乳腺癌MDA-MB-231細胞中Rab7a基因的網絡分析

徐鳳英， 劉 儒， 馬 麗， 曲一帆， 肖偉利， 王玉珍，謝基明

( 1.內蒙古醫科大學研究生學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古自治區人民醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010010；3.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

Rab7a基因和Rab7b基因是Rab7基因家族的2個同源亞型，具有較高的序列相似性[1]。與負責從核內體向高爾基體轉運的Rab7b不同[2]，Rab7a位于晚期核內體，控制向內吞降解室的轉運[3]。Rab7a是溶酶體、吞噬體和自噬體成熟所必需的，并已被證明可調節細胞的存活和凋亡。最近報道[4]表明：Rab7a在癌癥中也發揮了重要作用。波形絲蛋白是反映上皮間質轉化的一個指標[5]，在癌細胞中由Rab7a調控[6]。伏立諾和辛伐他汀可通過抑制Rab7協同抑制三陰性乳腺癌(tripe-negative breast cancer,TNBC)的發展[7]。然而目前尚未見關于Rab7a相關聯基因如何參與TNBC發生發展的報道。本研究利用慢病毒載體敲除TNBC MDA-MB-231細胞中Rab7a基因，通過與陰性對照組比較，對差異基因進行分析，推斷Rab7a及其關聯基因的相互作用以及其可能參與的重要病理過程。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、主要試劑和儀器人乳腺癌ZR-75-30、T-47D、HCC-1937、MDA-MB-231和MCF-7細胞購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。慢病毒lv-Rab7a-sgRNA和陰性對照CON251購自上海吉凱基因化學技術有限公司。DMEM培養基購自美國Invitrogen公司，Ausbian胎牛血清(FBS)購自上海威正翔禹生物科技有限公司，BCA試劑盒和RIPA裂解液均購自上海碧云天生物有限公司。 anti-Rab7a和anti-GAPDH均購自美國Santa Cruz公司，TRIzol試劑盒購自上海普飛公司，M-MLV反轉錄試劑盒、dNTP和Rnase Inhibitor均購自北京Promega公司，SYBR Master Mixture購自日本TaKaRa公司，人基因表達譜芯片(貨號:901838)、安捷倫RNA 6000 Nano 試劑盒、3′IVT PLUS基因芯片和基因芯片雜交洗滌染色試劑盒均購自美國Affymetrix公司。

1.2 細胞培養人乳腺癌ZR-75-30、T-47D和HCC-1937 細胞置于RPMI1640培養基中培養，乳腺癌MCF-7細胞采用DMEM培養基培養，MDA-MB-231細胞采用L-15培養基培養。培養基中血清含量均為10%。MDA-MB-231 細胞隔天換液1次，當細胞生長至80%～90% 融合時，采用含 EDTA 的 PBS 平衡鹽溶液漂洗，再采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，均在37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3 Western blotting法檢測乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細胞中Rab7a蛋白表達水平收集對數生長期目的細胞，提取總蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白水平。取50 μg蛋白樣品按比例加入上樣緩沖液，沸水浴5 min，冷卻離心后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，采用濕轉法120 V、90 min將蛋白質電轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，然后采用磷酸鹽緩沖液和吐溫20 (TBST)溶解的5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，阻斷與抗體的非特異性結合。膜與一抗(1∶1 000) 4℃孵育過夜，次日采用TBST洗滌3次(每次10 min)，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000) 2 h，TBST洗滌3次(每次10 min)后檢測PVDF膜上Rab7a蛋白表達水平。

1.4 慢病毒載體介導的Rab7a基因敲除將處于對數生長期的MDA-MB-231 細胞經胰酶消化，完全培養基制成細胞密度為(3～5)×104mL-1的細胞懸液，取2 mL接種于 6孔板 ，培養24 h后，采用感染復數(MOI)為10的慢病毒感染MDA-MB-231細胞以敲除Rab7a基因，培養12 h后采用完全培養液代替病毒感染液繼續培養。慢病毒載體上的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表達率為90%時，收集細胞進行后續Rab7a基因敲除效率的驗證。Rab7a基因敲除組根據敲除的4種不同Rab7a基因序列分為KD1組、KD2組、KD3組和KD4組，并設置陰性對照組。各組Rab7a基因敲除序列見表1。

