黃芩苷對脂多糖誘導的大鼠滑膜RSC-364細胞自噬的抑制作用

王映映，孫利娟，范紫微，古 虹，游先梅，關天昊，張成義，陳 曦

(1.北華大學醫學院病原學教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學藥學院藥理教研室，吉林 吉林 132013；3.北華大學醫學院醫學影像學教研室，吉林 吉林 132013；4.北華大學醫學技術學院醫學檢驗技術教研室，吉林 吉林 132013)

黃芩苷是一種黃酮類化合物，主要來源于黃芩干根[1-2]。目前的研究[3-4]表明：黃芩苷具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用。WANG等[5]已證實：在膠原誘導的關節炎大鼠中，黃芩苷能減少滑膜組織和滑膜成纖維細胞中核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)蛋白表達，減輕關節炎癥。在關節炎小鼠模型中，黃芩苷可明顯減輕踝關節腫脹[6]。在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)發病機制中,類風濕關節炎滑膜成纖維細胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts，RASFs)起重要作用[7]。RASFs能夠產生大量炎性細胞因子、趨化因子和基質降解酶，從而促進RA炎癥和關節破壞狀態[8]。研究[9]顯示：RA疾病嚴重程度與滑膜組織自噬水平呈正相關關系。因此，自噬可能是RA的潛在治療靶點。目前，黃芩苷對RA滑膜細胞自噬的影響尚未見相關報道。有研究[10]顯示：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素(PI3k/Akt/mTOR)信號傳導途徑與RA發生發展有關。本研究觀察PI3k/Akt/mTOR信號通路對脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)誘導的大鼠滑膜RSC-364細胞自噬的影響，探討黃芩苷抗炎分子機制，為RA的臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器大鼠滑膜RSC-364細胞購于北京鼎國生物技術有限公司，采用含10%胎牛血清的DMEM完全培養液培養，于37℃、5%CO2培養箱中培養。LPS和ECL底物化學發光液購于北京鼎國生物技術有限公司；DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)和噻唑藍(MTT)購于美國Sigma公司；黃芩苷購于西安瑞芬生物工程有限公司，黃芩苷溶解于完全培養基中配制成40 μmol·L-1儲存液；逆轉錄cDNA試劑盒和高純度總RNA快捷提取試劑盒購于美國BioTake公司；β-actin多克隆抗體( ab8227)、Beclin1 ( ab62557)、微管相關蛋白-輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein-light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)(ab48394) 和HRP標記二抗(ab205718)均購自英國Abcam公司；Atg5(A0203)、Atg7(A0691)、Atg12( A17045)和P62(A7758)均購自中國武漢AB clonal公司。Bio-Rad 680酶標儀購于美國Bio-Rad公司，E-Gellmager凝膠成像系統購于美國Thermo公司，Eppendorf-PCR儀購于德國Eppendorf公司，JY200C通用型電泳儀購于上海珂淮儀器有限公司。

1.2 實驗分組和MTT法檢測各組RSC-364細胞存活率采用含10%胎牛血清的DMEM完全培養液培養RSC-364細胞，取處于對數生長期RSC-364細胞，以細胞密度1.0 ×104mL-1接種于96孔細胞培養板，每組設置6個復孔，每孔接種200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h后，分為對照組，模型組，地塞米松(DXMS)組，10、20和40 μmol·L-1黃芩苷組。對照組RSC-364細胞只加入細胞培養基，其他各組RSC-364細胞均給予1 mg·L-1LPS誘導其炎癥反應,培養12 h后,黃芩苷組RSC-364細胞分別加入10、20和40 μmol·L-1黃芩苷，DXMS組RSC-364細胞給予終濃度為0.5 μmol·L-1DXMS，繼續孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液于培養箱中培養4 h。隨后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，混勻10 min后，在490 nm處檢測吸光度(A)值并記錄結果，所測A值越小，則存活細胞數就越少。 細胞存活率=給藥組A值/對照組A值×100%。

