慢性HBV感染者外周血單個核細胞中miR-194-5p和MagT1表達水平檢測及其意義

林曉娥，吳景華，黎 潔，劉 洋，諶曉楠，祝朝前，李廣平

(1. 河北省唐山市工人醫院檢驗科，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學附屬醫院檢驗科，河北 唐山 063000；3. 河北省唐山市工人醫院肝膽外科，河北 唐山 063000)

鎂離子(Mg2+)轉運蛋白1(magnesium transporter protein 1，MagT1)是一種高度特異性Mg2+通道，對細胞中Mg2+穩態維持起重要的調控作用。Mg2+作為細胞內第二信使，參與能量代謝和蛋白質合成等600多種酶促反應，在免疫細胞免疫應答和免疫信號轉導中發揮重要作用[1]。研究[2-3]顯示：MagT1缺失或突變介導的Mg2+內流障礙引起的T淋巴細胞功能障礙可導致一種原發性免疫缺陷疾病即X連鎖Mg2+通道缺陷聯合免疫缺陷病(X-linked immunodeficiency with magnesium defect, Epstein-Barr virus infection, and neoplasia，XMEN)。DIAO等[4]研究顯示：MagT1表達下調介導的Mg2+紊亂可導致HBV感染者體內CD8+ T淋巴細胞和NK細胞功能耗竭。前期研究[5]也證實：CD8+T淋巴細胞中MagT1表達下調所致的Mg2+內流障礙與慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染者CD8+T淋巴細胞功能耗竭有關聯，提示MagT1是調節機體免疫反應的關鍵分子，其表達異常可能導致多種免疫疾病的發生發展。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～25 nt的非編碼RNA，其主要通過與靶基因3′-非編碼區(untranslated regions，UTR)結合，引起靶基因mRNA降解或抑制其翻譯而發揮生物學功能。研究[6]顯示：miR-194-5p在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者血清中呈較高水平，并且在肝癌細胞胞外囊泡中高表達。NIELSEN等[7]研究顯示：體外采用HBV持續感染可誘導肝母細胞癌HepG2細胞中miR-194-5p表達持續上調，并介導細胞抗凋亡能力增強，表明miR-194-5p可能在HBV相關肝臟疾病中高表達，并可能導致疾病進一步惡化。有關MagT1和miR-194-5p在慢性HBV感染者免疫細胞中的表達水平及其可能的靶向調控關系目前報道較少。本研究通過檢測慢性HBV感染者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中MagT1和miR-194-5p表達水平，探討二者的相互作用機制及其對CHB發生發展的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2016年6月—2018年10月在河北省唐山市工人醫院肝膽外科門診就診的120例未經抗病毒治療的HBV感染者作為研究對象，其中CHB患者(CHB組) 80例，HBV攜帶者(HBV攜帶組)40例，其中男性22例，女性18例，平均年齡(40.65±10.88) 歲。HBV感染者納入標準：診斷均符合中華醫學會肝病學分會和中華醫學會感染病學分會聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中診斷標準[8]，且患者無其他特殊病史；排除標準：兼有其他類型肝炎病毒感染者、有抗病毒治療史者及有肝病史者。根據慢性肝炎病情分類標準[9]將CHB組患者分為輕中度CHB組和重度CHB組，每組各40例。輕中度CHB組中男性21例，女性19例，平均年齡(41.15±9.14)歲；重度CHB組中男性23例，女性17例，平均年齡(40.96±11.01)歲。同時選取健康體檢者40人作為健康對照組，其中男性20人，女性20人，平均年齡(40.27±13.21)歲。本研究獲得河北省唐山市工人醫院倫理道德委員會批準，所有受試者均知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 細胞、質粒、主要試劑和儀器293T細胞購自中國典型培養物保藏中心細胞庫。MagT1-3′UTR野生型和突變型質粒及miR-194-5p mimic及miR-194-5p NC質粒均由廣州銳博生物科技有限公司提供。聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque) 溶液購自廣東省廣州市美景生物科技有限公司，SYBR?Green PCR Kit 購自日本TaKaRa公司，程序性死亡受體1(programmed death receptor 1,PD-1)和自然殺傷細胞受體2群D分子(natural killer cell receptor 2 group D molecule,NKG2D)、兔抗人MagT1多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Abcam公司，小鼠抗人CD3-APC抗體、小鼠抗人CD3-FITC抗體、小鼠抗人CD279 (PD-1)-PE抗體和小鼠抗人CD314 (NKG2D)-APC抗體均購自美國BD公司。Mag-Fura2-AM熒光探針購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Dual-Luciferase?報告系統購自美國Promega公司，全自動生化分析儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，C6流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 PBMCs分離采集患者和健康體檢者的空腹外周血，加入肝素鈉抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMCs，取中間灰白色層，PBS洗滌2次后留取PBMCs備用。

