活化素Ⅰ型受體對小鼠下頜骨髁突軟骨生長發育的影響及其機制

閆廣興，葉佳朋，王爽爽，劉蒼維，周怡君，胡 月，郝新青，杜奧博，史 冊，孫宏晨,

(1.吉林大學口腔醫院病理科，吉林 長春 130021；2.吉林大學口腔醫院頜面外科，吉林 長春 130021；3.中國醫科大學附屬口腔醫院口腔病理科，遼寧 沈陽 110001； 4.吉林大學口腔醫院牙體牙髓科，吉林 長春 130021)

顳下頜關節(temporal mandibular joint, TMJ)是僅在哺乳動物中發現的滑膜關節，在張閉口運動中參與下頜骨的平移和旋轉[1]。下頜骨髁突軟骨(mandibular condylar cartilage, MCC)是下頜骨生長和關節活動的重要部位，但目前有關MCC形態和發生發展的遺傳、細胞及分子機制研究卻依然很少。

小鼠的遺傳學研究[2-4]表明：骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號通路參與調控軟骨的生長發育。BMP受體由Ⅰ型和Ⅱ型受體組成，其中Ⅰ型受體是特異性信號轉導的主要決定因素[5-7]。活化素Ⅰ型受體(activin A receptor type Ⅰ, ACVR1)是Ⅰ型BMP受體之一，ACVR1可與多種BMP、轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)和活化素配體結合從而傳導BMP信號通路[8-9]。近年來，ACVR1在生長板軟骨中的作用已逐漸被報道，小鼠生長板軟骨條件性敲除ACVR1(Col2a1-Cre模型)與同窩野生型小鼠的生長板軟骨細胞形態和組織結構比較無明顯異常[10]。由于生長板軟骨與髁突軟骨在胚胎發生、組織結構和對生長因子反應等方面存在一定的差異[11-12]，因此，ACVR1對髁突軟骨生長發育的作用可能與生長板軟骨不同。ACVR1能抑制小鼠髁突軟骨細胞的增殖，促進小鼠髁突軟骨細胞的成軟骨向分化[1, 13- 14]。然而由于體內的環境復雜多變，尚無文獻報道ACVR1在MCC發生發展中的作用。為了探討ACVR1在MCC發生發展中的作用，本實驗采用條件性ACVR1基因敲除小鼠模型(Osterix-Cre模型)[15]，探討ACVR1在MCC發生發展中的作用及其相關機制，旨在為臨床上MCC相關性疾病的病因及治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器基因修飾小鼠來自美國密歇根大學牙學院Yuji Mishina實驗室。UltraSensitiveTMSP(兔和鼠)免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)試劑盒(福州邁新生物技術公司)，DAB(北京中杉金橋生物技術公司)，X-gal(型號：B4252)和表面活性劑IGEPAL(型號：I-3021)(美國Sigma公司)，抗Osterix(Osx)抗體(型號：ab209484)、抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體(型號：PC10)、抗Ⅹ型膠原抗體(型號：ab58632)(美國Abcam公司)，甲苯胺藍染色液(國藥集團化學試劑有限公司)。SZX體式顯微鏡和Vanox倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，micro-CT系統(瑞士Scanco Medical AG公司)。

1.2 模型建立和實驗分組通過小鼠擴群和鼠耳鑒定，將基因型為Osterix-Cre; Acvr1+/-的雄性小鼠和基因型為Acvr1fx /fx; RS/RS的雌性小鼠配對，選取雄性子代基因型為Osterix-Cre; Acvr1fx /-; RS/+的小鼠作為實驗組，Osterix-Cre; Acvr1fx /+; RS/+小鼠作為對照組。于出生當天(postnatal day 0, PN0)、出生第21天(postnatal day 21, PN21)和出生第42天(PN42)分別收集標本，每組標本數：n≥ 3。

