沉默賴氨酸乙酰基轉移酶基因對人甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖和凋亡的影響

杜靜海，陳春悠，郭 欣，張 靜

(河北醫科大學附屬唐山工人醫院頭頸外科，河北 唐山 063000)

多數甲狀腺乳頭狀癌患者可被治愈并長期存活[1]。但也有部分甲狀腺乳頭狀癌惡性程度高，治療后容易出現復發、遠處轉移和淋巴結轉移等，預后較差[2]。因此探討甲狀腺乳頭狀癌的發病機制對抑制腫瘤進展和尋找新的治療靶點具有重要意義。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)信號通路為甲狀腺癌細胞增殖和凋亡的主要信號通路，該信號通路的激活可促進甲狀腺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[3]。賴氨酸乙酰基轉移酶(lysine acetyltransferase，Kat5)在細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、胚胎發育、DNA損傷修復和基因轉錄調控等過程中發揮非常重要的作用[4-6]。結直腸癌組織中Kat5蛋白表達下調可作為預測結直腸癌預后和化療效果的生物學指標[7]，減少Kat5表達可促進前列腺癌轉移[8]，Kat5為惡性胸膜間皮瘤的治療靶點[9]，抑制Kat5介導的SMAD3乙酰化和轉錄活性可抑制黑素瘤進展[10]，Kat5通過調節DNA修復促進乳腺癌發生[11]。WEN等[12]對Kat5在甲狀腺未分化癌組織和細胞中表達的研究顯示：甲狀腺未分化癌組織和細胞中Kat5表達水平升高，上調Kat5表達水平可促進甲狀腺未分化癌的增殖和侵襲，因此認為 Kat5可能為甲狀腺未分化癌的新生物標記物和治療靶標，Kat5在甲狀腺乳頭狀癌細胞中的表達及其作用機制尚未明確，本文作者對甲狀腺乳頭狀癌細胞中Kat5表達水平及沉默Kat5基因對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、凋亡和PI3K/AKT信號通路的影響進行研究，探討Kat5在甲狀腺乳頭狀癌發生發展中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞(美國ATCC細胞庫)。Kat5 siRNA及其陰性對照siRNA(美國OriGene公司)，RPMI 1640培養基、胎牛血清和二喹啉甲酸(BCA)(美國Hycloneo公司)，CCK-8試劑盒、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒、反轉錄(RT)試劑盒、熒光定量聚合酶連反應(PCR)試劑盒(美國Sigma公司)，兔抗人Kat5單克隆抗體、兔抗人周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)單克隆抗體、兔抗人P21單克隆抗體、兔抗人P53單克隆抗體、兔抗人活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體、兔抗人磷酸化PI3K(p-PI3K)單克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體和兔抗人p-AKT單克隆抗體(美國Abcam公司)。ProFlex PCR儀(美國Life Technologics公司)，CLARIOstar酶標儀(德國BMG Labtech公司)。

1.2 細胞培養將細胞置于含胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基中，常規培養，細胞生長至80%以上融合時采用胰蛋白酶消化，并傳代培養，取第3代細胞進行后續研究。

1.3 熒光定量RT-PCR法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中Kat5 mRNA表達水平采用TRIzol提取甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1、K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中總RNA，反轉錄cDNA(按照試劑盒說明書進行)，RT-PCR法檢測各種細胞中Kat5 mRNA表達水平。Kat5上游引物：5′-AATGTGGCCTGCATCCTAAC-3′，下游引物：5′-TGTTTTCCCTTCCACTTTGG-3′。PCR反應條件：95 ℃、20 s；95 ℃、15 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共42個循環。每組設7個復孔，以β-actin為內參照。采用2-ΔΔCt法計算細胞中Kat5 mRNA水平。

1.4 Western blotting法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中Kat5蛋白表達水平甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中加入RIPA裂解液，充分裂解30 min，16 000 g離心10 min，提取細胞總蛋白，BCA測定細胞蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離蛋白，半干法轉膜，脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗人Kat5單克隆抗體過夜孵育(一抗稀釋比例1∶300)，加入二抗孵育1 h(二抗稀釋比例1∶5 000)，加入顯色液，暗室中曝光顯影，以β-actin為內參照，每組設7個復孔。凝膠成像系統獲得各種細胞中蛋白條帶圖片，Image J軟件分析細胞中Kat5蛋白表達水平。Kat5蛋白表達水平=Kat5蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.5 細胞分組和各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中Kat mRNA和蛋白表達水平將甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞分為空白對照組、陰性對照組和沉默Kat5組(si-Kat5組)。取各組對數生長期TPC-1細胞接種至6孔板中，每孔接種2×105個細胞，每組設7個復孔，培養至細胞達85%融合時進行轉染。空白對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞不轉染，陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞轉染陰性對照siRNA，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞轉染Kat5 siRNA，轉染步驟嚴格按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行。按照1.3和1.4中方法檢測各組TPC-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平。

