microRNA-9-5p靶向MEF2C對腺泡狀橫紋肌肉瘤細胞生物學行為的影響

商 浩，李春森，李 鋒，3，劉春霞

(1. 石河子大學醫學院病理學系，新疆 石河子 832002；2. 浙江省立同德醫院司法鑒定所，浙江 杭州 310012；3. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院病理科，北京 100020)

橫紋肌肉瘤是兒童和青少年中最常見的軟組織肉瘤，好發于頭部和頸部[1]。根據臨床特點和細胞形態等，世界衛生組織(WHO)將橫紋肌肉瘤分為腺泡狀橫紋肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma, ARMS)、胚胎性橫紋肌肉瘤、多形性橫紋肌肉瘤和梭形細胞/硬化性橫紋肌肉瘤[2]。ARMS常存在t(2；13)(q35；q14)或t(1；13)(q36，q14)染色體易位，形成融合基因PAX3-FOXO1或PAX7-FOXO1，其分化程度低，且預后差。盡管放射療法和化療方案等在ARMS中廣泛應用，但ARMS患兒5年生存率仍然較低。當ARMS出現轉移時，患兒5年生存率常低于20%[3-4]。因此有必要揭示ARMS的分子機制，以幫助鑒定新的治療靶點和分子診斷標志物。

小分子核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶基因的3′-UTR結合誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯控制蛋白質編碼基因的表達[5-6]。miRNA已被證實是多種腫瘤的關鍵調節因子，作為腫瘤癌基因或抑癌基因參與細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡和分化等。研究[7-9]表明:microRNA-9-5p(miR-9-5p)在胃癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等多種人類惡性腫瘤組織中呈異常表達，參與腫瘤發生發展。然而miR-9-5p在ARMS中的表達及其作用機制尚未見報道。本研究探討miR-9-5p在ARMS組織中的表達及其作用機制，旨在為研究ARMS發病機制及治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒、主要試劑和儀器ARMS RH30細胞購自上海復翔生物技術有限公司，ARMS PLA802細胞購自上海斯信生物科技有限公司，正常骨骼肌HSKMC細胞購自北納生物技術有限公司，人胚腎293T細胞由石河子大學醫學院新疆地方病和民族疾病重點實驗室提供。肌細胞增強因子2C(myocyte enhancer 2C，MEF2C)過表達質粒和空載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司。MEF2C siRNA及其陰性對照、miR-9-5p模擬物及其陰性對照和miR-9-5p抑制劑及其陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司，含有miR-9-5p結合位點的野生型熒光素酶質粒(MEF2C-3′-UTR-WT)、含有miR-9-5p結合位點突變的突變型熒光素酶質粒(MEF2C-3′-UTR-MUT)、空載體熒光素酶質粒(MEF2C-3′-UTR-NC)和海腎熒光素酶質粒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，anti-MEF2C和anti-β-actin購自美國Abcam公司。Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Life Technologies公司，miR-9-5p和U6引物購自北京天根生化科技有限公司，MEF2C和β-actin引物購自生工生物工程(上海)技術股份有限公司，miRNeasy Mini Kit、miRNeasy FFPE Kit、miScript Ⅱ RT Kit和SYBR Green PCR Kit購自德國Qiagen公司，CCK-8試劑購自日本Dojindo公司，Annexin Ⅴ-APC/PI 凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，Transwell小室購自美國Costar公司，Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司。雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，電泳儀、轉膜儀、凝膠成像系統和全自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司，PAS型流式細胞儀購自德國Partec公司。

1.2 組織標本收集2010-2015年石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科經甲醛固定石蠟包埋的ARMS組織標本和正常骨骼肌組織標本男女各5例，標本所屬研究對象年齡為7個月～66歲。所有研究對象臨床資料完整且詳細，且術前均未進行放化療，參照WHO軟組織腫瘤分類明確診斷結果，經病理學專家證實病理診斷。本研究方案獲石河子大學倫理委員會批準，在手術前獲患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.3 細胞培養和轉染處于對數生長期的ARMS RH30細胞、ARMS PLA802細胞、正常骨骼肌HSKMC細胞和人胚腎293T細胞置于含10%胎牛血清(FBS)和1%雙抗(青-鏈霉素)的DMEM培養基中，于37℃、5% CO2條件下培養。根據實驗需求，使用Lipofectamine 2000按照說明書進行轉染。