1.3 X-gal染色觀察MCC組織中Osterix-Cre表達取新生Osterix-Cre; RS/+小鼠，于冷PBS中解剖小鼠并分離小鼠下頜骨，4%多聚甲醛固定10 min，PBS快速沖洗2次，浸泡液4 ℃浸泡30 min(每10 min換液1次)，X-gal染液37 ℃染色過夜。第2天將下頜骨取出，采用PBS于4 ℃浸泡60 min(每30 min換液1次)，4%多聚甲醛固定20 min，PBS快速沖洗2次，體式顯微鏡拍照。組織顯現為藍色的部分為陽性結果。組織經15% EDTA脫鈣，梯度脫水后石蠟包埋，制成3 μm切片。將X-gal染色標本制成3 μm切片，常規脫蠟至水，伊紅Y染色液染色2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4 micro-CT法檢測小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度micro-CT檢測方法[16](圖1，見插頁五)：點1為髁突關節面的最后點；點2為髁突關節面的最前點；點3為髁突最外點；點4為下頜切跡最凹點；點5為下頜升支最凹點。點1和點2連線為髁突寬度，點3至點4和點5連線的垂線為髁頭長度。

1.5 HE和甲苯胺藍染色觀察MCC細胞形態及MCC組織各層軟骨厚度取PN21、PN42實驗組和對照組小鼠，脫頸處死，分離下頜骨，4%多聚甲醛固定，15% EDTA溶液脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成3 μm切片。切片脫蠟至水后，行常規HE染色，封片后顯微鏡下觀察。甲苯胺藍染色：切片常規脫蠟至水后，甲苯胺藍染液染色60 min，0.2%冰醋酸分化10 s，蒸餾水沖洗，自然風干后封片，顯微鏡下觀察MCC細胞形態和MCC組織結構[17]。根據MCC周長將髁突軟骨平均分為三等分(前1/3、中1/3和后1/3)，測量各等分處MCC各層平均厚度。MCC分層(以中1/3區為例)：關節層(articular zone, Ar)、增殖層(proliferative zone, Pr)、成軟骨細胞層(chondroblastic zone, Ch)和肥大軟骨細胞層(hypertrophic zone, Hy)。采用Image J和Image-Pro Plus軟件進行組織學測量。

1.6 IHC染色觀察MCC組織中PCNA陽性細胞數和Ⅹ型膠原水平標本常規脫蠟至水，抗原修復，3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶；PCNA(稀釋比為1∶1 000)和Ⅹ型膠原(稀釋比1∶500)抗體37 ℃水浴鍋孵育2 h，根據IHC試劑盒說明書滴加生物素標記的二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉素生物素工作液；DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。MCC組織中顯現為棕色染色的部分為PCNA和Ⅹ型膠原染色陽性結果。IHC檢測方法[18]：采用Image-Pro Plus軟件，經校準后測量MCC各層棕色部分的累計光密度(IOD)值，再除以相對各測量層的面積，作為各層陽性區域的平均吸光度(A)值,以A值代表MCC中Ⅹ型膠原表達水平。計數各層PCNA陽性細胞數，重復3次取平均值。

2 結 果

2.1 X-gal染色觀察MCC組織中Osterix-Cre表達PN0時，小鼠MCC形態與成熟的MCC形態不同，髁突表面仍存在部分未分化的間充質細胞，此時髁突軟骨由關節表面到關節內部分層：纖維軟骨細胞層(fibrous chondrocyte zone，Fi)、多態軟骨細胞層(polymorphic chondrocyte zone,Pc)、扁平軟骨細胞層(flattened chondrocyte zone,Fc)和Hy。X-gal染色結果顯示：新生小鼠的下頜骨染色為藍色，體式顯微鏡下可見下頜骨、髁和髁突軟骨均被染為藍色(圖2A，見插頁五)。切片后行伊紅染色結果顯示：髁突軟骨扁平軟骨細胞和肥大軟骨細胞呈陽性(圖2B，見插頁五),表明Osterix-Cre在髁突軟骨的扁平軟骨細胞和肥大軟骨細胞中均有表達，間接說明了上述細胞中ACVR1基因被敲除。為了確定Osterix-Cre在小鼠出生后是否持續表達，對PN21的野生型小鼠的髁突軟骨進行IHC染色結果顯示：Osterix-Cre位于髁突軟骨的成軟骨細胞和肥大軟骨細胞中(圖2C，見插頁五)，提示ACVR1基因在上述細胞中持續缺失。

2.2 PN21時2組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度micro-CT檢測結果顯示：PN21時實驗組和對照組小鼠下頜骨中均能觀察到形態完整的髁突，對髁突寬度和髁頭長度測量及統計分析結果顯示：實驗組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度均明顯短于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 PN21時2組小鼠下頜骨髁突寬度和髁頭長度

GroupnCondylar widthCondylar head lengthControl81.20±0.052.27±0.42Experiment101.09±0.10*2.25±0.07*

*P<0.05 compared with control group.

