美學區切牙拔牙創大鼠模型的建立和改良微創拔牙手術的效果評價

潘永生，鄺 融，孫 鐸，毛天嬌，姜可新，李 江

(1. 吉林省牙發育及頜骨重塑與再生重點實驗室，吉林 長春130021；2. 吉林大學口腔醫院口腔修復科，吉林 長春130021)

在美學區，由于各種因素導致的拔牙手術常會引起拔牙部位牙槽骨持續吸收、降低和牙周軟組織塌陷，不利于后期美學修復治療[1]。因此建立美學區拔牙創模型并探討拔牙創在自然狀態下愈合或人為因素干預下牙槽骨和軟組織的修復及愈合機制有重大臨床意義[2]。嚙齒類動物發育迅速，因此常作為骨再生研究的實驗對象，且其切牙區域的牙齦和牙槽骨結構類似于人類美學區牙周組織結構而受到廣泛關注[3-4]。

大鼠切牙拔牙創模型已廣泛應用于大鼠牙囊干細胞提取和拔牙創植入材料促進成骨等方面的研究[5-6]。然而由于大鼠切牙長而細，并且切牙組織在大鼠整個生命過程中持續不斷地生長，但未形成典型的根部，而是連接于牙槽窩內的牙囊組織[7]，故在拔牙過程中容易出現牙冠碎裂、斷根或牙囊粘連牙根組織等情況而導致拔牙手術失敗。大鼠切牙近中的動脈血管位于齦緣下方，缺乏專業拔牙器械易導致術中大出血而引起大鼠窒息死亡[8]。常規的手術器械不僅會造成拔牙創大面積牙齦組織撕裂，還會導致牙槽骨骨折，從而影響大鼠前牙美學區的愈合程度[9]。因此采用合適的手術方式建立大鼠下頜切牙拔牙創模型對后期實驗研究至關重要[1]。但是國內外有關在美學區域有效地建立大鼠拔牙創模型的相關報道較少，有關采用優化微創手術進行建模并維持拔牙窩軟、硬組織的研究少見報道，因而探討一種方便、實用且高效的微創手術建模方式具有重要研究意義[10]。

本文作者設計并完善了一種新型微創拔牙手術方式，通過改良既往拔牙實驗技術和優化臨床器械，不僅增加了大鼠切牙完整拔除的效果，降低了大鼠術中失血量，而且促進了大鼠拔牙創周圍牙齦愈合及牙槽骨恢復程度。本研究為美學區拔牙創的建模提供了一種完整的微創手術方式，該技術為將臨床技巧與工具結合創新性地局部應用于動物實驗，不僅可以提高建模效果，還可以為研究美學區軟、硬組織愈合程度提供新方法。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

24只健康雄性SD大鼠，動物使用許可證號：SCXK(吉)2016-0011，由吉林大學基礎實驗室提供，體質量約為220 g，隨機分為實驗組和對照組，每組12只。水合氯醛(成都創龍化工有限公司)。阿替卡因腎上腺素注射液及專用注射器(法國必蘭公司)，光敏雕刻刀、牙齦分離器圖和止血鉗(彎鉗和直鉗)(西安英諾維機電科技有限公司)，可拆卸式直手機(成都創龍化工有限公司)一次性口腔器械盤等。

1.2 手術方法

1.2.1 對照組大鼠常規手術拔牙步驟 術前準備：術前第9、6和3天使用可拆卸式直手機沿大鼠切牙牙齦處切斷牙齒(圖1A，見插頁六)，為預防感染，常規用棉簽碘伏消毒。大鼠麻醉及牙齒拔除：在建模的第10天，采用10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)腹腔注射全身麻醉。碘伏棉簽消毒后，在拔除切牙的唇、舌側及近、遠中使用口腔專用注射器行必蘭麻局部浸潤麻醉(圖1B,見插頁六)。使用探針在切牙的唇、舌側及近、遠中分別分離牙齦組織(圖1C,見插頁六)，然后使用止血鉗沿著牙根生長方向拔除牙齒(圖1D，見插頁六)。