1.6 CCK-8法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖活性轉染48 h后取各組TPC-1細胞接種至96孔板中，每孔5×105個細胞，每組設7個復孔。分別在培養1、3和5 d時各孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h，酶標儀測定波長490 nm處各孔細胞吸光度(A)值。以A值代表細胞增殖活性。

1.7 克隆形成實驗檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞克隆形成率轉染48 h后取各組TPC-1細胞，胰蛋白酶消化，制備成單細胞懸液，接種至6孔板中，每孔接種100 μL細胞懸液(細胞密度為2×103mL-1，即每孔200個細胞)，每組設7個復孔。置于培養箱中培養，觀察克隆形成情況，當肉眼可見克隆出現時終止培養，去除培養基，加入多聚甲醛固定10 min，去除固定液，加入結晶紫染色10 min，顯微鏡下計數克隆形成數，含有多于50個細胞的細胞集落為1個克隆，計算克隆形成率。克隆形成率=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.8 流式細胞術檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞凋亡率轉染48 h后取各組TPC-1細胞，制備成密度為1×106mL-1單細胞懸液，采用流式細胞術檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞凋亡率，操作嚴格按照Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡試劑盒說明書進行。每組重復實驗7次。細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.9 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2、P21、P53、cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平取轉染48 h后各組TPC-1細胞，按照1.3中方法檢測各種蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平均高于甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞(P<0.05)。見圖1和表1。因此選擇Kat5 mRNA和蛋白表達水平最高的TPC-1細胞進行后續研究。

Lane 1：Nthy-ori3-1 cells；Lane 2：BHP10-3 cells；Lane 3：TPC-1 cells；Lane 4：K1 cells.

圖1 Western blotting 法檢測甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中Kat5蛋白表達電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of expressions of Kat5 protein in thyroid papillary carcinoma BHP10-3,TPC-1,and K1 cells and thyroid epithelial Nthy-ori3-1 cells detected by Western blotting method

2.2 各組TPC-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表2。

表1 甲狀腺乳頭狀癌BHP10-3、TPC-1和K1細胞和甲狀腺上皮Nthy-ori3-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平

GroupKat5 mRNAKat5 proteinNthy-ori3-1 cells1.00±0.110.14±0.03BHP10-3 cells1.89±0.13*0.68±0.11*TPC-1 cells2.18±0.14*0.76±0.12*K1 cells 1.95±0.12*0.73±0.12*F119.54157.714P0.0000.000

*P<0.05vsNthy-ori3-1 cells.

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖2 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中Kat5蛋白表達電泳圖

Fig.2 Electrophoregram of expressions of Kat5 protein in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

表2 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中Kat5 mRNA和蛋白表達水平

GroupKat5 mRNAKat5 proteinBlank control1.00±0.080.74±0.13Negative control0.97±0.070.69±0.10si-Kat5 0.32±0.04*△0.16±0.07*△F240.33368.217P0.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

2.3 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖活性與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖活性降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞克隆形成率與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞克隆形成率降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞克隆形成率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3(插頁六)和表4。

2.5 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞凋亡率與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞凋亡率升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞凋亡率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4和表4。

表3 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖活性

Group Proliferation activity (t/d) 135Blank control0.98±0.091.95±0.322.78±0.41Negative control0.96±0.111.89±0.282.75±0.38si-Kat5 0.85±0.07*△1.43±0.21*△1.84±0.31*△F4.1007.55714.670P0.0340.0040.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

A：Blank control group；B： Negative control group；C：si-Kat5 group.

