雙硫侖聯(lián)合順鉑對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用及其機制

文慶一，焦苗苗，謝 瀟，彭敬予，董鳳歌，魏 雪，楊 明

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院乳腺外科，吉林 長春 130021)

2005年由BRENTON等[1]首次提出三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)的概念，TNBC是指一組不表達雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和表皮生長因子受體(human epidermal growth factor,HER2)的復(fù)雜乳腺癌亞型，TNBC患者發(fā)病年齡較輕，且惡性程度高，侵襲性強，病情進展比較迅速，容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，患者總體生存期短。TNBC患者常伴發(fā)乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene-1, BRCA-1)突變，當BRCA-1基因發(fā)生突變時失去了斷裂DNA雙鏈的修復(fù)功能[2-4]。在疾病的早期和晚期，化療是TNBC患者的主要全身治療方法。目前臨床TNBC的藥物治療主要以紫衫類和蒽環(huán)類聯(lián)合化療為主，鉑類是除紫衫及蒽環(huán)類外的重要選擇[5]。順鉑(cis- diamineichloroplain，CDDP)等鉑類藥物可與DNA雙鏈發(fā)生交聯(lián)，致使DNA雙鏈斷裂，無法完成DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細胞死亡[6]。臨床研究[7]的初步結(jié)果也證實：CDDP單藥新輔助治療TNBC有效，可明顯提高病理完全緩解(pathological complete response，PCR)率。但是，CDDP靶向腫瘤細胞的能力差、體內(nèi)代謝時間短，雖能殺死腫瘤細胞，但同樣對正常細胞的功能也造成了嚴重損害。TNBC患者缺乏靶向療法，這促使科研工作者努力探索可治療的分子靶標以治療TNBC患者[8]。雙硫侖(disulfiram, DSF)能通過抑制乙醛脫氫酶阻斷酒精氧化代謝，在臨床上應(yīng)用于戒酒治療達60年。近些年，DSF被證實具有抗腫瘤潛能[9-13]，說明DSF可作為治療TNBC的潛力藥物，可單獨或與其他一線或二線化療藥物聯(lián)合應(yīng)用。然而，目前尚無研究表明同時使用CDDP和DSF具有抗腫瘤作用。

本研究旨在通過體外實驗評估CDDP與DSF聯(lián)合應(yīng)用對MDA-MB-231細胞增殖的作用，并分析其可能的分子機制，為未來臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器TNBC MDA-MB-231細胞購于上海博古生物科技有限公司。CDDP購于中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，DSF、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)噻唑藍和二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)購于美國Sigma公司，DMEM干粉、青霉素、鏈霉素、0.25%胰蛋白酶消化液和0.25%EDTA-胰蛋白酶購于美國Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于美國Clark公司，AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒和DCFH-DA購于美國KeyGEN公司。Matrigel基質(zhì)膠和流式細胞儀購于美國BD公司，CO2培養(yǎng)箱和高速離心機購于美國Thermo公司，倒置顯微鏡購于日本Nikon公司，酶標儀購于美國 BioYek公司。

1.2 MDA-MB-231細胞培養(yǎng)將MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，傳代3代以上并取呈對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測各組MDA-MB-231細胞存活率取呈對數(shù)期生長的MDA-MB-231細胞并調(diào)整細胞密度，細胞密度調(diào)至8 000個/孔后快速鋪板，每孔200 μL接種于96孔板。設(shè)定CDDP終濃度為200 μmol·L-1，同時將60 μmol·L-1CDDP分別與1、2和4 μmol·L-1DSF聯(lián)合應(yīng)用，細胞分為60 μmol·L-1CDDP組、聯(lián)合1組(60 μmol·L-1CDDP+1 μmol·L-1DSF)、聯(lián)合2組(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF)和聯(lián)合3組(60 μmol·L-1CDDP+4 μmol·L-1DSF)。置于5% CO2、37℃條件下孵育24 h，3倍稀釋至6個濃度，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡下觀察。72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1，即質(zhì)量分數(shù)為0.5% MTT)溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸干凈含MTT的孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，置入酶標儀中振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔在波長為490 nm處的吸光度(A)值，計算MDA-MB-231細胞存活率。細胞存活率 =(樣品A值/對照品A值)× 100%。實驗重復(fù)3次。以藥物濃度的對數(shù)作為橫坐標，細胞存活率作為縱軸應(yīng)用 Orgin 9.2 軟件繪制細胞生長抑制效應(yīng)曲線。