1.2.2 實驗組大鼠微創手術拔牙步驟 術前準備：在術前第9、6和3天，分別使用光敏雕刻刀及牙齦分離器將牙齦向牙根方向分離，并且分別在切牙的唇、舌側及近、遠中部位利用杠桿原理對牙根施力，然后利用可拆卸式直手機沿著大鼠切牙的牙齦處切斷牙齒。大鼠麻醉：在建模的第10天，局部麻醉和全身麻醉方法同上，在局部注射麻醉過程中，注意在切牙近中勿將注射器針頭探入過深以防刺破血管引發全身反應。牙齒拔除：將適量棉花塞入大鼠口腔，以防止血液和唾液誤吸。該手術采用的手術器械均通過高溫高壓滅菌。使用光敏雕刻刀(圖2A，見插頁六)和牙齦分離器(圖2B，見插頁六)沿著牙根方向分離牙齦,并在近、遠中部位使用杠桿力撬動牙根。然后在止血鉗(圖2C，見插頁六，綠色箭頭指示施力方向)上纏上棉花，以防止牙齒的牙冠部分被夾碎，并使用相對恒定的力量沿著牙根生長方向拔除牙齒。牙齒拔除過程中不能使用任何旋轉和搖晃力量，術中及時止血。 牙齒拔出后，及時利用纏有棉花的探針注入拔牙窩中止血，5～10 min后取出，然后使用5-0縫線縫合傷口(圖2D，見插頁六)。術中采用四手操作：術者在操作時由助手配合保持大鼠的開口度并保證大鼠呼吸順暢,及時清除手術區域的唾液與血液,密切觀察大鼠生命體征。

1.3 大鼠術后護理和處置

手術后將2組大鼠放置于干凈衛生和通風良好的鼠籠中飼養,并維持籠內溫度約為25℃。大鼠蘇醒后采用軟食飼養24 h，于術后第1周和第4周觀察2組大鼠拔牙傷口的愈合情況。

1.4 2組大鼠存活率

記錄術中和術后存活大鼠數，計算大鼠存活率,同時記錄2組大鼠死亡數。大鼠存活率=存活大鼠數/大鼠總數×100%。

1.5 2組大鼠體質量檢測

分別記錄2組大鼠在圍手術期(包括術前第9、6和3天)和手術時體質量及術后第7和14天體質量。

1.6 2組大鼠切牙完整拔除率

切牙完整拔除定義為牙冠和牙根完全拔除，并伴有或未伴有牙囊組織。記錄每組大鼠完整拔除切牙數，計算切牙完整拔除率。切牙完整拔除率=完整拔除切牙數/大鼠牙齒總數×100%。

1.7 2組大鼠拔牙創周圍軟組織和牙槽骨愈合情況

術后1周觀察對照組與實驗組大鼠拔牙創周圍軟組織愈合情況；術后4周觀察對照組與實驗組大鼠牙槽骨愈合情況。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 2組大鼠存活率

對照組：術中大鼠死亡2只(麻醉過量死亡1只，血液誤吸死亡1只);術后第14天，大鼠死亡1只(漲氣死亡),存活率為75%。實驗組：術后大鼠死亡1只(漲氣死亡)，存活率為92%。實驗組大鼠存活率高于對照組(P<0.05)。

2.2 2組大鼠體質量

術后各時間點實驗組大鼠體質量高于對照組(P<0.05)，微創手術對大鼠刺激較小，實驗組大鼠在術后可以較快生長，見圖3。

1:9 d before surgery;2:6 d before surgery;3:3 d before surgery;4:During surgery;5:7 d after surgery;6:14 d after surgery.

圖3 不同時間2組大鼠體質量

Fig.3 Body weights of rats in two groups at different time points

2.3 2組大鼠切牙完整拔除率

實驗組大鼠可見拔除的切牙完整連續(圖4A，見插頁六)，牙根底部伴有牙囊組織，切牙拔牙創未見明顯的牙齦和牙槽骨損傷(圖4B，見插頁六)。實驗組大鼠完整拔除11顆切牙,切牙完整拔除率為92% (圖4C，見插頁六)；對照組完整拔除5顆,切牙完整拔除率僅為42% (圖4D，見插頁六)；實驗組大鼠切牙完整拔除率高于對照組(χ2=6.75，P<0.05)。

2.4 2組大鼠拔牙創軟組織和牙槽骨愈合情況

軟組織愈合：對照組大鼠在術后第1天可見牙齦撕裂傷，術后第7天后可見拔牙創周圍軟組織紅腫(圖5A,見插頁六)。實驗組大鼠術后第1天均見拔牙創周圍軟組織輕微紅腫,未見明顯損傷;術后第7天拔牙創愈合均良好(圖5B，見插頁六)。

牙槽骨愈合：術后1個月通過Micro-CT分析大鼠拔牙創牙槽骨愈合情況。對照組大鼠拔牙窩(圖5C，見插頁六)愈合不佳，再生的骨小梁結構紊亂，牙槽骨的牙槽脊頂處未形成良好的骨閉合；實驗組大鼠拔牙窩(圖5D，見插頁六)愈合良好，新生骨組織位于拔牙窩內，新生骨與宿主骨之間過度自然，且牙槽脊頂處形成良好的骨閉合作用。