表4 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞克隆形成率和細胞凋亡率

GroupClone formation rate Apoptotic rate Blank control55.64±5.725.64±1.23Negative control54.73±5.646.12±1.31si-Kat5 28.49±4.83*△19.64±1.42*△F56.828252.902P0.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

2.6 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達水平與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2蛋白表達水平降低(P<0.05)，P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5和表5。

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖5 Western blotting法檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達電泳圖

Fig.5 Electrophoregram of expressions of CDK2, P21, P53,and cleaved caspase-3 proteins in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

2.7 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中PI3K和AKT蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與空白對照組和陰性對照組比較，si-Kat5組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平降低(P<0.05)；空白對照組和陰性對照組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6和表6。

表5 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中CDK2、P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達水平

GroupCDK2P21P53Cleaved caspase-3Blank control0.28±0.050.16±0.040.13±0.040.21±0.05Negative control0.26±0.040.17±0.030.11±0.020.19±0.03si-Kat5 0.12±0.02*△0.93±0.12*△0.94±0.15*△0.87±0.13*△F35.467342.432192.200154.897P0.0000.0000.0000.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

Lane 1：Blank control group；Lane 2：Negative control group；Lane 3：si-Kat5 group.

圖6 Western blotting檢測各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達電泳圖

Fig.6 Electrophoregram of expressions of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT proteins in thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

本研究結果顯示：甲狀腺乳頭狀癌細胞中Kat5水平升高，沉默(下調)甲狀腺乳頭狀癌細胞中Kat5表達水平可抑制甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖、促進細胞凋亡，降低細胞中CDK2蛋白表達水平，升高細胞中P21、P53、cleaved caspase-3蛋白表達水平。CDK2是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為細胞周期蛋白依賴性激酶家族成員，在細胞從G1期向S期過渡過程中發揮重要作用，CDK2功能和活性在調節細胞周期運轉中發揮關鍵性作用，與細胞周期調控關系非常密切[13]。P21為CKI基因，CKI可抑制CDK2復合物活性；P21參與細胞分化、增殖、凋亡和衰老等過程的調節；P21為P53的下游調控因子，其啟動子上有P53結合位點；P21參與P53介導的細胞周期停止過程[14]。 P53在細胞周期阻滯和抑制腫瘤發生中發揮重要作用[15]。細胞凋亡有多條通路參與，caspase途徑在細胞凋亡中發揮重要作用，caspase-3為caspase級聯反應下游蛋白酶，在調節細胞凋亡中發揮主導作用，被活化的cleaved caspase-3可使細胞凋亡進入不可逆階段，因此cleaved caspase-3可作為檢測細胞凋亡的主要指標[16]。細胞中CDK2蛋白表達水平降低，P21、P53和cleaved caspase-3蛋白表達水平升高表明：細胞增殖受到抑制，細胞凋亡得到促進。本研究結果表明：沉默Kat5基因水平可抑制甲狀腺乳頭狀癌TCP-1細胞增殖并促進其凋亡。

表6 各組甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞中PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平

GroupPI3Kp-PI3KAKTp-AKTBlank control0.71±0.150.79±0.110.46±0.080.57±0.11Negative control0.69±0.140.78±0.120.47±0.090.59±0.08si-Kat5 0.70±0.130.09±0.03*△0.48±0.070.12±0.04*△F0.036123.4200.10873.796P0.9650.0000.8980.000

*P<0.05vsblank control group；△P<0.05vsnegative control group.

PI3K/AKT信號通路為一條重要的信號轉導通路[17]，在甲狀腺癌發生發展中發揮重要作用，甲狀腺癌中PI3K/AKT信號通路處于激活狀態，可促進甲狀腺癌發生發展，抑制PI3K/AKT信號通路可抑制甲狀腺癌的發生發展[18-19]。PI3K通路下游有多種效應底物，AKT是PI3K/AKT信號轉導通路下游的直接底物，p-AKT可參與惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡過程，增加惡性腫瘤細胞的運動能力[20-21]。Kat5通過多種信號通路發揮作用，研究[22-23]顯示：Kat5可通過PI3K/AKT信號通路調節前列腺癌細胞的增殖過程。因為甲狀腺癌中PI3K/AKT信號通路激活，Kat5可通過PI3K/AKT信號通路影響惡性腫瘤細胞的增殖，推測Kat5可能通過PI3K/AKT信號通路影響甲狀腺癌細胞增殖和凋亡。本文作者發現：沉默甲狀腺乳頭狀癌細胞中Kat5基因可降低細胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達水平，因此Kat5可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖并促進其凋亡。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌細胞中Kat5表達水平升高，下調Kat5表達水平可能通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制甲狀腺乳頭狀癌發生發展。