2.3 PN21時2組小鼠MCC細胞形態和MCC組織各層軟骨厚度HE染色和甲苯胺藍染色可見：2組小鼠髁突軟骨結構完整，均能觀察到Ar、Pr、Ch和Hy各層及正常MCC細胞的形態表現。見圖3(插頁五)。檢測小鼠髁突不同區域的各層軟骨厚度結果顯示：髁突前、中和后1/3的各層軟骨厚度比較差異無統計學意義，實驗組小鼠中1/3區域的Ch與對照組比較出現增厚趨勢，但組間比較差異無統計學意義(P= 0.06)。見表2。

2.4 PN21時2組小鼠MCC組織中PCNA陽性細胞數和Ⅹ型膠原表達水平IHC染色結果顯示：PCNA主要表達于增殖期細胞的細胞核，陽性細胞(棕色)主要位于MCC組織中的Pr、Ch和Hy，見圖4(插頁五)。由于Osterix-Cre主要表達于Ch和Hy，ACVR1在這2層軟骨細胞中敲除，其最可能影響這2層的增殖和分化。實驗組小鼠MCC組織中單個Hy以及Ch和Hy兩層中PCNA陽性細胞數明顯多于對照組(P<0.05)；實驗組小鼠MCC組織中Ch中PCNA陽性細胞數與對照組比較出現增多趨勢，但差異無統計學意義(P=0.13)。見表3。

表2 PN21時2組小鼠MCC組織各層軟骨厚度

GroupnArAnterior partIntermediate partPosterior partControl836.19±13.1830.16±13.7143.07±19.90Experiment1032.92±3.3941.21±13.8753.60±9.89GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl822.61±2.7926.11±7.2631.89±3.57Experiment1027.00±9.8635.42±12.1133.32±12.08GroupnChAnterior partIntermediate partPosterior partControl827.12±11.0827.68±7.8535.53±8.49Experiment1029.58±9.0340.50±9.2738.78±13.58GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl867.91±34.8891.83±29.4999.75±29.55Experiment1065.39±18.9775.99±13.9775.51±23.06

Ⅹ型膠原主要由髁突軟骨的Ch和Hy表達并分泌。采用Image-Pro Plus軟件測量Ch和Hy中Ⅹ型膠原陽性區域結果顯示：在PN21時，實驗組小鼠Ch和Hy兩層MCC細胞中Ⅹ型膠原表達水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 PN21時2組小鼠MCC組織中PCNA陽性細胞數

GroupnNumber of PCNA positive cells Ch Hy Ch and HyControl824.25±4.432.75±0.9627.00±3.56Experiment1029.33±2.086.67±1.53**36.00±2.00*

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

2.5 PN42時2組小鼠MCC組織形態表現HE和甲苯胺藍染色結果顯示：PN42時，實驗組小鼠部分髁突軟骨細胞形態異常，成軟骨細胞肥大化進程減慢，部分髁突肥大軟骨細胞的排列紊亂，見圖5(插頁五)。由于髁突軟骨在PN42 Ar變薄，所以將Ar和Pr厚度一起測量；此外，由于髁突軟骨中部為主要咀嚼受力區域，因此在中部區域測量Ar、Pr和Ch總厚度結果顯示：實驗組小鼠髁突軟骨前1/3區Hy和中1/3區Ar、Pr和Ch這3層總厚度均明顯厚于對照組，且前1/3區Ch厚度較對照組有增厚趨勢，但差異無統計學意義(P= 0.083)，其他各層厚度比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表4 PN21時2組小鼠MCC組織中Ⅹ型膠原表達水平

GroupnLevel of type Ⅹcollagen ChHyControl80.16±0.040.15±0.06Experiment100.15±0.060.17±0.06

*P<0.05 compared with control group.

表5 PN42時2組小鼠MCC組織各層軟骨厚度

GroupnArAnterior partIntermediate partPosterior partControl824.47±5.7271.19±10.0562.63±21.19Experiment1025.19±4.90101.82±12.75**58.25±15.16GroupnPrAnterior partIntermediate partPosterior partControl824.47±5.7271.19±10.0562.63±21.19Experiment1025.19±4.90101.82±12.75**58.25±15.16GroupnChAnterior partIntermediate partPosterior partControl835.36±6.2071.19±10.0557.31±15.50Experiment1050.61±16.05101.82±12.75**56.71±16.82GroupnHyAnterior partIntermediate partPosterior partControl853.66±9.8180.59±19.24110.10±25.73Experiment1077.95±15.81*83.35±17.67108.50±20.67

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group.