3 討 論

大鼠切牙的拔牙創模型是研究美學區拔牙窩骨愈合的一個經典模型，并且其愈合過程可以分為3個不同階段：①凝結物的形成和細胞增殖; ②結締組織的形成和愈合；③在術后第28天時完成了骨改建和骨再生過程，相當于人類術后第64天的愈合結果[8]。因此，成功建立大鼠美學區切牙拔牙創模型對于探討拔牙創軟、硬組織的修復過程具有重要臨床意義。但是大鼠切牙牙齒細長而脆，牙根位于磨牙下方并連接牙囊組織，更重要的是切牙組織伴有一定弧度[11-12]，故常規手術方式很難完整拔除切牙并保留牙周組織，一旦牙根在體內折斷，缺乏專業器械進行處理，不僅影響大鼠拔牙創模型制作，還會進一步影響美學區軟、硬組織的恢復[13]，因此有必要研究一種適用于美學區的微創拔牙方式，以提高大鼠切牙完整拔除率。

改良微創拔牙手術是通過對既往實驗研究技術的改良和常規臨床器械的優化應用，在不添加復雜手術器械的條件下完成整個手術，該微創手術方法適于臨床推廣應用。在拔牙手術前，在對應的時間點分別采用分離器分離牙齦并沿著平齦緣方向磨除大鼠的切牙牙冠，大鼠的切牙在3 d后可以恢復到原有牙齒長度的2/3。這是由于大鼠切牙具有獨特的牙囊組織，其可以促進牙齒在切牙水平上不斷生長[14]。牙囊組織受到局部刺激可以促進牙冠爆發性生長，切牙周圍的牙齦組織受到外界分離器械的影響,進一步促進牙周組織水腫[5]。使用牙齦分離器械和光敏雕刻刀切除牙冠附著的牙周韌帶，不僅進一步減少切牙冠方的阻力，而且保留了美學區牙齦組織，為后期軟組織修復提供了基礎。術后適當的止血措施進一步降低了大鼠牙齦組織的損傷[15]。本研究結果顯示：采用改良方式操作的大鼠存活率提高、拔除牙齒完整數增加、拔牙創軟組織損傷減少并且愈合快且好。

傳統手術方式采用探針分離牙齦、挺松牙齒，改良微創手術則是利用臨床上常規的牙齦分離器及光敏雕刻刀作為牙齦分離器和牙挺。牙齦分離器和光敏雕刻刀具有更為細小的組織分離功能和強大的支撐作用,在分離牙齦及挺松牙齒過程中操作更加便利[16]。雖探針可應用于大鼠的拔牙過程，但探針具有較小的尖端，很大程度上會造成牙周組織的損傷，并且由于探針頸部較粗，分離和挺松大鼠的磨牙相對容易，但由于切牙的牙齦組織更為密合且堅韌，使用探針分離容易造成牙齦組織分離不徹底且伴有較大的損傷[12,17]。光敏雕刻刀有薄且鋒利的刀刃，更容易插入牙周間隙切斷附著的膠原纖維，伴有一定的弧度可以形成良好的杠桿作用[18]。止血鉗上纏繞棉卷不僅降低切牙牙冠碎裂的風險，而且增強了對切牙牙冠的摩擦力,避免了因支點受力不均勻而導致的牙根折斷，同時也避免了止血鉗誤將牙齦組織卷入而造成牙齦撕脫。本文作者嚴格遵守牙挺和牙鉗的使用原理和操作步驟，提高了切牙完整拔除率[19]。

前牙美學區拔牙創的恢復不僅需要良好的骨組織支撐，還應具有良好的形態和外觀[20]。拔牙窩的及時止血對術后的拔牙創愈合及抑制牙槽骨吸收具有極大影響[21]。拔牙手術不可避免地會造成軟組織和牙槽骨的損傷并進一步誘導牙槽脊吸收，不利于后期牙槽脊軟、硬組織的恢復和治療[22]。在本文作者設計的微創拔牙手術方案中，利用四手操作在牙齒拔除后迅速采用纏繞棉卷的探針插入拔牙窩中，從而有效地抑制了大鼠拔牙窩出血。在牙齒拔除后將牙齦組織恢復至原有形狀和位置，從而在術后維持了原有軟組織的尺寸及豐滿度，滿足美學區對牙齒拔牙手術的要求[23]。微創手術更加符合動物福利及3R原則：reduction(減少)、replacement(替代)和refinement(優化)[24]，減少實驗操作對動物造成的刺激、痛苦及恐懼，降低手術失敗率，并節省了該環節中造成的人力和物力浪費。

本研究結果表明：改良的微創拔牙方法可以明顯提升美學區牙齒的拔除效果，并且最大程度地保留了原有牙槽骨軟、硬組織尺寸，從而為后期軟、硬組織修復奠定了基礎。本實驗結果為在美學區建立拔牙創模型提供了思路和方法，同時微創拔牙方式也可為構建美學區牙槽脊保存實驗動物模型提供了新策略。