1.4 流式細胞術(shù)檢測各組MDA-MB-231細胞凋亡率采用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化呈對數(shù)生長的貼壁細胞，制成均勻細胞懸液，顯微鏡下計數(shù)，以2.5×105個/孔接種于6孔板。24 h 培養(yǎng)后，分別加入濃度為160 μmol·L-1CDDP后繼續(xù)于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)24、48和72 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，采用2 mL 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗1次。采用0.5 mL 0.5% 胰蛋白酶消化細胞，將MDA-MB-231細胞分為空白對照組、2 μmol·L-1DSF組、60 μmol·L-1CDDP組和聯(lián)合組(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF)。以0.5 mL DMEM 培養(yǎng)液中和，移入1.5 mL EP管中，2 000 r·min-1離心5 min，吸棄上清液，再用 PBS洗滌細胞2次(2 000 r·min-1離心5 min)收集細胞。加入500 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻后，加入5 μL PI，混勻,室溫避光反應(yīng)15 min。1 h內(nèi)進行流式細胞術(shù)檢測。結(jié)果判定標準：AnnexinⅤ-FITC(-)PI(-)為活細胞，AnnexinⅤ-FITC(+)PI(-)為早期凋亡細胞，AnnexinⅤ-FITC(+)PI(+)為中晚期凋亡細胞，AnnexinⅤ-FITC(-)PI(+)為死亡細胞，計算各組MDA-MB-231細胞凋亡率。細胞凋亡率 =(早期凋亡細胞數(shù)+中晚期凋亡細胞和死亡細胞數(shù))/細胞總數(shù)×100%。

1.5 流式細胞術(shù)檢測各組MDA-MB-231細胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平采用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化呈對數(shù)生長的貼壁細胞，制成均勻細胞懸液，顯微鏡下細胞板計數(shù)，以5×104個/孔接種于12孔板，培養(yǎng)24 h。分為空白對照組、2 μmol·L-1DSF組、60 μmol·L-1CDDP組、聯(lián)合組(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF)，置于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)3 h。3 h后，吸棄培養(yǎng)液，采用PBS清洗3次，以1 mL PBS定容。配制10 mmol·L-1DCFH-DA儲備液(4.87 g·L-1，以DMSO溶解)，調(diào)至終濃度為5 μmol·L-1，每孔加入 2 μL DCFH-DA，充分搖勻。37℃培養(yǎng)20 min，棄去孔內(nèi)液體，以PBS洗滌3次。每孔加入1 mL PBS后置于熒光顯微鏡下迅速觀察并拍照，吸棄PBS，采用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化液處理細胞后收集，采用流式細胞術(shù)檢測各組MDA-MB-231細胞中ROS水平。采用Origin 9.2軟件繪圖并分析ROS水平變化。

1.6 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)檢測各組MDA-MB-231細胞中鉑(Pt)水平采用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化呈對數(shù)生長的貼壁細胞，制成均勻細胞懸液，顯微鏡下細胞板計數(shù)，以每個培養(yǎng)皿4.0×105個細胞接種于50 mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h。實驗分為空白對照組、20 μmol·L-1CDDP組、聯(lián)合組(20 μmol·L-1CDDP+0.625 μmol·L-1DSF)，每組設(shè)置3個平行樣，加入各組藥物后置于5% CO2、37℃條件下作用4和24 h ，吸棄皿內(nèi)液體，采用PBS洗滌3次。采用0.6 mL 0.25% EDTA-胰蛋白酶消化液消化細胞，1 000 r·min-1離心5 min，以2 mL PBS重懸細胞后制成細胞懸液，移入5 mL EP管中，倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)。5 mL EP管中加入硝酸(體積分數(shù)為68%)，在70℃條件下煮12 h。采用ICP-MS檢測各組MDA-MB-231細胞中Pt水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組MDA-MB-231細胞存活率以不同濃度DSF聯(lián)合CDDP作用于MDA-MB-231細胞72 h后可見：CDDP濃度一定的情況下，DSF濃度越大，細胞存活率越低。與60 μmol·L-1CDDP組比較，聯(lián)合1組、聯(lián)合2組和聯(lián)合3組MDA-MB-231細胞存活率降低(P<0.05)。在72 h時，小分子藥物CDDP以及按60∶1、60∶2、60∶4配比與DSF聯(lián)合應(yīng)用的最小抑制濃度(IC50)分別為32.012、29.107、26.258 和16.901 μmol·L-1。加入DSF后，IC50隨著DSF濃度的增加而減小。在達到細胞相同抑制效果時，CDDP濃度隨著DSF濃度的增加而降低。72 h后各組MDA-MB-231細胞的生長抑制效應(yīng)曲線見圖1。

