IL-4協同雌二醇對小鼠乳腺癌細胞生長的促進作用及其機制

馮 磊，張韓特，李 響，孟繁平，李 妍

(1．延邊大學免疫學教研室，吉林 延吉 133002；2.吉林醫藥學院免疫學教研室，吉林 吉林132013)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，按雌二醇受體(estrogen receptor，ER)是否表達，可將乳腺癌分為激素依賴型(ER陽性)和激素非依賴型(ER陰性)，70% 以上乳腺癌為ER陽性，雌二醇對ER陽性乳腺癌細胞生長有促進作用[1]。腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)包含血管內皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞等細胞成分以及細胞外基質、細胞因子及激素等非細胞類成分[2]。TME中T細胞和巨噬細胞偏向Th2分化和M2極化，并分泌白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)、白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)和轉化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等細胞因子[3]。雌二醇參與免疫細胞分化和免疫功能調節，可以促進Th2和M2細胞分化，抑制Th1細胞分化和M1細胞極化[4]。目前，雌二醇聯合IL-4對乳腺癌細胞生長的作用機制研究較少，雌二醇與IL-4可能在促進乳腺癌生長和轉移方面具有協同作用，本研究模擬體內激素與細胞因子共同作用的環境，旨在闡明IL-4和雌二醇對雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)和IL-4受體(interleukin-4 receptor,IL-4R)陽性小鼠乳腺癌4T1細胞生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠乳腺癌4T1細胞購自美國標準生物品保藏中心。胎牛血清購自黃巖四季青有限公司，RPMI 1640 培養液購自美國 Gibco 公司，IL-4重組蛋白購自北京義翹科技有限公司，雌二醇購自北京百靈威公司。抗小鼠Erk1、P70S6K、S6蛋白、ERα和信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription 6， STAT6)及其磷酸化抗體購自美國SAB公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體和辣根過樣化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記第二抗體購自美國Abcam公司，聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、MTT和碘化丙啶(propidium iodide,PI)購自上海碧云天生物技術有限公司，蛋白電泳和免疫印跡相關緩沖液購自北京索萊寶生物科技有限公司。Epics XL型流式細胞儀購自美國貝克曼公司，2800型凝膠成像系統購自荷蘭ProXima公司，DP27型顯微鏡數碼成像系統購自日本奧林巴斯公司。

1.2 細胞培養自液氮中取出凍存的乳腺癌4T1細胞，復蘇后采用含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養液、5% CO2、飽和濕度和37℃消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.2%乙二胺四乙酸)消化細胞后傳代培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.3 MTT法檢測乳腺癌4T1細胞增殖率體外培養乳腺癌4T1細胞，加入不同濃度IL-4(0、12.5、25.0、50.0和100.0 μg·L-1)或雌二醇(0、6.25、12.50、25.00、50.00 nmol·L-1)，作用72 h后MTT比色法檢測不同濃度IL-4和雌二醇作用后乳腺癌4T1細胞增殖率；檢測前4 h，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1),培養4 h后棄去上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜溶解細胞中還原產物甲臜，按不同處理因素分為對照組(不進行任何處理)、IL-4 組(加入50 μg·L-1IL-4)，雌二醇組(加入12.5 nmol·L-1雌二醇)和聯合組(加入50 μg·L-1IL-4+12.5 nmol·L-1雌二醇),檢測波長為490 nm處各組吸光度(A)值，以A值代表乳腺癌4T1細胞增殖率。

1.4 流式細胞術檢測各組不同細胞周期乳腺癌4T1細胞百分比收集不同因素處理后的細胞，PBS洗滌2次，采用80%冷甲醇固定細胞，置于-20℃冰箱中保存。檢測分析前，將細胞懸液離心后棄上清，采用PBS洗滌2次，采用400 μL染色液(含PI和RNA酶)懸浮細胞，室溫染色30 min，采用流式細胞術檢測各組不同細胞周期乳腺癌4T1細胞百分比。各周期細胞百分比=各周期細胞數/細胞總數×100%。