1.4 RT-PCR法檢測各組研究對象PBMCs中miR-194-5p和MagT1 mRNA表達水平取各組PBMCs細胞，采用TRIzol法提取總RNA，定量后取2 μg逆轉錄合成cDNA。取2 μL逆轉錄產物作為模板，加入相應引物和10 μL SYBR?Green PCR Kit的試劑之一SYBR Green Master Mix進行擴增反應。miR-194-5p mRNA表達水平檢測以U6作為內參，MagT1 mRNA表達水平檢測以GAPDH作為內參。引物序列：miR-194-5p，Forward 5′-ACACTCCAGCTGGGTGTAACAGCAA-CTCC-3′，Reverse 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6，Forward 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，Reverse 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；MagT1，Forward 5′-ACCTAGCCGGAGCAAAGTTTC-3′，Reverse 5′-CGTCGCAAACG-ATGAGCAG-3′；GAPDH，Reverse 5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，Reverse 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTC-3′。PCR反應條件：94℃預變性60 s，94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，共40個循環。采用2-ΔΔCT法計算各組研究對象PBMCs中miR-194-5p和MagT1 mRNA表達水平。

1.5 Western blotting法檢測各組研究對象PBMCs中MagT1蛋白表達水平取各組PBMCs，加入適量RIPA全蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1離心25 min，收集上清，檢測蛋白濃度。取30 μg各組蛋白進行上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入MagT1抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜。次日，PBS洗滌后加入HRP標記的二抗，室溫孵育30 min，顯影，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行條帶灰度分析，計算MagT1蛋白表達水平。MagT1蛋白表達水平=MagT1蛋白條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值。

1.6 外周血和PBMCs中Mg2+水平檢測取外周血，分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血清中Mg2+水平；取各組研究對象的PBMCs，采用HEPES緩沖液(不含Mg2+和Ca2+)重懸細胞并計算，以1.5×106mL-1的細胞密度加入3 μmol·L-1熒光探針Mag-Fura4-AM溶液，于37℃條件下避光孵育30 min，終止探針孵育，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，加入500 mL HEPES緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.7 流式細胞術檢測各組研究對象PBMCs中CD8+T淋巴細胞表面分子PD-1和NKG2D表達水平取各組PBMCs，調整細胞濃度至1.5×105mL-1，取0.5 mL細胞懸液，依次加入CD3-APC抗體、CD3-FITC抗體、PD-1-PE抗體或NKG2D-APC抗體，混勻后避光孵育30 min，中止反應后1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，500 mL PBS重懸細胞，采用流式細胞術檢測，采用CD3+CD8+雙陽性細胞群圈門，以CD3+CD8+PD-1+細胞群和CD3+CD8+NKG2D+細胞群百分比表示PD-1和NKG2D表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗檢測293T細胞中相對熒光素酶活性利用 Targetscan miRNA靶基因預測軟件預測miR-194-5p在MagT1 mRNA上的結合位點，構建野生型(WT)和突變型(MUT)MagT1-3′UTR的報告基因質粒，分別與miR-194-5p mimic 和miR-NC質粒轉染至293T細胞中培養48 h,作為miR-194-5p mimic 組和miR-NC組。按照Dual-Luciferase?報告系統說明書操作，檢測2組293T細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光強度，計算293T細胞熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶熒光強度/海腎熒光素酶熒光強度。