2.6 PN42時小鼠MCC組織中PCNA陽性細胞數和Ⅹ型膠原表達水平IHC染色結果顯示：在PN42時，PCNA主要表達于Pr、Ch和Hy。在PN42時，Ar較薄，且Pr和Ch界限不清，見圖6(插頁五)，實驗組小鼠髁突軟骨中PCNA陽性細胞數明顯多于對照組。

Ⅹ型膠原主要位于髁突軟骨的Ch和Hy。在PN42時，實驗組小鼠髁突軟骨Ch中Ⅹ型膠原表達水平大于對照組，說明在Ch中Ⅹ型膠原的分泌增多。Hy中Ⅹ型膠原表達水平與對照組比較無明顯差異。

3 討 論

本實驗采用條件性ACVR1基因敲除小鼠模型(Osterix-Cre模型)檢測小鼠髁突軟骨的形態、組織學結構、髁突軟骨細胞的增殖和分化結果顯示：ACVR1通過抑制髁突軟骨細胞的增殖和成軟骨細胞向肥大軟骨細胞的分化，在調控髁突軟骨的生長發育中發揮重要作用。

本課題組選擇Osterix-Cre是由于Osterix表達于胚胎期(第13.5天時)髁突軟骨剛形成時[19]。本課題組采用的基因修飾小鼠攜帶Rosa26報告基因，即當Cre在表達Osterix的細胞中被激活后LacZ開始表達。因此可通過X-gal染色顯示LacZ陽性細胞，間接說明上述細胞表達Osterix。在本實驗中，X-gal和IHC染色結果也進一步明確了PN0和PN21時，Osterix-Cre主要表達于Ch和Hy，說明在模型小鼠中，ACVR1在這部分軟骨細胞中被敲除。

本研究結果顯示：MCC組織厚度異常出現在PN42時，而PN21時2組小鼠MCC組織厚度比較差異無統計學意義。本文作者推測：由于在PN21時，髁突軟骨增殖細胞數較少，并未影響髁突軟骨整層組織學結構的改變，因此導致雖然實驗組小鼠髁突軟骨增殖細胞數增加，但并未引起整層組織結構及厚度的改變。研究[20-21]顯示：咀嚼誘導的機械應力也影響髁突軟骨的生長發育，由于在出生后21 d小鼠斷奶，開始發生自我咀嚼，這也可能是造成PN42時小鼠髁突軟骨厚度發生變化的原因之一。RIGUEUR等[10]發現：條件性敲除ACVR1(Col2a1-Cre)的小鼠在胚胎期(第17.5天時)椎體軟骨中軟骨細胞增殖率降低，這與本研究結果相反，可能是由于ACVR1在椎體軟骨和髁突軟骨中發揮了不同的作用，或可能是由于ACVR1在體內不同發育時期具有不同的作用，或可能是不同的Cre啟動子導致了不同的結果。張琦[22]發現：沉默ACVR1后小鼠髁突軟骨細胞的增殖水平升高，這與本研究結果一致。

Ⅹ型膠原蛋白是軟骨細胞終末分化的標志物，在PN42時實驗組小鼠Ch內MCC細胞中Ⅹ型膠原水平明顯增多，說明隨著出生后小鼠年齡的增長，ACVR1抑制了髁突軟骨Ⅹ型膠原的分泌。Ch中Ⅹ型膠原增多而中后部Hy厚度無改變的可能原因是ACVR1促進了Hy中肥大軟骨細胞的的凋亡從而并未影響Hy的厚度，或者可能由于咀嚼力的在ACVR1缺失小鼠中發揮了更重要的作用。本課題組前期研究[22]結果表明：體外培養髁突軟骨細胞并沉默ACVR1基因后Ⅹ型膠原的分泌水平降低，這與本研究結果相反，可能原因是體內Ⅹ型膠原的調控機制較體外更為復雜，且體外提取細胞的小鼠為3周齡(體質量為10～12 g)，與體內觀察到Ⅹ型膠原增多的PN42時期結果也不同。

綜上所述，出生后小鼠不斷生長，尤其是斷奶后的發育時期ACVR1基因缺失導致了小鼠髁突軟骨不同層的增殖和分化的改變。ACVR1對小鼠髁突軟骨的正常發育至關重要。