舒血寧注射液對急性腦梗死大鼠腦組織的保護作用及其機制

焦光美，單海雷，張曉璇，趙 亮，竇志杰，康玲伶，馬 征，孫艷軍，楊 寧

(承德醫學院附屬醫院神經內科，河北 承德 067000)

急性腦梗死又稱為缺血性卒中，主要由于腦血管閉塞導致腦組織血液供應不足引起缺氧，導致局限性腦組織缺血性損傷，具有極高的致殘率和致死率，臨床上常表現為腦功能減退，并且出現眩暈、頭痛、偏癱和意識障礙等癥狀[1-3]。急性腦梗死由瘀血阻塞經絡引起，在中醫學上歸類于中風，一般采用祛風通絡法治療。舒血寧注射液為銀杏葉提取物，其有效成分主要為黃酮苷類、銀杏內酯和白果內酯，具有擴張血管及改善微循環的功效[4]。藥理學研究[5-6]表明：舒血寧注射液具有改善慢性腦供血不足、降低血液黏稠度、抑制血清炎癥因子表達和改善神經功能的作用。生長分化因子 15(growth differentiation factor-15，GDF-15)和C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)是心腦血管疾病重要的血清標記物，能夠調控細胞反應，對心腦血管疾病的診斷有重要臨床意義[7]。GDF-15和CRP在機體內有明顯的組織特異性，一般情況下在腦組織中只有微量表達[8]。心肌或腦等缺血損傷能夠誘導腦組織中GDF-15和CRP表達[9]。目前國內外有關舒血寧注射液對急性腦梗死的保護作用已有相關報道，但未見其對腦組織中GDF-15和CRP表達水平影響的研究報道。本研究通過觀察舒血寧注射液對急性腦梗死大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達水平的影響，初步探討舒血寧注射液對急性腦梗死大鼠神經功能的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑50只健康SD大鼠，雄性，體質量200～250 g，8周齡，由承德醫學院提供，動物使用許可證號：SCXK(冀)2017-001，自由攝食和飲水，實驗前適應性飼養1周。舒血寧注射液(規格：每支2 mL，河北神威藥業有限公司，國藥準字Z13020796)，尼莫地平(規格：每片20 mg，濟川藥業集團有限公司，國藥準字H20000682)，GDF-15和CRP抗體(美國Santa Cruz公司)，二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)，2,3,5-氯化三苯四唑(TTC)染液(南京建成生物工程研究所)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素1β(interleukin- 1β，IL-1β)(武漢博士德生物工程有限公司)。電子天平(YP600型，上海精密儀器儀表有限公司)，全自動石蠟切片機(RM2235型，德國Leica公司)，超低溫冰箱(MDF-382E型，日本三洋公司)，光學顯微鏡和Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(日本尼康公司)，Motic B5顯微攝像系統(麥克奧迪實業集團有限公司)。

1.2 動物分組和大鼠腦梗死模型制備將50只大鼠隨機分為對照組、假手術組、模型組、尼莫地平組和舒血寧注射液組，每組10只。采用文獻[10]的方法建立大鼠急性腦梗死模型。大鼠術前禁食12 h，采用10%水合氯醛溶液(0.32 mL·kg-1)腹腔麻醉，于頸正中切口，鈍性分離大鼠皮下組織，暴露右側胸鎖乳突肌，分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，分別采用線栓法結扎頸總動脈及頸外動脈近心端。在頸總動脈遠心端剪1個小切口，將尼龍線從切口緩慢導入，松開頸內動脈夾，于頸內動脈16～17 mm處遇到阻力，長度約2 cm，用縫合線固定栓塞線，縫合皮膚，傷口外用青霉素軟膏。大鼠蘇醒后提尾時左前肢內收屈曲、右眼Horner征、爬行時向左側劃圈、爬行時向左側傾倒為造模成功。假手術組大鼠分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈后，只結扎頸外動脈；對照組大鼠不進行手術處理；舒血寧注射液組大鼠造模成功后腹腔注射舒血寧注射液(劑量為0.4 mL·kg-1，按成人日用量4 mL并采用人與動物體表面積法換算)[11],每日1次，連續給藥7 d；尼莫地平組大鼠造模后腹腔注射2.0 mg·kg-1尼莫地平。對照組、模型組和假手術組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3 各組大鼠神經功能缺損評分采用文獻[11]中的5分法對各組大鼠神經功能進行評分。正常計0分，大鼠左側前肢無法伸展計1分，大鼠左側前肢屈曲計2分，大鼠稍有向左側繞圈者計3分，大鼠向左側繞圈嚴重者計4分，大鼠行走向左側傾倒者計5分，分數越高表明大鼠神經功能缺損越嚴重。