1.4 qRT-PCR法檢測不同組織和細胞中miR-9-5p和MEF2C mRNA表達水平以miR-9-5p和MEF2C為目的基因，以U6和β-actin作為內參基因。采用miRNeasy Mini Kit從4種細胞中提取總RNA，采用miRNeasy FFPE Kit從不同組織樣品中提取總RNA，采用miScript Ⅱ RT Kit將RNA樣品逆轉錄成cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit在實時熒光定量PCR儀中進行擴增(反應條件：95℃預變性15 min，94℃、15 s，55℃、30 s，70℃、30 s，共40個循環)。分析實驗結果的有效性，導出實驗數據，采用2-△△CT法計算不同組織和細胞中miR-9-5p和MEF2C mRNA表達水平。后續實驗采用miR-9-5p表達水平最高且MEF2C mRNA表達水平最低的細胞，將細胞分為miR-NC組(加入miR-9-5p模擬物)和miR-9-5p抑制劑組(加入miR-9-5p抑制劑)。

1.5 各組細胞增殖率和細胞凋亡率檢測以每孔5×103個細胞的密度接種于含有100 μL 10% FBS-DMEM培養基的96孔細胞培養板(每組設5個復孔)中，待細胞貼壁0、24、48和72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于細胞培養箱孵育1.5 h，酶標儀檢測在450 nm處吸光度(A)值，以A值代表各組細胞增殖率。每個樣本收集2.5×105個細胞，以預冷的PBS緩沖液洗滌2次，按照Annexin Ⅴ-APC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書采用流式細胞術檢測各組細胞凋亡率。

1.6 各組細胞侵襲數和遷移數檢測采用Transwell小室進行細胞侵襲和遷移能力的檢測。細胞侵襲能力，以0.2 mL DMEM培養基重懸的4×105個細胞接種于以Matrigel處理的上室中，0.6 mL 20% FBS-DMEM培養基加入下室中，置于細胞培養箱中48 h，取出上室，對侵襲細胞固定、染色，隨機選取5個視野拍照，計數侵襲細胞數。細胞遷移能力檢測與細胞侵襲能力檢測步驟基本相同，不同之處僅為無需在上室中加入Matrigel以及細胞加入后只需培養24 h，隨機選取5個視野拍照，計數遷移細胞數。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測293T細胞中熒光素酶活性采用數據庫(TargetScan 7.2[10]、miRDB 6.0[11-12]和mirwalk 3.0[13])預測miR-9-5p和MEF2C mRNA 3′-UTR 區的結合位點。0.1 μL MEF2C-3′-UTR- WT/MEF2C-3′-UTR- MUT/MEF2C-3′-UTR-NC報告質粒、0.4 μL miR-9-5p/NC和0.02 μL海腎熒光素酶質粒共轉染293T細胞，置于細胞培養箱中48 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測293T細胞中熒光素酶活性。

1.8 Western blotting法檢測RH30細胞中MEF2C蛋白表達水平取10 μL各蛋白樣本加入10% SDS-PAGE凝膠行電泳分離，電轉目的蛋白MEF2C至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(anti-MEF2C，1∶1 000；anti-β-actin，1∶2 000) 4℃孵育過夜，洗膜，對應二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL化學發光試劑盒顯色，曝光，顯影，定影，采用Quantity One軟件分析結果。

1.9 轉染MEF2C過表達質粒或MEF2C siRNA后RH30細胞中MEF2C mRNA、細胞增殖率、細胞凋亡率、細胞侵襲數和細胞遷移數檢測RH30細胞轉染MEF2C過表達質粒(計為MEF2C)及其對照質粒(計為EV)、RH30細胞轉染siMEF2C過表達質粒(計為siMEF2C)及其對照質粒(計為si-NC)，檢測RH30細胞中MEF2C mRNA表達水平、細胞增殖率、細胞凋亡率、細胞侵襲數和細胞遷移數。同時進行miR-9-5p抑制劑與MEF2C siRNA共轉染，分為miR-NC+si-NC組、miR-9-5p-inhibitor+si-NC組、miR-NC+siMEF2C組和miR-9-5p-inhibitor+siMEF2C組。檢測各組細胞增殖率、細胞凋亡率、細胞侵襲數和細胞遷移數。