1.5 Western blotting法檢測各組乳腺癌4T1細胞中STAT6、p-STAT6、ERα、Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達水平收集細胞，以PBS洗滌2次；末次離心棄上清，加入RIPA裂解液，經過超聲破碎制備細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測各組裂解液的蛋白濃度，將各組蛋白濃度調整20 g·L-1，加入上樣緩沖液經水浴煮沸5 min，分裝蛋白樣品并冷凍保存，將蛋白樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；轉膜電泳將中蛋白轉印于PVDF膜。采用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉PVDF膜2 h，膜與稀釋的一抗在4℃下反應過夜。次日洗滌PVDF膜3次，將PVDF膜與稀釋的HRP標記二抗在室溫下反應2 h。洗滌3次后與ECL發光工作液反應2 min，采用凝膠成像系統曝光照相記錄結果。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值×100%。

2 結 果

2.1 各組乳腺癌4T1細胞增殖率不同濃度IL-4作用后，與0 μg·L-1IL-4組比較，25.0、50.0和100.0 μg·L-1IL-4組乳腺癌4T1細胞增殖率升高(P<0.05)。不同濃度雌二醇作用后，與0 nmol·L-1雌二醇組比較，12.50、25.00、50.00 nmol·L-1雌二醇組乳腺癌4T1細胞增殖率升高(P<0.05)。見圖1。

*P<0.05 compared with 0 μg·L-1IL-4 group；△P<0.05 compared with 0 nmol·L-1estradiol group.

圖1 IL-4(A)和雌二醇(B)作用后各組乳腺癌4T1細胞增殖率

Fig.1 Proliferation rates of breast cancer 4T1 cells after treated with IL-4(A) and estradiol(B) in various groups

與對照組比較，IL-4 組乳腺癌4T1 細胞增殖率升高(P<0.05)；與對照組比較，雌二醇組乳腺癌4T1 細胞增殖率升高(P<0.05)；與 IL-4組或雌二醇組比較，聯合組乳腺癌4T1細胞增殖率升高(P<0.05)。見圖2。

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with IL-4 group;#P<0.05 compared with estradiol group.

圖2 各組乳腺癌4T1細胞增殖率

Fig.2 Proliferation rates of breast cancer 4T1 cells in various groups

2.2 各組不同細胞周期乳腺癌4T1細胞百分比與對照組比較，IL-4組S期乳腺癌4T1細胞和G2/M期4T1細胞百分比升高(P<0.05)；雌二醇組S期4T1細胞百分比明顯升高(P<0.05)；與對照組比較，IL-4組和雌二醇組G0及G1期細胞百分比均明顯降低(P<0.05)。與 IL-4組或雌二醇組比較，聯合組S期和G2/M期4T1細胞百分比升高(P<0.05)，而G0及G1期4T1細胞百分比降低(P<0.05)。見圖3和表1。

2.3 各組乳腺癌4T1細胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達水平與對照組比較，IL-4組乳腺癌4T1細胞中ERα蛋白表達水平升高， 雌二醇組乳腺癌4T1細胞中 p-STAT6 和ERα蛋白表達水平升高(P<0.05)；聯合組乳腺癌4T1細胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表2和圖4。

A:Control group;B:IL-4 group; C: Estrogen group;D:Combination group.

表1 各組乳腺癌4T1細胞的細胞周期百分比

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with IL-4 group;#P<0.05 compared with estradiol group.

表2 各組乳腺癌4T1細胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達水平

*P<0.05 compared with control group.

Lane 1: Control group; Lane 2:IL-4 group; Lane 3:Estradiol group; Lane 4:Combination group.