2 結 果

2.1 各組研究對象PBMCs中miR-194-5p mRNA和MagT1 mRNA及蛋白表達水平與健康對照組比較，HBV攜帶組、輕中度CHB組和重度CHB組患者PBMCs中miR-194-5p mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，MagT1 mRNA和蛋白表達水平則明顯降低(P<0.05)；重度CHB組患者PBMCs中miR-194-5p mRNA表達水平明顯高于HBV攜帶組和輕中度CHB組，而MagT1 mRNA和蛋白表達水平則明顯低于HBV攜帶組和輕中度CHB組(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各組研究對象PBMCs中miR-194-5p和MagT1 mRNA表達水平

GroupmiR-194-5p mRNAMagT1 mRNAHealthy control1.00±0.001.00±0.00HBV carrier2.91±0.12*0.72±0.57*Mild-moderate CHB5.68±0.41*△0.48±0.39*△Severe CHB8.31±0.62*△#0.16±0.09*△#

*P<0.05 compared with healthy control group;△P<0.05 compared with HBV carrier group;#P<0.05 compared with mild-moderate CHB group.

2.2 各組研究對象外周血和PBMCs中Mg2+水平各組研究對象外周血中Mg2+水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。HBV攜帶組、輕中度CHB組和重度CHB組患者PBMCs中Mg2+水平均明顯低于健康對照組(P<0.05)。重度CHB組患者PBMCs中Mg2+水平明顯低于HBV攜帶組和輕中度CHB組(P<0.05)。見表2。

2.3 各組研究對象PBMCs中CD8+T淋巴細胞表面分子PD-1和NKG2D表達水平HBV攜帶組、輕中度CHB組和重度CHB組患者PBMCs中CD8+T淋巴細胞表面分子PD-1表達水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)，而NKG2D表達水平均明顯低于健康對照組(P<0.05)。重度CHB組患者PBMCs中PD-1表達水平明顯高于HBV攜帶組和輕中度CHB組(P<0.05)，NKG2D表達水平明顯低于HBV攜帶組和輕中度CHB組(P<0.05)。見表3。

A:Electrophoregram;Lane 1: Healthy control group; Lane 2: HBV carrier group; Lane 3: Mild-moderate CHB group; Lane 4: Severe CHB group.B:Histogram;1:Healthy control group;2:HBV carrier group;3:Mild-moderate CHB group;3:Severe CHB group.*P<0.05 compared with healthy control group;△P<0.05 compared with HBV carrier group;#P<0.05 compared with mild-moderate CHB group.

圖1 各組研究對象PBMCs中MagT1蛋白表達情況

Fig.1 Expressions of MagT1 protein in PBMCs of subjects in various groups

表2 各組研究對象外周血和PBMCs中Mg2+水平

GroupPeripheral bloodPBMCsHealthy control924.21±87.36427.22±67.14HBV carrier907.55±96.24351.78±53.33*Mild-moderate CHB914.87±90.19269.93±40.16*△Severe CHB899.04±84.37107.78±27.29*△#

*P<0.05 compared with healthy control group;△P<0.05 compared with HBV carrier group;#P<0.05 compared with mild-moderate CHB group.

2.4 2組293T細胞中熒光素酶活性通過Targetscan生物信息學軟件預測，結果顯示：MagT1可能是miR-194-5p的靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果顯示：與野生型(WT)MagT1-3′UTR的報告基因質粒(MagT1-WT)結合后，與miR-NC組比較，miR-194-5p mimic 組293T細胞中熒光素酶活性降低(P<0.05)，表明miR-194-5p過表達可明顯降低野生型MagT1 3′-UTR報告基因的熒光素酶活性；與突變型(MUT)MagT1-3′UTR的報告基因質粒(MagT1-WT)結合后，與miR-NC組比較，miR-194-5p mimic 組293T細胞中熒光素酶活性變化不明顯，表明miR-194-5p過表達對突變型MagT1 3′-UTR報告基因的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。見圖2。

表3 各組研究對象PBMCs中CD8+T淋巴細胞表面分子PD-1和NKG2D表達水平

GroupPD-1NKG2DHealthy control7.24±0.9531.22±2.54HBV carrier11.17±1.07*24.38±1.38*Mild-moderate CHB17.93±1.61*△15.79±1.72*△Severe CHB24.65±2.18*△#8.11±0.87*△#

*P<0.05 compared with healthy control group;△P<0.05 compared with HBV carrier group;#P<0.05 compared with mild-moderate CHB group.