圖1 作用72 h后各組MDA-MB-231細胞生長抑制效應(yīng)曲線

Fig.1 Growth inhibition effect curves of MDA-MB-231 cells in various groups after treated for 72 h

2.2 各組MDA-MB-231細胞凋亡率相同濃度CDDP(當量)作用于MDA-MB-231細胞后，時間越長，凋亡細胞數(shù)越多。CDDP 作用于細胞24 h后，發(fā)生明顯的細胞凋亡，作用72 h后MDA-MB-231細胞凋亡率為92.4%。CDDP對MDA-MB-231細胞的抑制作用呈劑量和時間依賴性。見圖2。

作用24 h后，各組MDA-MB-231細胞均有凋亡發(fā)生。與60 μmol·L-1CDDP組和2 μmol·L-1DSF組比較，聯(lián)合組(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF)MDA-MB-231細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3。

1:Blank control group;2-4: 60 μmol·L-1CDDP group(24,48,and 72 h).*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖2 60 μmol·L-1CDDP作用MDA-MB-231細胞24、48 和72 h后細胞凋亡率

Fig.2 Apoptotic rates of MDA-MB-231 cells after treated with 60 μmol·L-1CDDP for 24, 48 and 72 h

1:Control group;2: 60 μmol·L-1CDDP group; 3: 2 μmol·L-1DSF group;4:Combination group (60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF).*P<0.05vscontrol group.

圖3 作用24 h后各組MDA-MB-231細胞凋亡率

Fig.3 Apoptotic rates of MDA-MB-231 cells in various groups after treated for 24 h

2.3 各組MDA-MB-231細胞中ROS水平DCFH-DA熒光染色后，與空白對照組比較，其他各組MDA-MB-231細胞中均可見DCF綠色熒光，即DSF、CDDP單獨及聯(lián)合應(yīng)用均可明顯引起MDA-MB-231細胞中ROS水平升高。作用3 h后聯(lián)合組(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF)MDA-MB-231細胞中ROS水平高于2 μmol·L-1DSF組和60 μmol·L-1CDDP組，約為空白對照組MDA-MB-231細胞中ROS水平的10倍(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

2.4 各組MDA-MB-231細胞中Pt水平作用4 h后，20 μmol·L-1CDDP組MDA-MB-231細胞中Pt水平為(9.760±0.875) ng/106個細胞，聯(lián)合組(20 μmol·L-1CDDP+0.625 μmol·L-1DSF)MDA-MB-231細胞中Pt水平為(9.374±1.125) ng/106細胞，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。作用24 h后，20 μmol·L-1CDDP組MDA-MB-231細胞中Pt水平為(22.062±1.229)ng/106個細胞，聯(lián)合組(20 μmol·L-1CDDP+0.625 μmol·L-1DSF)MDA-MB-231細胞中Pt水平為(28.607±1.380)ng/106個細胞，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

1:Blank control group;2:2 μmol·L-1DSF group;3:60 μmol·L-1CDDP group;4:Combination group(60 μmol·L-1CDDP+2 μmol·L-1DSF).*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組MDA-MB-231細胞中ROS水平

Fig.4 Levels of ROS in MDA-MB-231 cells in various groups detected by flow cytometry

