類彈性蛋白展示NT-proBNP雙抗原表位重組蛋白的制備和純化

付 鑫, 龔福梅, 丁 寧, 朱 靜, 楊春光, 胡學軍

(大連大學醫學研究中心，遼寧 大連 116622)

人體血漿中N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)是檢測無癥狀心衰和早期心衰的高靈敏性重要指標，對早期發現和治療心衰患者、有效降低心衰患者的發病率及病死率具有重大意義[1- 2]。另外，NT-proBNP還可作為診斷無癥狀晚期慢性腎臟疾病[3]和慢性阻塞性肺病[4]的獨立檢測指標，具有廣泛的臨床應用和研究價值[5]。目前市場上已經有多家商品化的NT-proBNP免疫檢測試劑[6-7]，其校準品來源廣泛，包括人工合成、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)、酵母和哺乳動物細胞表達的重組蛋白。上述幾種來源的重組蛋白各有優勢，但純化重組蛋白大多數采用層析方法，且部分重組蛋白還不能直接用于檢測，需增加去除融合標簽這一步驟，生產方法繁瑣且成本較高，成本可達0.1 mg/1 000 美元，因此成為制約其發展的主要因素。

類彈性蛋白(elastic-like polypeptide, ELP)是近十幾年開發的一種融合標簽，可通過可逆相變循環(inverse transition cycling, ITC)方法更簡單、更經濟地純化蛋白[8]。ELP主要由五肽重復序列單元(VPGXG)n串聯組成，其中客座殘基X可以是除脯氨酸以外的任一種氨基酸，n代表ELP鏈中五肽重復次數[9-10]。外源蛋白和ELP融合后可同樣保留ELP可逆相變的性質，利用溫度誘導的多次ITC達到分離純化蛋白的目的[11-12]。該方法操作簡單、成本低且回收率高，適用于工業規模生產，純化蛋白效率明顯優于色譜等傳統蛋白純化方法，與層析法效果相近[13]。

本研究采用本實驗室自行設計的客座殘基為異亮氨酸的低相變溫度(transition temperature,Tt)ELP蛋白[14]首次進行展示NT-proBNP雙表位研究，在E.coli中高效表達ELP展示NT-proBNP的第13～20位和第63～71位氨基酸殘基表位的重組蛋白，并通過溫度誘導ITC方法，快速分離純化具有NT-proBNP雙表位抗原性的ELP重組蛋白，為低成本、高效快速地制備出NT-proBNP檢測校準品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑E.coliBL21(DE3) 和E.coliJM109購自美國Novagen公司。基因合成全部由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。HRP標記小鼠來源抗人NT-proBNP的第13～20位氨基酸表位的單克隆抗體(13G1213-20)、小鼠來源抗人NT-proBNP的第63～71位氨基酸表位的單克隆抗體(15C463-71)購自美國HyTest公司，硫酸卡那霉素(終濃度為50 mg·L-1)、DNase(終濃度50 mg·L-1)及HRP標記的羊抗小鼠IgG抗體購自南京生工生物工程有限公司,ECL發光試劑盒購自美國Tanon公司,TMB顯色液購自美國Sigma公司。

1.2 ELP展示NT-proBNP抗原表位基因設計、合成和克隆為了獲得具有抗原抗體結合能力的NT-proBNP雙抗原表位融合蛋白，首先進行ELP展示單抗原表位研究，評估特異抗體與展示表位的結合能力，在此基礎上進一步進行展示雙表位研究。為此，分別設計了2個ELP展示NT-proBNP單個表位及1個展示雙表位的融合基因。選取編碼30～40個VPGIG串聯堿基序列，通過編碼柔鏈的氨基酸殘基序列與編碼NT-proBNP特異表位氨基酸殘基序列相連，形成融合基因；為減小2個表位的相互影響，2個表位之間也通過編碼柔鏈序列相連，基因結構和表達框見圖1。所選取NT-proBNP表位分別為編碼NT-proBNP的第13～20位氨基酸殘基ETSGLQEQ堿基序列和編碼第63～71位氨基酸殘基GHRKMVLYT堿基序列。ELP與NT-proBNP表位之間的柔鏈氨基酸殘基序列為NNNNNNNNNN，2個表位之間的柔鏈氨基酸殘基序列為NNNNNGGGGS(其中N代表天冬氨酸殘基、G代表甘氨酸殘基、S代表絲氨酸殘基)。根據E.coli密碼子偏好性，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成上述3個基因，并將融合基因克隆至pET-28a(+)的NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點上構建表達載體。3個基因分別命名為ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)。