圖4 各組乳腺癌4T1細胞中STAT6、p-STAT6和ERα蛋白表達電泳圖

Fig.4 Electrophoregram of expressions of STAT6，p-STAT6， and ERα proteins in breast cancer 4T1 cells in various groups

2.4 各組乳腺癌4T1細胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達水平與對照組比較，IL-4組乳腺癌4T1細胞中p-Erk、p-P70S6K和p-S6蛋白表達水平升高(P<0.05)，雌二醇組乳腺癌4T1細胞中p-Erk、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達水平升高(P<0.05)，聯合組乳腺癌4T1細胞中p-Erk、p-P70S6K和p-S6蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表3和圖5。

3 討 論

癌細胞在TME中生長，不僅包含細胞成分還包含非細胞成分，癌細胞可通過釋放信號因子，使相關免疫細胞的抑制作用受到限制，從而使癌細胞獲得免疫逃逸，促進其生長和增殖[5]。T細胞、巨噬細胞和NK細胞在TME中已發生極化或轉化，釋放的細胞因子(IL-4、IL-10和TGF-β1等)參與和維持TME中免疫細胞的誘導分化，釋放的趨化因子可以增強血管新生、促進腫瘤細胞增殖[6]。本文作者模擬體內TME，研究免疫細胞、細胞因子與腫瘤的相互作用，更好地理解腫瘤發生、侵襲和轉移的機制。

表3 各組乳腺癌4T1細胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達水平

Tab.3 Expression levels of Erk，p-Erk，P70S6K，p-P70S6K，S6，p-S6， and GAPDH in breast cancer 4T1 cells in various groups

GroupErkp-ErkP70S6Kp-P70S6KS6 p-S6Control0.325±0.0500.572±0.0690.506±0.0750.496±0.0620.647±0.0650.945±0.112IL-40.354±0.0491.038±0.127*0.523±0.0610.686±0.073*0.682±0.0621.679±0.164*Estrogen0.311±0.0380.964±0.088*0.495±0.0630.701±0.058*0.598±0.083*1.436±0.109*Combination0.362±0.0431.296±0.144*0.488±0.0540.794±0.066*0.697±0.0741.986±0.094*

*P<0.05 compared with control group.

Lane 1: Control group; Lane 2:IL-4 group; Lane 3:Estradiol group; Lane 4:Combination group.

圖5 各組乳腺癌4T1細胞中Erk、p-Erk、P70S6K、p-P70S6K、S6和p-S6蛋白表達電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of Erk，p-Erk，P70S6K，p-P70S6K，S6， and p-S6 proteins in breast cancer 4T1 cells in various groups

IL-4主要由Th2細胞分泌，生理條件下參與 B細胞分化、抗體分泌的調節，除超敏反應和寄生蟲感染等情況下IL-4水平升高，多種腫瘤細胞可分泌IL-4，并表達 IL-4R[7]。體內生長的腫瘤不僅受細胞因子的影響，乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等腫瘤生長增殖還受雌二醇、孕激素和雄激素等激素的影響[8]。在腫瘤發生發展過程中，Th2細胞及其所分泌的IL-4/IL-4R可以誘導巨噬細胞的M2型極化，抗凋亡蛋白表達上調，促進癌細胞生長[9]。本研究結果表明：IL-4對 IL-4R陽性的小鼠乳腺癌4T1細胞增殖有影響，與對照組比較，IL-4以濃度依賴方式促進 4T1細胞增殖，50 μg·L-1IL-4促進作用已較為明顯。小鼠4T1乳腺癌細胞表面IL-4R表達水平較高，IL-4可以結合癌細胞表面受體，激活JAK1/STATA6信號通路，影響腫瘤周圍炎性細胞的分化和功能，導致腫瘤發生免疫逃逸，引起腫瘤細胞的增殖和轉移[10]；IL-4通過JAK/STAT6信號通路促進巨噬細胞向M2型極化,TEM中巨噬細胞即腫瘤相關的巨噬細胞(tumor associated macrophages，TAMs)為M2極化型[11]。TAM也分泌IL-4和TGF-β等細胞因子，不僅失去殺傷癌細胞的能力，而且是腫瘤組織中細胞發揮旁分泌效應促進腫瘤生長、促進淋巴管和血管生成的重要力量[12]。