1.4 各組大鼠腦組織含水量和相對腦梗死面積檢測采用文獻[12]的方法，各組大鼠10%水合氯醛麻醉后，迅速取腦組織，置于生理鹽水中清洗后，用濾紙吸干腦組織，立即分別稱質量，該質量為W1，然后將腦切片按組分別置于干燥的玻璃皿上，于100℃烘箱中烘干，室溫放涼后稱質量，計為W2，根據2次稱質量結果計算腦組織含水量。腦組織含水量=(W1-W2)/W1×100%。將腦組織切成2 mm厚冠狀切片，以2% TTC于37℃水浴中染色5～10 min后，采用4%多聚甲醛緩沖液固定，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。采用顯微攝像系統檢測各組大鼠相對腦梗死面積。相對腦梗死面積=[對側腦半球面積-(缺血腦半球面積-梗死面積)/對側腦半球面積]×100%。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腦組織病理形態表現取每組大鼠腦皮層置于4℃生理鹽水沖洗，切成2 mm厚冠狀切片，以2% TTC于37℃水浴中染色5～10 min后，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，進行常規石蠟包埋，切片，片厚約4 μm，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠腦組織病理形態表現。

1.6 免疫組織化學法檢測各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達水平取各組大鼠腦組織切片，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，連續切片，厚度為4 μm，常規脫蠟脫水，3%H2O2孵育15 min，PBS溶液沖洗，置于枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復5 min，冷卻至室溫，加入一抗，4℃過夜，PBS沖洗，加入二抗，37℃下孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色5 min，蘇木素復染1 min，常規脫水透明，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察，陽性細胞呈棕褐色。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對數據進行分析，以數字圖像上計數單位細胞中GDF-15和CRP陽性細胞數表示GDF-15和CRP表達水平。

1.7 ELISA法檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平將腦組織切片制成勻漿后，置于96孔板中，分別加入100 μL標準品、樣品稀釋液和待測樣品，于37℃下放置60 min，洗滌，加入TNF-α、IL-6和IL-1β抗體100 μL，37℃ 放置60 min，洗滌，加入HRP標記的親和素100 μL，于37℃放置30 min，洗滌，加入100 μL底物工作液(TMB)，37℃避光放置15 min，加入100 μL終止液。于酶標儀450 nm波長處檢測吸光度(A)值，A值越高表明TNF-α、IL-6和IL-1β水平越高，根據標準曲線檢測各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，單位為ng·L-1。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能評分對照組和假手術組大鼠未發現神經功能缺損癥狀，計0分。與模型組比較，給藥第3和7天時尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠神經功能缺損評分明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分

GroupScore of neurological impairment(t/d)137Control000Sham operation000Model4.6±0.34.3±0.13.1±0.2Nimodipine4.3±0.43.3±0.2*2.0±0.4*Shuxuening Injection4.3±0.33.5±0.1*2.3±0.4*

*P<0.05 compared with model group.

2.2 各組大鼠腦組織含水量和相對腦梗死面積與對照組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平和舒血寧注射液組大鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。對照組和假手術組大鼠無腦梗死，因此相對腦梗死面積計為0；與模型組比較，尼莫地平和舒血寧注射液組大鼠腦相對梗死面積明顯減小(P<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠腦組織病理形態表現對照組和假手術組大鼠大腦皮層結構完整，皮層神經元排列整齊有序，層次清晰。與假手術組比較，模型組大鼠神經細胞胞漿和胞核皺縮，輕度腫脹，神經細胞與毛細管周圍間隙較大，間質疏松。與模型組比較，舒血寧注射液組大鼠腦皮質神經細胞和神經膠質細胞腫脹程度及間質疏松程度均減輕，病理形態表現與尼莫地平組相近。見圖1(插頁七)。