1.3 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白表達分別將攜帶ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)基因的表達載體轉入E.coliBL21(DE3)中，37 ℃過夜培養。挑取單克隆菌株接種到含有卡那霉素(終濃度50 mg·L-1)的LB培養基中振蕩培養。次日以1∶100接種到自動誘導培養基中大量培養，經28℃誘導表達24 h后留取600 nm處吸光度(A)值為1的菌量，以誘導前菌液為陰性對照進行Western blotting鑒定。自動誘導培養基配方：5%的20×NPS 20 mL，2%的50×5052 8 mL和0.1% 的1 mol·L-1MgSO20.4 mL加入ZY配置成400 mL體系培養基。其中ZY由10 g·L-1胰蛋白胨和5 g·L-1酵母提取物加入ddH2O配制而成，pH=7.2；20×NPS由0.1 mol·L-1PO42-、0.025 mol·L-1SO42-、0.05 mol·L-1NH4+、0.1 mol·L-1Na+和0.05 mol·L-1K+加入ddH2O配制而成，pH=7.4；50×5052由0.5%甘油、0.05%葡萄糖和0.2% α-乳糖加入ddH2O配制而成。

A: Diagram of ELP-E13-20 fusion gene; B: Diagram of ELP-E63-71 fusion gene; C: Diagram of ELP-E(13-20)-(63-71) fusion gene.

1.4 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白的純化將大量培養后的菌液低溫離心收集菌體，沉淀用約25 mL無鹽PBS(0.02 mol·L-1)重懸，保存于-80℃冰箱。菌液經反復凍融2次后置于冰浴中超聲破碎(條件：80 W，破碎時間2 s，破碎間隔3 s，總時間20 min)，10 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，棄除沉淀，將上清移入新管中并加入DNase(終濃度50 mg·L-1)，冰浴20 min，10 000 r·min-1離心10 min，棄除沉淀，上清移入新管。處理后的上清進行ITC蛋白純化，向上清液中添加NaCl固體至終濃度為2 mol·L-1，37℃水浴20 min溶解，10 000 r·min-1于30 ℃離心10 min后棄上清；沉淀加入20 mL預冷無鹽PBS重懸，冰浴20 min，10 000 r·min-1于4 ℃離心10 min后棄沉淀，再將上清移入新管。此即為一輪ITC。經過4輪ITC純化處理后，得到純化的NT-proBNP特異抗原表位重組蛋白。

1.5 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白的純度鑒定和Tt測定取80 μL純化后蛋白樣品加入20 μL 5×Loading Buffer混勻，99 ℃裂解制樣并進行SDS-PAGE冰上電泳，通過凝膠顯示單一蛋白條帶鑒定重組蛋白純度。采用BCA定量法測定蛋白濃度，并采用PBS(0.02 mol·L-1)將蛋白稀釋至終濃度為10 μmol·L-1，取100 μL加入酶標版中，以1 ℃為梯度測定從23 ℃到40 ℃重組蛋白溶液于波長為350 nm處A值，每個溫度設置3個平行結果，當A(350)值為最大A值1/2時，該溫度即為ELP重組蛋白的Tt。

1.6 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白特異性分析采用ELISA法測試重組蛋白在pH 值為7.4時與相應抗體的結合特異性，以0.02 mol·L-1無鹽PBS作為空白對照孔。將純化蛋白在PBS緩沖液中以10 μmol·L-1濃度梯度稀釋，每孔設置3個平行孔，4 ℃包被于96孔板上過夜孵育。其中ELP展示單抗原表位ELP-E13-20和ELP-E63-71重組蛋白采用直接ELISA方法檢測，分別對應抗NT-proBNP的13～20及63～71表位的鼠源單克隆抗體13G1213-20和15C463-71。TMB顯色，終止反應后測定各孔A(450)值，以蛋白濃度為橫坐標，各濃度點測定A(350)值為縱坐標，應用GraphPad Prism繪制四參數邏輯擬合曲線。