3 討 論

作為一種特殊的乳腺癌亞型，TNBC具有特殊的生物學(xué)行為和臨床病理特征。TNBC患者的全身治療仍以化療為主。目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)尚未批準任何專門針對TNBC的藥物。多年以來，研究主要集中在化療藥物的選擇上，如蒽環(huán)類藥、紫衫類藥和鉑類藥物等。近些年的臨床前研究和臨床研究[14-16]已經(jīng)證實：乳腺癌易感基因(BRCA)相關(guān)性乳腺癌對紫衫醇和多西他賽存在耐藥現(xiàn)象，而對CDDP比較敏感，尤其是對于BRCA-1突變的TNBC患者，PCR率可高達72%～90%[17-18]，但仍需要大樣本隨機對照研究進一步評估CDDP單藥及其與鉑類聯(lián)合化療新輔助治療TNBC的療效。關(guān)于CDDP治療TNBC尚存在大量問題，首先是其嚴重的不良反應(yīng)，惡心、嘔吐和累積性及劑量相關(guān)性腎損傷是CDDP的主要限制性毒性。研究[18-19]證實：CDDP只對存在BRCA-1突變的TNBC有效，而存在BRCA-1突變的患者只約占TNBC患者20%[20]，因此CDDP尚未被批準用于TNBC的一線治療。

尋找能增強TNBC細胞對傳統(tǒng)化療藥物的化療敏感性、降低化療藥物的用藥劑量、減輕正常機體遭受損害的安全無毒藥物是研究人員探索的新方向。DSF作為經(jīng)FDA批準的安全戒酒藥物，應(yīng)用于臨床已有60余年。研究者[21]發(fā)現(xiàn)：該藥物還具有抗白內(nèi)障和抗腫瘤的作用，臨床試驗已證實DSF安全無毒。DSF不僅能有效殺傷包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤細胞，而且對TNBC細胞有極強的殺傷作用且對傳統(tǒng)化療藥物具有增敏作用。ROBINSON等[22]發(fā)現(xiàn)：DSF能有效抑制包括MDA-MB-231在內(nèi)的多種TNBC細胞系的生長，半數(shù)抑制濃度(IC50)為300 nmol·L-1。ROBINSON等[22]研究顯示：DSF能與阿霉素、紫杉醇和吉西他濱等產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。

LIU等[23]對具有乳腺癌干細胞特性的耐藥TNBC細胞系MDA-MB-231PAC10進行了細胞毒性實驗及相關(guān)耐藥性研究發(fā)現(xiàn)：MDA-MB-231PAC10對DSF非常敏感，暴露于DSF僅4 h便完全失去了成球囊能力，作用24 h后可檢測到大量凋亡細胞，而對紫杉醇、多西他賽、阿霉素和CDDP均表現(xiàn)出極強的抗藥性。

本研究結(jié)果顯示：不同濃度DSF輔助CDDP作用于MDA-MB-231細胞72 h后，在達到細胞相同抑制效果時，CDDP濃度會隨DSF濃度的增加而降低。與其他研究不同點：本研究所采用的DSF濃度相對較低，以DSF∶CDDP摩爾比為4∶60的比例即可產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。微量DSF能有效地輔助CDDP抑制MDA-MB-231細胞的增殖，在達到相同抑制效果的情況下，DSF的添加大大降低了CDDP的應(yīng)用濃度，從而降低了CDDP對機體產(chǎn)生的毒性。

目前雖證實DSF能增強傳統(tǒng)化療藥物的敏感性，但是其具體機制尚不清楚。很多研究[24-26]已經(jīng)證實：高水平ROS能夠破壞細胞的DNA和磷脂等結(jié)構(gòu)，并誘導(dǎo)細胞凋亡及壞死。與正常細胞比較，癌細胞本身便存在較高水平ROS[27-28]。誘導(dǎo)癌細胞產(chǎn)生更多的ROS，使腫瘤細胞比正常細胞提早達到并超過ROS耐受閾值，最終導(dǎo)致癌細胞的選擇性凋亡，也是腫瘤治療方向之一。以往有研究[29]顯示：DSF-Cu可能是通過刺激ROS的產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：熒光顯微鏡下，DSF和CDDP以摩爾比2∶60聯(lián)合應(yīng)用作用于MDA-MB-231細胞3 h后產(chǎn)生的ROS熒光強度大于CDDP單獨應(yīng)用，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也驗證了該結(jié)論，由此證明：與單獨應(yīng)用CDDP比較，相對微量DSF與CDDP聯(lián)合應(yīng)用能明顯增加細胞中ROS水平，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

綜上所述，小分子CDDP利用其擴散作用可以快速進入細胞，當添加DSF作為輔助藥物后，細胞內(nèi)Pt水平明顯增加，說明DSF能促進CDDP更多地進入細胞，增加細胞中CDDP濃度，從而增強CDDP對細胞的毒性作用。