IL-4/IL-4R可引起AKT、Erk1/2和mTOR激活，mTOR/p70S6K1信號通路主要參與蛋白質合成、葡萄糖代謝、細胞周期進展和細胞凋亡[13]。mTOR上游通過PI3K/AKT通路或PI3K/AKT/TSC2通路被激活，激活后的mTOR可調節P70S6K1活化[14]。本研究結果顯示：IL-4可促進乳腺癌細胞的增殖和轉移，當IL-4濃度為25～50 μg·L-1時，IL-4以濃度依賴方式促進4T1細胞生長。IL-4和IL-13(Th2細胞等分泌)等細胞因子可促進巨噬細胞M2極化，M2極化高表達CD206和精氨酸酶 1 (arginase 1, Arg1)，分泌TGF-β、IL-4、IL-10、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等，促進細胞生長和組織修復，促進Th2細胞介導的細胞免疫[15]。腫瘤局部Th2細胞通過釋放細胞因子促進癌細胞生長，而M2極化TAMs不僅增加Th2細胞因子來源，并可通過MMP-9和VEGF等促進血管和淋巴管重塑；乳腺癌等腫瘤可釋放IL-10和TGF-β，參與TME中Th2細胞偏移和TAMs向M2極化[16]。除免疫細胞外，上皮細胞或乳腺癌等上皮源性腫瘤細胞也表達IL-4、IL-10和TGF-β等細胞因子受體，Th2和M2極化細胞的旁分泌效應可促進癌細胞生長[17]。

ER的信號轉導途徑主要包括2類，膜受體主要啟動ERKs、PI3K/AKT和cAMP /PKA等非基因組模式信號；核受體主要轉導類固醇的基因組作用信號[18]。按照乳腺癌的分子分型，約70%以上乳腺癌為ER陽性，表達ERα等受體[19]。高表達ERα的乳腺癌可通過阻礙雌二醇的產生或者阻止雌二醇和受體結合而抑制癌細胞增殖；拮抗雌二醇信號也可抑制PI3K、AKT和Erk等激酶介導的促進細胞增殖以及抵抗細胞凋亡的效應[20-21]。本研究結果顯示：當雌二醇濃度為12.5～25.0 nmol·L-1時，雌二醇以濃度依賴方式促進4T1細胞生長。IL-4和雌二醇協同作用誘導4T1細胞后，S期和G2/M期細胞百分比升高，而G0/G1期細胞減少，細胞增殖率高于對照組。IL-4和IL-4R也可促進PI3K、AKT和Erk激酶信號的轉導。PI3K和AKT參與p70S6K1磷酸化激活； S6蛋白在p70S6K1等激酶的激活下促進細胞中蛋白翻譯合成的起始環節。癌細胞分裂增殖和腫瘤轉移侵襲均伴隨p70S6K1激酶活化和蛋白翻譯過程增強。本研究結果顯示：IL-4和雌二醇可協同作用促進ER陽性小鼠4T1乳腺癌細胞增殖，兩者聯合作用可使Erk1、p70S6K1和S6蛋白活化相關位點磷酸化水平升高。本研究結果顯示：IL-4對ERα表達有促進作用，而聯合組乳腺癌4T1細胞中ERα表達水平高于IL-4組或雌二醇組。IL-4和雌二醇不僅協調促進細胞內激酶Erk和P70S6K的磷酸化，也在ER水平具有協調作用。

綜上所述，IL-4和雌二醇協同促進細胞增殖，協同效應涉及多種機制。深入研究IL-4和雌二醇協同作用的分子機制對克服腫瘤耐藥、減少癌細胞侵襲和轉移具有重要意義。