表1 各組Rab7a基因敲除序列

1.5 qPCR法檢測各組乳腺癌MDA-MB-231細胞中Rab7a基因敲除效率采用TRIzol試劑盒對病毒感染的各組乳腺癌MDA-MB-231細胞進行裂解和總RNA提取。取2 μg總RNA和2 μL反轉錄引物，根據 M-MLV試劑盒說明進行反轉錄合成cDNA，采用qPCR法擴增目的基因和內參基因。Rab7a基因敲除效率為Rab7a mRNA表達水平降低百分比，Rab7a mRNA表達水平以每組測得的目的基因Rab7a和內參基因GAPDH的CT值并采用2-ΔΔCt法進行計算。ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值，ΔΔCt=陰性對照組ΔCt平均值-各樣品ΔCt值。Rab7a基因引物序列見表2。

表2 Rab7a基因和內參基因引物序列

Tab.2 Primer sequences of Rab7a gene and internal reference gene

GeneSequence (5'-3')Rab7a senceGTCGGGAAGACATCACTCARab7a antisenceCTAGCCTGTCATCCACCATGAPDH senceTGACTTCAACAGCGACACCCAGAPDH antisenceCACCCTGTTGCTGTAGCCAAA

1.6 芯片實驗采用TRIzol法抽提陰性對照組和KD2組樣品總RNA，抽提所得總RNA經NanoDrop 2000和Agilent Bioanalyzer 2100質檢，合格樣本進入芯片實驗。芯片實驗的步驟主要包括樣品的制備、芯片雜交、芯片洗染、芯片掃描和結果分析。

1.7 Rab7a基因敲除后一體化通路分析(IPA)IPA是一個一體化在線整合分析軟件(www.ingenuity.com)[8]，用于基因、microRNA數據和小規模實驗數據的分析。IPA建立了可視化的實驗系統，用于理解基因、蛋白質、化學物質和藥物等屬性，同時可呈現分子之間相互作用的關系網。IPA使用網絡生成算法，按照本課題組預設的網絡大小將分子之間的網絡圖分割成多個網絡，并給每一個網絡進行打分。Score基于P值計算，反映了網絡中的數據集分子出現在該網絡中為隨機過程的概率。Score打分是基于超幾何分布，通過右尾的Fisher精確檢驗獲得顯著性水平的負對數值。所有的網絡使用Score值進行排序。Score值大于2代表該功能被顯著激活，Score值小于-2代表該功能被顯著抑制。

2 結 果

2.1 各組乳腺癌細胞中Rab7a蛋白表達以表達Rab7a的293T細胞作為陽性對照，收集對數生長期乳腺癌ZR-75-30、MCF-7、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細胞總蛋白，Western blotting法分析結果顯示：與陽性對照組比較，乳腺癌ZR-75-30、T-47D、MDA-MB-231和HCC-1937細胞中均可見Rab7a蛋白表達。見圖1。

Lane 1： Positive control group(293T cells);Lane 2：ZR-75-30 cells；Lane 3：MCF-7 cells；Lane 4：T-47D cells；Lane 5：MDA-MB-231 cells；Lane 6：HCC-1937 cells.

圖1 各組乳腺癌細胞中Rab7a蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of Rab7a protein in breast cancer cells in various groups

2.2 慢病毒感染MDA-MB-231細胞中熒光表達MDA-MB-231細胞感染慢病毒96 h后，陰性對照組和KD1、KD2、KD3及KD4組細胞生長狀態良好，病毒感染率達到90%以上。見圖2(插頁三)。

2.3 各組MDA-MB-231細胞中Rab7a基因敲除效率與陰性對照組比較， KD1組MDA-MB-231細胞中Rab7a mRNA表達水平下調了76.2%，即Rab7a基因敲除效率為76.2%；KD2組MDA-MB-231細胞中Rab7a mRNA表達水平下調了87.9%，KD3組MDA-MB-231細胞中Rab7a mRNA表達水平下調了86.2%，KD4組MDA-MB-231細胞中Rab7a mRNA表達水平下調了58.2%；與其他各組比較，KD2組細胞的靶序列具有最高的敲除效率(P<0.001)，即KD2組細胞的靶序列是敲除效率最高的靶點。見圖3。

*P<0.01 vs negative control group.