2 結 果

2.1 不同組織和細胞中miR-9-5p表達水平ARMS組織中miR-9-5p表達水平高于人正常骨骼肌組織(P<0.01)，見圖1A。RH30細胞和PLA802細胞中miR-9-5p表達水平高于HSKMC細胞(P<0.05)，且RH30細胞中miR-9-5p表達水平高于PLA802細胞(P<0.05)，見圖1B。因此后續實驗采用RH30細胞進行。

2.2 2組細胞增殖率和凋亡率與RH30細胞中轉染miR-9-5p抑制劑比較，RH30細胞中miR-9-5p表達水平明顯降低。CCK-8法檢測結果顯示：與miR-NC組比較，miR-9-5p抑制劑組RH30細胞增殖率降低(P<0.05)，即干擾miR-9-5p抑制了RH30細胞增殖，見圖2。流式細胞術檢測結果顯示：與miR-NC組比較，miR-9-5p抑制劑組RH30細胞凋亡率升高(P<0.05)，即干擾miR-9-5p促進了RH30細胞凋亡。見圖3。

A： Scatter plot of expression level of miR-9-5p in human skeletal muscle and ARMS tissues;*P<0.01vshuman skeletal muscle tissue;B： Histogram of expression levels of miR-9-5p in HSKMC, PLA802 and RH30 cells,*P<0.05,**P<0.01vsHSKMC cells;△P<0.05vsPLA802 cells.

圖1 不同組織和細胞中miR-9-5p表達水平

Fig.1 Expression levels of miR-9-5p in different kinds of tissues and cells

*P<0.05 vs miR-NC group.

Fig.2 Proliferation rates of RH30 cells in two groups at different time points

2.3 2組細胞侵襲數和遷移數Transwell小室法檢測結果顯示：與miR-NC組比較，miR-9-5p抑制劑組的RH30細胞侵襲數降低(P<0.05)，見圖4(插頁四)和圖5，細胞遷移數降低(P<0.05)，見圖6(插頁四)和圖7，即干擾miR-9-5p抑制RH30細胞的侵襲和遷移。

A,B: Flow cytometry diagram;A:miR-NC group;B:miR-9-5p inhibitor group;C:Histogram(*P<0.05vsmiR-NC group).

圖3 2組RH30細胞凋亡率

Fig.3 Apoptotic rates of RH30 cells in various groups

*P<0.05 vs miR-NC group.

Fig.5 Number of invasion RH30 cells in two groups

2.4 293T細胞中熒光素酶活性miR-9-5p與MEF2C 3′-UTR區預測的結合位點如圖8A所示。與miR-NC組比較，加入miR-9-5p后,共轉染MEF2C-3′-UTR-WT的293T細胞中熒光素酶活性降低(P<0.01)，而共轉染MEF2C-3′-UTR-MUT和MEF2C-3′-UTR-NC的293T細胞中的熒光素酶活性無改變，見圖8B。

*P<0.05 vs miR-NC group.

1:MEF2C-3′-UTR-NC;2:MEF2C-3′-UTR-WT;3:MEF2C-3′-UTR-MUT.*P<0.01.

圖8 miR-9-5p與MEF2C-3′-UTR區預測的結合位點(A)和各組293T細胞熒光素酶活性(B)

Fig.8 Predicted binding sites of mir-9-5p and mef2c-3′- UTR region (A) and luciferase activities in 293T cells in various groups (B)

2.5 各組RH30細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達水平與miR-NC組比較，miR-9-5p抑制劑組RH30細胞中MEF2C mRNA表達水平升高(t= 8.64，P<0.05)，見圖9A；與miR-NC組比較，miR-9-5p抑制劑組RH30細胞中MEF2C蛋白表達水平升高(t= 27.85，P<0.05)，見圖9B。

2.6 不同組織和細胞中MEF2C mRNA表達水平ARMS組織中MEF2C mRNA表達水平低于正常骨骼肌組織(t=12.64，P<0.01)，見圖10A，且與ARMS組織中miR-9-5p表達水平呈負相關關系(r=-0.542，P<0.05)，見圖10B。RH30細胞和PLA802細胞中MEF2C mRNA表達水平低于HSKMC細胞(P<0.01)，見圖10C。