A:Binding site of miR-194-5p to MagT1-3′UTR; B：Histogram of luciferase activity.*P<0.05 compared with miR-NC group.

圖2 2組293T細胞中熒光素酶活性

Fig.2 Activities of luciferase in 293T cells in two groups

3 討 論

HBV是一種嗜肝DNA病毒，具有較強的復制能力和感染能力，HBV感染屬于全球性公共衛生問題。截至2017年，我國HBV感染人數超過9 000萬，居世界首位，其防控與治療形勢不容樂觀。研究[10]顯示：10%～30% CHB患者會發展成肝硬化，而這些肝硬化患者中又有5%～10%患者最終會轉變成肝癌。因此深入研究HBV感染所致的機體免疫功能紊亂過程中某些異常表達的分子及其相互作用機制，將會對HBV相關肝病的防控及治療起積極推動作用。

PBMCs是外周血中由多種免疫細胞組成的混合細胞群體，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞等，在機體免疫反應中發揮至關重要的作用[11-12]。機體在感染HBV后會產生保護性免疫反應，能夠及時有效地抑制HBV復制并清除HBV病毒顆粒[13]。在慢性HBV感染的過程中，機體中卻普遍存在T淋巴細胞免疫功能缺陷的現象[14-15]，進而導致肝硬化、肝功能衰竭和原發性肝癌等更為嚴重的肝臟疾病發生。研究[6]顯示：HBeAg陽性CHB患者血清中miR-194-5p水平較高， miR-194-5p表達水平與HBV DNA和HBsAg 水平呈正相關關系。NIELSEN等[7]報道顯示：HBV感染能誘導HepG2細胞中miR-194-5p表達，增強細胞抗凋亡能力。本研究結果顯示：在HBV感染患者即HBV攜帶者、輕中度CHB患者和重度CHB患者PBMCs中miR-194-5p mRNA表達水平較健康體檢者逐漸升高，說明miR-194-5p mRNA在HBV感染過程中表達異常增加，可能會參與HBV感染所致的機體免疫功能紊亂過程的調控。本研究結果顯示：在HBV攜帶者、輕中度CHB患者和重度CHB患者PBMCs中MagT1 mRNA及蛋白表達水平較健康體檢者降低。研究[3-4]表明：MagT1缺失或下調能夠導致包括HBV等多種病毒感染過程中T淋巴細胞免疫失活或功能耗竭，提示miR-194-5p有可能通過靶向MagT1參與HBV感染過程中T淋巴細胞功能紊亂的調控。本研究通過Targetscan生物信息學軟件預測及雙熒光素酶報告基因實驗證實：MagT1是miR-194-5p的靶基因。

MagT1是一種對Mg2+有高度特異性的轉運體，可調節細胞中自由Mg2+水平，Mg2+作為細胞內第二信使參與機體免疫功能的調節目前已被證實[1]。有研究[16]顯示：MagT1基因缺失介導的細胞中Mg2+水平降低可導致慢性EBV感染過程中NK和CD8+ T淋巴細胞免疫毒性降低。本研究結果顯示：慢性HBV感染者外周血中Mg2+水平與健康體檢者比較差異無統計學意義，與邵紅玲等[17]研究結果一致。但在HBV攜帶者、輕中度CHB患者和重度CHB患者PBMCs中Mg2+水平較健康體檢者均降低，與MagT1表達趨勢相吻合，說明MagT1表達下調的同時導致機體免疫細胞中Mg2+水平因內流障礙而明顯減少，進而影響免疫細胞免疫活性。此外，CD8+ T淋巴細胞是機體內清除HBV的主要免疫細胞[18-19]，然而其表面PD-1等免疫抑制分子表達增加以及NKG2D等免疫激活分子表達下調將導致其功能耗竭[20-22]。本研究結果顯示：HBV攜帶者、輕中度CHB患者和重度CHB患者外周血CD8+ T淋巴細胞表面分子PD-1表達水平升高，NKG2D表達水平降低，說明在HBV慢性感染過程中出現了CD8+ T淋巴細胞功能耗竭。

綜上所述，在CHB發展過程中miR-194-5p可能通過靶向下調MagT1表達介導Mg2+內流障礙，造成CD8+T淋巴細胞免疫活性降低，這可能是導致CHB形成的重要原因。