急性腦梗死小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9的表達(dá)及尼莫地平的干預(yù)作用

卜 一，張 碩，錢(qián)旭東，王紅梅，竇志杰

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000)

急性腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)在腦血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用，促炎因子和抗炎因子之間平衡失調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[1]。半乳糖凝集素3(Galectin-3)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞粘附和參與炎癥反應(yīng)的半乳糖凝集素，在心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，具有促炎作用，在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[3]。研究[4-5]顯示：腦梗死患者血清Galectin-3和MMP-9水平升高，HISAMATSU 等[6]發(fā)現(xiàn)：在短暫性腦缺血后，海馬CA1區(qū)和CA2區(qū)均有Galectin-3表達(dá)，表明Galectin-3和MMP-9可能參與腦缺血的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。尼莫地平為公認(rèn)的腦保護(hù)劑，具有抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的作用，在腦梗死的治療中療效明顯[7-8]，但其對(duì)腦組織中Galectin-3和MMP-9水平的影響尚不清楚。本文作者對(duì)急性腦梗死小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9水平及尼莫地平對(duì)其的干預(yù)作用進(jìn)行研究，探討尼莫地平保護(hù)腦梗死小鼠腦組織的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器清潔級(jí)、雄性CD-1成年小鼠210只，10～12周齡，體質(zhì)量28～30 g，購(gòu)自北京醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0005。尼莫地平注射液(上海信誼金珠藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20000942)，水合氯醛、多聚甲醛、伊紅和蘇木素(天津化學(xué)試劑有限公司)，TRIzol和逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Amresco公司)，兔抗鼠Galectin-3單克隆抗體和兔抗鼠MMP-9單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)等。RT-PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(型號(hào)Leica RM2235，德國(guó)Leica公司)，超低溫冰箱(型號(hào)MDF-382E，日本三洋公司)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 動(dòng)物分組和處理將210只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和尼莫地平組，每組70只。尼莫地平組小鼠于術(shù)前30 min腹腔注射尼莫地平(0.4 mg·kg-1)[9]，對(duì)照組和模型組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。模型組和尼莫地平組小鼠建立急性腦梗死模型，采用線栓法制作大腦中動(dòng)脈梗死模型[10]：將小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉，仰臥固定到手術(shù)臺(tái)上，將頸部皮膚去毛、酒精消毒，取縱行切口(長(zhǎng)約1.5 cm)，分離頸部肌肉、筋膜和腺體組織，包括右側(cè)頸三角，剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈近心端穿線，距離頸總動(dòng)脈分叉4 mm處穿線并結(jié)扎，間斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端分支，沿頸內(nèi)動(dòng)脈向顱底方向分離2 mm，用微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈；在頸外動(dòng)脈殘端剪約0.2 mm切口，將線栓插入頸外動(dòng)脈，移除微動(dòng)脈夾，扭轉(zhuǎn)線栓插入到頸內(nèi)動(dòng)脈顱內(nèi)段，線栓插入9.5 mm，感到輕微阻力時(shí)表明線栓堵住大腦中動(dòng)脈開(kāi)口，此時(shí)結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈，剪斷線栓，縫合皮膚，術(shù)后用慶大霉素消毒切口皮膚。對(duì)照組小鼠不插入線栓，其他步驟同模型組小鼠。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：倒懸時(shí)小鼠左上肢向胸腔屈曲，左側(cè)肢體疼痛回縮消失或遲鈍，行走時(shí)小鼠身體向左轉(zhuǎn)圈或傾倒，右側(cè)出現(xiàn)Horner’s癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：小鼠在觀察時(shí)間內(nèi)死亡，出現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血，無(wú)缺血病理改變。對(duì)照建模成功標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組、模型組和尼莫地平組分別有69、63和66只小鼠符合實(shí)驗(yàn)要求。建模后24 h，每組取60只小鼠進(jìn)行Longar評(píng)分[11]和改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological sevenity score,mNSS)[12]，神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，每組取15只小鼠行TTC染色觀察腦梗死情況，另取15只小鼠用于腦含水量測(cè)量，再取15只小鼠用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)，剩余15只小鼠用于RT-PCR檢測(cè)。