ELP展示雙抗原表位ELP-E(13-20)-(63-71)重組蛋白采用2種方法檢測，方法一同上述方法，分別與13G1213-20和15C463-71單克隆抗體孵育行直接ELISA檢測并做擬合曲線；方法二采用雙抗體夾心ELISA方法，以單克隆抗體15C463-71(抗體1∶1 000稀釋，終濃度為7.0 mg·L-1)捕獲抗原蛋白，單克隆抗體13G1213-20(1∶1 000稀釋，終濃度為0.7 mg·L-1)為檢測抗體，TMB顯色，終止反應后測定各孔A(450)值，以蛋白濃度為橫坐標，各濃度點測定A(450)值為縱坐標，應用GraphPad Prism繪制15C463-71和13G1213-20檢測系統的log-log雙對數校準曲線。

2 結 果

2.1 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白表達將重組質粒轉入E.coliBL21(DE3)宿主后，自動誘導表達24 h，以誘導前收集菌液為陰性對照，分別采用13G1213-20和15C463-712個單克隆抗體對蛋白表達情況進行Western blotting法檢測的結果表明:重組蛋白ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)在自動誘導條件下均獲得高效表達(圖2)，同時證明ELP所展示的表位均能與相應抗體特異結合。3種重組蛋白的相對分子質量與理論相對分子質量相符，分別為157 00、160 00和252 00。

A: 13G1213-20antibody; B: 15C463-71antibody.M: Protein marker; Lane 1: ELP-E13-20without induction; Lane 2: ELP-E13-20with induction; Lane 3: ELP-E63-71without induction; Lane 4: ELP-E63-71with induction; Lane 5: ELP-E(13-20)-(63-71)without induction; Lane 6: ELP-E(13-20)-(63-71)with induction.

圖2 Western blotting法檢測NT-proBNP重組蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of recombinant proteins of NT-proBNP detected by Western blotting method

2.2 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白純化采用ITC方法將自動誘導24 h后的ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)重組蛋白從菌體中分離出來。通過4次ITC純化，SDS-PAGE電泳檢測顯示上述3種重組蛋白均獲得純化(圖3)，經BCA法檢測，每升自動誘導表達培養基中可純化2.0～2.5 mg重組蛋白。純化條帶相對于理論值的位置較低，可能是鹽離子濃度對蛋白的影響導致，這也是ELP在SDS-PAGE蛋白電泳檢測時的常見現象[8,15]。測定蛋白濃度為10 μmol·L-1時ELP-E13-20、ELP-E63-71和ELP-E(13-20)-(63-71)重組蛋白Tt分別為(29.7±0.5)℃、(28.5±0.25)℃和(30.8±0.2)℃。

M: Protein marker; Lane 1: ELP-E13-20; Lane 2: ELP-E63-71; Lane 3: ELP-E(13-20)-(63-71).

圖3 SDS-PAGE法檢測純化的NT-proBNP重組蛋白電泳圖

Fig.3 Electrophoregram of purified recombinant proteins of NT-proBNP detected by SDS-PAGE method

2.3 ELP展示NT-proBNP抗原表位重組蛋白的結合能力采用直接ELISA方法分別檢測13G1213-20和15C463-71抗體與ELP展示抗原表位重組蛋白的結合能力見圖4。3種蛋白的參數邏輯擬合曲線顯示：重組蛋白濃度與A值呈現良好的S形曲線，相關系數(R2)均在0.99以上，擬合優度高。13G1213-20和15C463-71單克隆抗體可以分別與ELP展示NT-proBNP雙抗原表位重組蛋白上的表位結合，說明雙抗原表位間柔鏈設計合理。采用夾心ELISA方法分別將15C463-71和13G1213-20單克隆抗體作為捕獲抗體和檢測抗體，定量檢測ELP-E(13-20)-(63-71)重組蛋白樣品標準曲線，見圖5。雙對數線性回歸分析顯示：ELP-E(13-20)-(63-71)與A(450)值呈雙對數線性劑量依賴關系，其中相關系數(r)=0.919 7 (P<0.01)，其絕對值為0.8～1.0，說明兩者之間存在極強的相關關系，可信度高；R2=0.999 8，說明回歸直線對觀測值的擬合程度非常好。

A: Immunoassay for ELP-E13-20using 13G1213-20antibody; B: Immunoassay for ELP-E63-71using 15C463-71antibody; C: Immunoassay for ELP-E(13-20)-(63-71)using 13G2213-20antibody; D: Immunoassay for ELP-E(13-20)-(63-71)using 15C463-71antibody.