Fig.3 Expression levels of Rab7a mRNA in MDA-MB-231 cells in various groups

2.4 Rab7a基因敲除后的顯著性差異基因分布對Rab7a敲除效率最高的KD2組與陰性對照組進行基因芯片檢測結果顯示:與陰性對照組比較，KD2組檢測的上調基因數(262個)增多(P<0.01)，下調基因數(372個)增多(P<0.01)。火山圖展示了與陰性對照組和KD2組差異基因分布情況。橫坐標代表經過以2為底對數轉換的差異倍數，縱坐標代表經過以10為底對數轉換的矯正顯著性水平；紅色表示差異倍數大于1.5、顯著性水平小于0.05的所有探針。橫坐標0左側代表下調的基因數，右側代表上調的基因數。見圖4(插頁三)。

2.5 差異基因相關疾病與功能關系對這634個差異基因進行疾病與功能的IPA，疾病與功能柱狀圖展示差異基因在疾病與功能分類中的富集情況。所有疾病與功能使用-Log(Pvalue)值由高到底排序(即按照P值由小到大排序)。與陰性對照組比較，KD2組中與Rab7a相關聯的基因主要與癌癥、機體損傷和異常及細胞存活等有密切關聯。見圖5。

1:Cancer;2:Organismal injuries and abomalities;3:Cell death and survival;4:Cell growth;5:Protein synthesis;6:Cell-to-cell signaling and interaction;7:Cellular movement;8:Cellular development;9:Tumor morphology;10:Organismal survival;11:Gastrointestinal disease;12:Hematological system development and function;13:Immune cell trafficking;14:Hematological disease;15:Immunological disease.

圖5 差異基因相關疾病與功能關系的直條圖

Fig.5 Histogram of disease and function associated with different genes

2.6 指定基因IPA網絡圖根據指定基因VEGFA、IRS1、RPS6KB1、EIF4E和PRKAA1，添加目的基因Rab7a，通過IPA分析平臺繪制基因關系網絡圖。在網絡圖中，Rab7a基因敲除導致eIF4F和IRS1表達下調以及激酶RPS6KB1表達下調；激酶PRKAA1和IKBKE表達上調及VEGFA和轉錄因子ATF2表達上調。見圖6。

3 討 論

圖6 指定基因的IPA網絡圖

乳腺癌已成為全球女性發病率最高的惡性腫瘤[9]，且死亡率持續升高[10],其中TNBC占浸潤性乳腺癌的10%～20%，嚴重影響女性健康與生活質量[11]。由于TNBC不表達雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，因此內分泌治療及抗HER2分子靶向治療對TNBC患者無效[12]。目前有效的全身治療方法是具有細胞毒性的化療，這種治療方式不良反應大且耐藥性高[13]。因此，探索TNBC發生變化的分子機制可能有助于深入了解這種疾病的治療策略[14]。

本課題組前期的研究[4]已經證實：Rab7a在乳腺癌中發揮致癌基因的作用,促進乳腺癌的生長和侵襲。本研究中采用重組的4 種不同靶序列的慢病毒敲除MDA-MB-231細胞的Rab7a基因，并成功獲得持久基因沉默、穩定低表達Rab7a的MDA-MB-231 細胞。通過對不同靶點敲除效率的驗證，篩選出Rab7a敲除效率最高的KD2組進行基因芯片分析，結果顯示：與Rab7a敲除相關聯的基因有262個上調基因，372個下調基因。對差異基因進行IPA分析可見Rab7a及其相關聯基因與癌癥、細胞存活、機體損傷和異常、炎癥、免疫反應等有密切聯系，提示Rab7a及相關基因參與多種病理過程[15-18]。在指定的基因列表中，本研究通過添加目的基因Rab7a進行IPA分析，在基因網絡分析圖中，Rab7a與指定各基因相互作用并發生變化。真核起始因子(eIFs)在腫瘤發生發展起重要作用，mTOR/eIF4F軸有助于乳腺癌的維持和進展[19]。本研究中，eIF4F被Rab7a敲除后表達下調，提示Rab7a可能通過調節eIF4F而促進乳腺癌發生。此外，Rab7a沉默還導致RPS6KB1表達降低，有研究[20]顯示：RPS6KB1在乳腺癌組織中發生了改變。本研究結果顯示：Rab7a耗竭增強了PRKAA1的表達。目前PRKAA1在癌癥發展中的作用尚不明確，PRKAA1和RPS6KB1在乳腺癌發展中的作用需要進一步研究。

綜上所述，可將TNBC細胞中Rab7a作為一個靶基因，對其相關聯基因進行IPA分析，全面預測Rab7a可能參與的疾病進程，并將Rab7a與其相關基因進行相互關聯分析，為將來更深層次的研究奠定基礎。