表2 各組大鼠腦組織含水量和相對腦梗死面積

GroupWater content in brain tissueRelative cerebral infarction area Control68.73±5.260Sham operation70.02±4.130Model83.64±6.37*△38.98±4.52 Nimodipine72.46±8.93#17.53±4.66#Shuxuening Injection75.25±4.18#20.13±3.04#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

2.4 各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達水平對照組和假手術組大鼠腦組織中有少量GDF-15和CRP陽性表達。與對照組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠腦組織中GDF-15表達水平明顯升高(P<0.05)，CRP表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4、圖2(插頁七)和圖3(插頁七)。

表4 各組大鼠腦組織中GDF-15和CRP表達水平

GroupGDF-15CRPControl7.35±2.616.41±2.11Sham operation8.02±2.146.67±2.78Model24.65±2.04*△19.67±2.54*△Nimodipine28.41±3.59△#12.61±2.04#Shuxuening Injection33.45±4.99△#13.56±3.45#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

2.5 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平與對照組和假手術組比較，模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組和舒血寧注射液組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見表5。

3 討 論

急性腦梗死是常見的腦血管疾病，具有高發病率、高致殘率和高致死率等特點，給患者健康和生活質量帶來了極大威脅，且增加了患者家庭經濟負擔和社會負擔，該病近年來呈現年輕化趨勢。目前臨床上對急性腦梗死的治療主要采用抗凝、溶栓、降纖和抗血小板等方法，但目前尚無確切有效的治療方法[13-14]。舒血寧注射液中的銀杏內酯和白果內酯具有擴張血管及改善微循環的功效，因而該藥具有通絡散瘀、擴張血管及降低血黏度的功效，對急性腦梗死有顯著療效[15-17]。研究[6，18-19]表明：舒血寧注射液能改善患者腦部血供、降低血黏度和血漿纖維蛋白原水平、抗血小板聚集、抗炎癥損傷、抗氧化應激、調節腦血管血液動力學參數和神經功能相關因子平衡。

表5 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平

GroupIL-6IL-1βTNF-αControl124.80±11.56108.84±9.5234.61±4.02Sham operation134.35±15.36112.46±10.4635.16±5.09Model223.85±22.52*△204.80±21.65*△62.31±5.47*△Nimodipine143.82±17.43#115.34±12.50#37.40±4.89#Shuxuening Injection167.47±20.62#121.46±13.75#38.21±3.32#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with model group.

GDF-15作為神經元中的神經營養因子，其水平動態變化可反映腦血管病的發生發展，反映腦損傷的嚴重程度，對腦血管疾病具有指導意義[20]。CRP參與腦組織炎癥反應的調節，在急性腦梗死發病過程中起重要作用[21]。IL-6和IL-1β在機體免疫應答、骨髓造血和炎癥反應中發揮重要作用，腦缺血后腦組織中IL-6 和IL-1β表達水平升高，且在缺血再灌注后期仍維持在較高水平[22-23]。TNF-α主要作用是提高機體免疫和促進組織愈合，是具有多效性作用的促炎性細胞因子，可促進腦缺血損傷區黏附分子的表達和炎性細胞的浸潤[24-25]。本研究結果顯示：大鼠造模后出現明顯的神經功能障礙，舒血寧注射液組大鼠神經功能評分較模型組明顯降低，腦組織含水量明顯降低，相對腦梗死面積明顯減小，說明舒血寧注射液能夠明顯改善神經功能缺損，對腦梗死引起的神經損傷有明顯的保護作用，與相關報道[12]一致。與模型組比較，舒血寧注射液組大鼠腦組織中CRP表達水平降低， TNF-α、IL-6 和IL-1β水平降低，GDF-15表達水平明顯升高，說明舒血寧注射液能夠通過上調GDF-15表達和抑制CRP表達從而減輕腦組織炎性反應程度。

綜上所述，舒血寧注射液能通過上調腦組織中GDF-15表達、抑制CRP表達和降低細胞炎性因子水平改善急性腦梗死大鼠神經功能，減少腦梗死面積，對急性腦梗死大鼠神經功能起保護作用。