圖4 直接ELISA法檢測13G1213-20和15C463-71抗體與ELP展示抗原表位重組蛋白的結合能力

Fig.4 Binding abilities of 13G1213-20and 15C463-71antibodies and recombinant proteins of ELP for displaying epitopes detected by direct ELISA method

15C463-71was a capture antibody and 13G213-20was a detection antibody;r=0.919 7,P<0.01.

圖5 夾心ELISA法測定ELP-E(13-20)-(63-71)重組蛋白標準曲線

Fig.5 Standard curve of recombinant protein of ELP-E(13-20)-(63-71)detected by Sandwich ELISA method

3 討 論

本研究采用ELP展示NT-proBNP線性表位，探索了低成本、高效地制備NT-proBNP檢測校準品的方法。NT-proBNP相對分子質量為8 600，屬于低相對分子質量多肽，目前生產NT-proBNP的普遍策略是利用基因工程與其他蛋白融合并在E.coli中表達[16-19]。與腦鈉肽融合的常用蛋白：硫氧還蛋白(Trx)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)[18]、Ssp dnaB微型蛋白內含子[19]和人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)[20]等。KIM等[21]采用來自肝片吸蟲的Fh8多肽作為融合標簽高效生產NT-proBNP，可純化出大量NT-proBNP重組蛋白，但是需使用蛋白酶將NT-proBNP從融合蛋白上切割下來才能進一步用作檢測校準品。上述方法中大多數需利用層析法純化蛋白，而且重組蛋白不能直接用于檢測，增加了獲取大量目的蛋白的生產步驟和生產成本。

本研究采用的ELP融合標簽是一種通過可逆相變直接純化的重組蛋白，其與靶蛋白融合后可以在E.coli中高效、可溶地表達，該技術是更簡單、更經濟的純化蛋白方法。目前臨床對NT-ProBNP的檢測通常運用免疫學夾心法[22]來測定樣本濃度，本課題組選擇2個抗原表位與ELP融合用于夾心ELISA法檢測。研究[23]表明：心衰患者血漿中NT-proBNP是O-糖基化蛋白，其中心區域第28～56位氨基酸殘基部位被糖基化，所以該區域表位的抗體很難被識別。為了確保人血漿中NT-proBNP檢測的準確性，HyTest公司推薦其篩選出的15C463-71-13G1213-20抗體組合作為捕獲抗體-檢測抗體[24]，其可分別與NT-proBNP多肽的第63～71位和第13～20位氨基酸殘基表位高效結合，所以本課題組最終選用以上2段多肽作為展示雙表位，不受糖基化影響，適用于NT-proBNP精確檢測系統。

本課題組首先對ELP展示NT-proBNP單表位的研究顯示：在無需去除ELP融合標簽的情況下，展示NT-proBNP部分線性表位的重組蛋白仍具有抗原性，且無論在變性條件下還是非變性條件下均能與相應特異抗體結合，進而設計ELP通過10個天冬氨酸殘基(N)的柔鏈展示NT-proBNP雙特異抗原表位，并采用NNNNNGGGGS柔鏈序列將雙表位隔開，以減小表位之間空間位阻，充分將2個表位展示出來。夾心ELISA法測定ELP-E(13-20)-(63-71)雙對數曲線顯示：本課題組設計的NT-proBNP重組蛋白無需將ELP融合標簽切割下來就能夠同時與相應的捕獲抗體和檢測抗體結合，該設計也不需要融合表達全部NT-proBNP多肽序列，只選取2個表位進行表征即可作為檢測校準品。

綜上所述，選取ELP標簽作為融合蛋白展示NT-proBNP特異抗原表位提供了一種低成本、純化攜帶多個特異抗原表位的方法，為生產其他多肽抗原檢測校準品提供了思路。