1.3 Longar評(píng)分和mNSS評(píng)價(jià)各組小鼠神經(jīng)功能建模后24 h，采用Longar評(píng)分和mNSS評(píng)價(jià)各組小鼠神經(jīng)功能：Longar評(píng)分總分為5分，0分為無(wú)神經(jīng)功能損傷、行動(dòng)正常，1分為提尾時(shí)前肢內(nèi)收、無(wú)法完全伸展，2分為行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈，3分為行走時(shí)向左傾倒，4分為不能行走或昏迷，5分為死亡；mNSS總分為18分，評(píng)分項(xiàng)目包括平衡木、感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、反射測(cè)試，反射消失或不能完成項(xiàng)目，分值越高神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

1.4 TTC染色檢測(cè)各組小鼠腦梗死體積每組取15只小鼠，麻醉后斷頭處死，取出腦組織，等距切除5片冠狀切片，將腦冠狀切片進(jìn)入TTC溶液中，孵育15 min，棄去TTC溶液，置于多聚甲醛中固定24 h，棄去多聚甲醛，采用數(shù)碼相機(jī)拍照，并導(dǎo)入Image J verl.37c NIH軟件分析圖像，其中蒼白色區(qū)為腦梗死區(qū)，紅色區(qū)為正常腦組織區(qū)，計(jì)算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=腦組織梗死部分體積/腦組織總體積×100%。

1.5 各組小鼠腦組織腦含水量測(cè)定將每組15只小鼠斷頭處死，取腦組織，立即稱(chēng)質(zhì)量，即濕質(zhì)量，然后放入烤箱中烘干，稱(chēng)取烘干后質(zhì)量，即干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量。腦組織含水量=腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量)/腦組織濕質(zhì)量×100%。

1.6 HE染色觀察各組小鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn)每組取15只小鼠，以水合氯醛麻醉后仰臥位固定，剪開(kāi)小鼠胸部，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注預(yù)冷的生理鹽水，至流出液體清亮?xí)r用多聚甲醛固定，至小鼠尾巴和四肢僵直，然后迅速斷頭，取出腦組織，于多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋。將腦組織制作為5 μm厚石蠟切片，經(jīng)脫蠟至水，進(jìn)入蘇木素染液中染色10 min，蒸餾水沖洗，置入1%鹽酸乙醇中30 s，蒸餾水沖洗，伊紅染液中染色2 min，蒸餾水沖洗，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察各組小鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平每組取15只小鼠，斷頭處死，取100 mg梗死側(cè)皮層腦組織，研磨成粉末狀，加入TRIzol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃、30 s，95 ℃、 5 s、58 ℃、30 s，共42個(gè)循環(huán)。各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平將腦組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，置入過(guò)氧化氫-甲醇溶液中封閉30 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗，加入煮沸枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原30 min，加入BSA封閉液封閉30 min，加入一抗兔抗鼠Galectin-3單克隆抗體和兔抗鼠MMP-9單克隆抗體(1∶100)過(guò)夜孵育，加入生物素化二抗孵育30 min，滴加SABC孵育30 min，DAB顯色，蒸餾水沖洗，然后復(fù)染、脫水、透明、封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，在400倍視野下，采用Image-Pro Plus 6.0分析圖像，計(jì)算每個(gè)高倍視野下Galectin-3和MMP-9的積分光密度(IOD)值，以IOD值代表Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分與對(duì)照組比較，模型組小鼠Longar評(píng)分和mNSS升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組小鼠Longar評(píng)分和mNSS降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠Longar評(píng)分和mNSS

GroupLongar scoremNSS Control 0.58±0.161.32±0.24Model 3.37±0.31*9.73±1.21*Nimodipine 1.86±0.28*△5.76±1.18*△F1 754.5131 093.332P<0.001<0.001

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.2 各組小鼠腦梗死體積百分比和腦組織含水量對(duì)照組小鼠無(wú)腦梗死；與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦梗死體積百分比和腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組小鼠腦梗死體積百分比和腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖1(插頁(yè)六)。

表2 各組小鼠腦梗死體積百分比和腦組織含水量

GroupCerebral infarction volume Water content in brain tissueControl 071.19±2.15Model 45.26±5.67 82.07±2.25*Nimodipine 22.18±6.12△76.28±2.07*△t/F10.71495.459P<0.001<0.001

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.3 各組小鼠腦組織形態(tài)表現(xiàn)對(duì)照組小鼠腦細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)壞死灶和水腫；模型組小鼠腦細(xì)胞出現(xiàn)水腫，部分神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞核深染且固縮，腦皮質(zhì)出現(xiàn)片狀壞死，見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；尼莫地平組小鼠腦細(xì)胞水腫和壞死較輕。見(jiàn)圖2(插頁(yè)七)。