1.3 RT-PCR 法檢測各組RSC-364細胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表達水平采用RNA提取試劑盒提取各組大鼠滑膜RSC-364細胞總RNA。采用逆轉錄cDNA試劑盒(BioTake)以總RNA為模板，進行逆轉錄cDNA；RT-PCR反應體系(25 μL)包括：2 Taq Master Mix 12.5 μL、雙蒸水9.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL和cDNA1 μL。PCR擴增以逆轉錄cDNA為模板，在94℃、3 min條件下進行初始變性，經過20個循環，94℃、30 s變性，65℃、30 s退火和72℃、1 min延伸過程，72℃、10 min充分延伸；其次點樣，100 V、40 min電泳，采用Image J 6.0軟件分析擴增后的瓊脂糖凝膠電泳條帶灰度值，進行目的基因mRNA半定量分析，計算各組RSC-364細胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表達水平。目的基因mRNA表達水平=目的基因條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值。以上實驗至少重復3次。 RT-PCR引物序列見表1。

1.4 Western blotting 法檢測各組RSC-364細胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12 、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平細胞裂解緩沖液、PMSF和磷酸酶抑制劑配置工作液，用于滑膜RSC-364細胞總蛋白的提取。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白質進行定量分析。具體方法：配膠，濃縮膠、分離膠(12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠)；上樣，各組取50 μg樣本蛋白；電泳，濃縮膠80 V、30 min，分離膠100 V、1.5 h；轉模，PVDF膜，100 V、1 h；封閉，5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；孵育一抗，4℃過夜。采用TBST稀釋兔抗大鼠抗體、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ、Beclin1、P62 和 β-actin；回收一抗，TBST進行洗膜3次，每次10 min；孵育二抗：HRP標記山羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋)室溫1 h，TBST洗3次，每次10 min；采用增強化學發光底物試劑盒進行免疫檢測。以β-actin作為蛋白內參對照，采用Image J 6.0軟件對特異蛋白條帶的灰度值進行定量分析,計算各組RSC-364細胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值。以上實驗至少重復3次。

表1 RT-PCR引物序列

2 結 果

2.1 各組RSC-364細胞存活率與對照組比較，模型組RSC-364細胞存活率明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，不同濃度黃芩苷組RSC-364細胞存活率明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

1:Control group;2:Model group;3:DXMS group;4:10 μmol·L-1baicalin group;5:20 μmol·L-1baicalin group;6:40 μmol·L-1baicalin group;*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

圖1 MTT法檢測各組RSC-364細胞存活率

Fig.1 Survival rates of RSC-364 cells in various groups detected by MTT assay

2.2 各組RSC-364細胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表達水平與對照組比較，模型組RSC-364細胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12 和LC3-Ⅱ mRNA表達水平升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，不同濃度黃芩苷組RSC-364細胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表達水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12及LC3-Ⅱ mRNA表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；不同濃度黃芩苷組RSC-364細胞中上述指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2和圖3。

2.3 各組RSC-364細胞中Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平與對照組比較，模型組RSC-364細胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5、 Atg7和 Atg12蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，P62蛋白表達水平降低(P<0.01)；與模型組比較，不同濃度黃芩苷組RSC-364細胞LC3-Ⅱ、Beclin1、Atg5、Atg7和Atg12蛋白表達水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，P62蛋白表達水平升高(P<0.05或P<0.01)；不同濃度黃芩苷組RSC-364細胞中上述指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖4和圖5。

Lane 1: Control group; Lane 2: Model group; Lane 3: DXMS group; Lane 4-6:10, 20, and 40 μmol·L-1baicalin groups.

圖2 各組RSC-364細胞中PI3k、Akt、mTOR、Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of PI3k, Akt, mTOR, Atg5,Atg7, Atg12, Beclin1, and LC3-Ⅱ mRNA in RSC-364 cells in various groups

A:Expression levels of PI3K,mTOR,and Atg5 mRNA;B:Expression levels of Atg7,Atg12,Beclin1,and LC3-Ⅱ mRNA;1:Control group;2:Model group;3:DXMS group;4-6:10,20,and 40 μmol·L-1baicalin groups.*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

圖3 各組RSC-364細胞中PI3k、Akt、mTOR、Beclin1、Atg5、Atg7、Atg12和LC3-Ⅱ mRNA表達水平

Fig.3 Expression levels of PI3k, Akt, mTOR, Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, and LC3-Ⅱ mRNA in RSC-364 cells in various groups

Lane 1: Control group; Lane 2: Model group; Lane 3: DXMS group; Lane 4-6:10, 20, and 40 μmol·L-1baicalin groups.

