬細胞中表達明顯上調，而抑制iRhom2表達明顯降低了ROS的產生和MDA以及氮氧化合物(nitrogen oxide，NOX)水平，同時上調了GSH-px活性，并促進了核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶 1(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO1)通路的開放，表明抑制iRhom2表達可以減輕氧化應激誘導的細胞損傷，緩解AS的進展，因此iRhom2很可能成為預防和治療慢性炎癥引起AS的潛在靶標。

綜上所述，本研究成功構建pLV[Exp]-EGFP-RHBDF2慢病毒載體，并包裝成慢病毒感染EA.hy926細胞，建立了穩定上調RHBDF2表達的細胞系。經qPCR法和Western blotting檢測驗證了穩轉細胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表達。本研究結果為進一步深入研究iRhom2/TACE/TNF-α信號通路在AS病理進程中的機制奠定了基礎，也為研究AS的預防和治療提供了新的靶點和方向。