2.4 各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA表達(dá)水平

GroupGalectin-3 mRNAMMP-9 mRNAControl 1.00±0.051.00±0.04Model 2.67±0.21*3.12±0.27*Nimodipine 1.73±0.24*△1.94±0.23*△F302.692398.571P<0.001<0.001

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

2.5 各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9陽(yáng)性染色呈棕黃色，主要位于細(xì)胞質(zhì)中。與對(duì)照組比較，模型組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖3(插頁(yè)七)和圖4(插頁(yè)七)。

表4 各組小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9蛋白表達(dá)水平

GroupGalectin-3 proteinMMP-9 proteinControl 361.27±72.16345.86±78.15Model 8 257.29±462.17*8 716.29±471.28*Nimodipine 4 329.42±442.31*△4 619.27±425.19*△F1 692.4061 927.482P<0.01<0.01

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with model group.

3 討 論

腦梗死為常見(jiàn)的腦血管疾病之一，其致殘率和致死率比較高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，探討腦梗死的發(fā)病機(jī)制對(duì)其診治具有重要價(jià)值，但由于腦梗死患者的腦組織取材不便，因此多通過(guò)建立腦梗死動(dòng)物模型對(duì)腦梗死進(jìn)行研究。線栓法是建立鼠急性腦梗死模型的常用方法，本研究采用線栓法建立小鼠腦梗死模型，發(fā)現(xiàn)建模后小鼠Longar評(píng)分和mNSS升高，腦梗死體積和腦組織含水量升高，HE染色顯示小鼠腦組織出現(xiàn)腦梗死的病理學(xué)特征，表明本研究中小鼠急性腦梗死模型建立成功。

Galectin-3主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，其分泌到細(xì)胞外可與細(xì)胞表面受體核糖蛋白相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能[13]。研究[14]顯示：Galectin-3在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用，當(dāng)腦組織受到損傷時(shí)，神經(jīng)元等細(xì)胞受到破壞，釋放出Galectin-3，Galectin-3通過(guò)通透性升高的血腦屏障進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血清Galectin-3水平升高。腦梗死時(shí)神經(jīng)缺損程度越高、腦梗死體積越大、腦組織損傷越嚴(yán)重，則釋放出的Galectin-3越多，血清Galectin-3水平越高，因此血清Galectin-3水平可反映腦梗死的嚴(yán)重程度。MMP-9是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白水解酶之一，在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期發(fā)揮重要作用，與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切[15]；MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞的聚集中亦發(fā)揮主要作用[16-17]。本文作者通過(guò)建立動(dòng)物模型，觀察腦梗死小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)：腦梗死小鼠腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，表明Galectin-3和MMP-9參與腦梗死的腦損傷過(guò)程。MMP-9可裂解Galectin-3，組成Galectin-3末端片段發(fā)揮作用；Galectin-3參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，Galectin-3為一種強(qiáng)大的促炎因子，可促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，并在血管內(nèi)膜損害部位聚集[18]，從而激發(fā)白細(xì)胞介素6(IL-6)和MMP-9等炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)腦梗死組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷，引起神經(jīng)功能障礙[19-20]，因此考慮Galectin-3和MMP-9可能通過(guò)促進(jìn)炎癥反應(yīng)參與腦梗死的腦損傷過(guò)程。

尼莫地平是一種鈣離子拮抗劑，可通過(guò)鈣內(nèi)流減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過(guò)改善紅細(xì)胞變形能力、降低血腦屏障通透性、改善血流變等增加腦組織供氧和供血，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞；同時(shí)尼莫地平也具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，可抑制C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎癥因子表達(dá)抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)[21-22]。本文作者對(duì)急性腦梗死大鼠給予尼莫地平發(fā)現(xiàn):尼莫地平可降低小鼠Longar評(píng)分和mNSS，縮小腦梗死體積，降低腦組織含水量，降低腦組織中Galectin-3和MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平，表明尼莫地平對(duì)急性腦梗死小鼠的損傷腦組織具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與尼莫地平下調(diào)Galectin-3和MMP-9水平抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。尼莫地平可能通過(guò)下調(diào)Galectin-3抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，并抑制其在血管內(nèi)膜損害部位聚集，從而抑制Galectin-3對(duì)MMP-9等炎性因子的誘導(dǎo)作用，降低MMP-9等炎癥因子水平，從而抑制腦梗死組織炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)損傷腦組織的保護(hù)作用。