圖4 Western blotting法檢測各組RSC-364細胞中Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, LC3-Ⅱ, and P62 proteins in RSC-364 cells in various groups detected by Western blotting method

A:Expression levels of Atg5,Atg7,and Atg12 proteins;B:Expression levels of Beclin1,LC3-Ⅱ,and P62 proteins;1:Control group;2:Model group;3:DXMS group;4-6:10，20,and 40 μmol·L-1baicalin groups;*P<0.01 compared with control group；△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

圖5 各組RSC-364細胞中Atg5、Atg7、Atg12 、Beclin1、LC3-Ⅱ和P62蛋白表達水平

Fig.5 Expression levels of Atg5, Atg7, Atg12, Beclin1, LC3-Ⅱ, and P62 proteins in RSC-364 cells in various groups

3 討 論

RA是一種因免疫耐受機制而產生的慢性變態反應性疾病[11]，其主要特征為滑膜增生和炎性細胞浸潤。研究[7]已證實：RASFs大量增殖是RA發病的關鍵因素之一。近年來，常采用體外培養大鼠滑膜RSC-364細胞經LPS誘導，促使細胞增殖并分泌大量炎性因子作為細胞水平炎癥模型。本研究結果顯示：LPS誘導后，模型組RSC-364細胞大量增殖；給予黃芩苷后，LPS誘導的RSC-364細胞存活率明顯降低，其增殖明顯受到抑制，提示黃芩苷可抑制LPS誘導的RSC-364細胞增殖；與相關文獻[12]報道的結果一致。

自噬是生物體中進化保守的溶酶體降解的途徑[13]，其能調控細胞存活、增殖和凋亡等，以維持細胞內平衡。自噬失調與其自身免疫性疾病發病機制有關[14]，RA發病過程中存在自噬途徑的失調。研究[9]顯示：RASFs通過各種途徑激活自噬，以維持細胞內環境穩定，促使滑膜細胞的大量增殖，導致關節炎癥反應加重。

PI3k/Akt/mTOR信號通路在細胞自噬中發揮著重要作用[10]。PI3k和Akt是mTOR 重要的上游調控因子，PI3k可以激活Akt，活化的Akt進一步磷酸化mTOR[15]。mTOR作為自噬啟動階段的關鍵調節因子，活化后可抑制自噬的發生[16]。Beclin 1是啟動自噬的關鍵，在哺乳動物細胞中，Beclin 1表達上調可以激活自噬[17]。Atg5和Atg7對自噬小體的延伸起重要作用，Atg7啟動Atg5-Atg12結合以及LC3-Ⅰ脂化反應形成LC3-Ⅱ[12,18]。P62水平經常被用作自噬活動的標志，其充當信號轉導分子和自噬選擇性底物，連接多泛素化蛋白及其相關蛋白細胞器到自噬體進行降解[19]。

本研究結果顯示：模型組RSC-364細胞中PI3k、Akt和mTOR mRNA表達水平降低，Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-ⅡmRNA及蛋白表達水平升高，P62蛋白表達水平較低，提示LPS誘導的RSC-364細胞中可通過抑制PI3k/Akt/mTOR信號通路激活自噬；給予黃芩苷后，黃芩苷組RSC-364細胞中自噬通路PI3k、Akt和mTOR mRNA表達水平升高，Atg5、Atg7、Atg12、Beclin1和LC3-Ⅱ mRNA及蛋白表達水平降低，P62蛋白表達水平升高，提示黃芩苷可通過促進PI3k/Akt/mTOR信號通路抑制LPS誘導的RSC-364細胞自噬。

綜上所述，黃芩苷可能通過激活PI3k/Akt /mTOR信號通路抑制LPS誘導的RSC-364細胞自噬，從而抑制炎性RSC-364細胞增殖。