2.7 轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞中MEF2C mRNA表達水平和細胞增殖率、凋亡率和侵襲及遷移細胞數與轉染對照質粒(EV)比較，轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞中MEF2C mRNA 表達水平升高(P<0.01)，見圖11。CCK-8法檢測結果顯示:與轉染對照質粒(EV)比較，轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞增殖率降低(P<0.01)，見圖12。流式細胞術檢測結果顯示：與轉染對照質粒(EV)比較，轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞凋亡率升高(P<0.05)，見圖13。Transwell小室檢測結果顯示: 與轉染對照質粒比較，轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞侵襲數降低(P<0.05)，見圖14(插頁四)和圖15，細胞遷移數降低(P<0.01)，見圖16(插頁五)和圖17。

A: Histogram of expression of MEF2C mRNA(*P<0.05vsmiR-NC group);B:Electrophoregram of expressions of MEF2C protein (Lane 1:miR-NC group;Lane 2:miR-9-5p inhibitor group).

圖9 2組RH30細胞中MEF2C mRNA和蛋白表達情況

Fig.9 Expressions of MEF2C mRNA and protein in RH30 cells in two groups

A:Expression levels of MEF2C mRNA in human skeletal muscle and ARMS tissues(*P<0.01vshuman skeletal muscle); B:Correlation between miR-9-5p and MEF2C mRNA expressions in ARMS tissue; C:Expression levels of MEF2C mRNA in HSKMC, PLA802 and RH30 cells(*P<0.01vsHSKMC cells).

圖10 不同組織和細胞中MEF2C mRNA表達水平

Fig.10 Expression levels of MEF2C mRNA in different tissues and cells

2.8 轉染MEF2C siRNA后RH30細胞中MEF2C mRNA表達水平、細胞增殖率、凋亡率和侵襲及遷移細胞數與轉染si-NC比較，轉染MEF2C siRNA后，RH30細胞中MEF2C mRNA 表達水平降低(P<0.01)，見圖18。CCK-8法檢測結果顯示:與轉染si-NC比較，轉染MEF2C siRNA后RH30細胞增殖率升高(P<0.05)，即干擾MEF2C逆轉了miR-9-5p抑制劑對細胞增殖的抑制作用，見圖19。流式細胞術檢測結果顯示：與轉染si-NC比較，轉染MEF2C siRNA后RH30細胞凋亡率降低(P<0.01)，即干擾MEF2C減弱了miR-9-5p抑制劑對細胞凋亡的促進作用，見圖20。Transwell小室檢測結果顯示: 與轉染si-NC比較，轉染MEF2C siRNA后RH30細胞侵襲數升高(P<0.01)，見圖21(插頁五)和圖22，細胞遷移數升高(P<0.01)，見圖23(插頁五)和圖24，即干擾MEF2C逆轉了miR-9-5抑制劑對細胞侵襲和遷移的抑制作用。

*P<0.01 vs transfection with EV.

圖11 轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞中MEF2C mRNA 表達水平

Fig.11 Expression levels of MEF2C mRNA in RH30 cells after transfection with MEF2 over-expression plasmid

*P<0.01 vs transfection with EV.

Fig.12 Proliferation rates of RH30 cells after transfection with MEF2C over-expression plasmid

A,B: Flow cytometry diagram;A:Transfection with EV;B:Transfection with MEF2C;C:Histogram(*P<0.05vstransfection with EV).

圖13 轉染MEF2C過表達質粒后RH30細胞凋亡率

Fig.13 Apoptotic rates of RH30 cells after transfection with MEF2C over-expression plasmid

*P<0.05 vs transfection with EV.

Fig.15 Number of invasion RH30 cells after transfection with MEF2C over-expression plasmid

*P<0.01 vs transfection with EV.

Fig.17 Number of migration RH30 cells after transfection with MEF2C over-expression plasmid

*P<0.01 vs transfection with si-NC.

圖18 轉染MEF2C siRNA后RH30細胞中MEF2C mRNA 表達水平

Fig.18 Expression levels of MEF2C mRNA in RH30 cells after transfection with MEF2C siRNA

*P<0.01vsmiR-9-5p-inhibitor+si-NC group;△P<0.01vsmiR-9-5p-inhibitor+siMEF2C group;#P<0.05vsmiR-NC+siMEF2C group.

圖19 轉染MEF2C siRNA質粒后各組RH30細胞增殖率

Fig.19 Proliferation rates of RH30 cells in various groups after transfection with MEF2C siRNA

A-D: Flow cytometry diagram;A:miR-NC+si-NC group;B:miR-9-5P-inhibitor+si-NC group;C:miR-NC+siMEF2C group;D:miR-9-5P-inhibitor+siMEF2C group;E:Histogram.*P<0.01.

圖20 轉染MEF2C siRNA后各組RH30細胞凋亡率

Fig.20 Apoptotic rates of RH30 cells in various groups after transfection with MEF2C siRNA

*P<0.05,**P<0.01.

圖22 轉染MEF2C siRNA后各組RH30細胞侵襲數

Fig.22 Number of invasion RH30 cells in various groups after transfection with MEF2C siRNA

*P<0.01.

Fig.24 Number of migration RH30 cells in various groups after transfection with MEF2C siRNA

3 討 論

miR-9源于染色體1q22(miR9-1)、5q14.3(miR9-2)和15q26.1(miR9-3)，最終成為功能成熟的miR-9-5p和miR-9-3p。其中，miR-9-5p在多種癌癥中存在異常表達，作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤進展。在乳腺癌和膽管癌中miR-9-5p被認為是一種致癌miRNA[14-15]，但在胃癌、卵巢癌和結腸癌中被認為是抑癌miRNA[16-18]。由于miR-9-5p參與多種腫瘤的發生發展，且具有兩面性。因此，miR-9-5p在ARMS中發揮何作用成為研究重點。本研究結果顯示：miR-9-5p在ARMS組織和細胞中高表達，且干擾miR-9-5p抑制細胞的增殖、侵襲、遷移以及抗凋亡能力，表明miR-9-5p在ARMS中可能起致癌基因的作用。進一步研究顯示：miR-9-5p可直接靶向MEF2C mRNA的3′-UTR誘導mRNA降解調控MEF2C表達。

MEF2C是MEF2家族成員之一，最初在骨骼肌細胞中被發現，在肌細胞分化中扮演重要角色[19]。同時，MEF2C與心肌、神經嵴和軟骨細胞分化發育等過程有關[20]。近年來研究[21-23]顯示:MEF2C在多種腫瘤組織中存在異常表達，參與肝細胞癌、T細胞淋巴瘤和白血病等腫瘤進展。ARMS是起源于橫紋肌細胞或向橫紋肌細胞分化的間葉細胞的一種惡性腫瘤。因此，本文作者推測：MEF2C在ARMS中可能也發揮一定作用，MEF2C在ARMS中低表達，過表達MEF2C可抑制細胞的增殖、侵襲、遷移以及抗凋亡能力，且干擾MEF2C可部分逆轉抑制miR-9-5p對ARMS細胞的抑制作用，表明MEF2C在ARMS中可能起抑癌基因的作用。

miRNA也可通過靶向mRNA的3′-UTR抑制其翻譯來調節蛋白表達，如miR-874抑制GEFT蛋白表達而不影響其mRNA表達，表明miR-874通過靶向GEFT mRNA的3′-UTR導致其翻譯抑制[24]。砷通過調節miR-31表達抑制SATB2翻譯，使SATB2蛋白表達降低而不影響其mRNA表達[25]。這種現象引起了本文作者對miRNA抑制蛋白合成機制的關注。在植物中，miRNA通常與3′-UTR區或mRNA編碼區的靶序列完全互補配對降解mRNA；在動物中，miRNA通常與靶mRNA的3′-UTR堿基不完全互補配對通過抑制翻譯或引起mRNA降解來調節靶基因的表達[26]。

綜上所述，miR-9-5p可通過直接靶向MEF2C促進ARMS細胞的增殖、侵襲、遷移和抗凋亡能力，miR-9-5p在ARMS中可能扮演癌基因的角色。