肝硬化超聲影像特點與患者腸黏膜炎性因子和Th1/Th2變化的關聯

許年鳳 章小華 白露 雷艾華 王宏亮

肝硬化是指慢性肝損傷導致門脈高壓和終末期肝病的再生結節周圍纖維帶的組織學發展[1]。目前正在研發能夠阻止失代償性肝硬化進展甚至逆轉肝硬化的藥物療法[2]。隨著彩色超聲儀器的普及，彩色多普勒超聲在診斷肝硬化中越來越多使用[3]。肝硬化與腸屏障功能障礙和腸道通透性增加有關。肝硬化中的腸屏障功能障礙及其相關機制具有重要的臨床意義，它與肝硬化嚴重并發癥的發生有關[4]。腸上皮由單層上皮細胞組成，緊密連接在頂端表面，似乎是決定腸道通透性的最重要因素[5]。肝硬化導致腸細胞緊密連接的顯著改變，這是腸通透性高的一個重要致病機制。黏膜屏障也依賴于上皮細胞的穩態，而上皮細胞的穩態是由細胞增殖和死亡之間的平衡決定的，后者調節腸細胞的轉換和黏膜細胞的數量。細胞因子是負責免疫系統大多數生物學效應的激素信使。T淋巴細胞是細胞因子的主要來源，T淋巴細胞有兩個主要的亞群，以細胞表面分子CD4和CD8的存在為特征。表達CD4的T淋巴細胞也被稱為輔助性T細胞。這一亞群可進一步細分為Th1和Th2，它們產生的細胞因子被稱為Th1型細胞因子和Th2型細胞因子。Th1型細胞因子傾向于產生原炎性反應，該反應負責殺死細胞內寄生蟲并使自身免疫反應持續,干擾素γ是主要的Th1細胞因子[6]。Th2型細胞因子包括IL-4、IL-5和IL-13，這些細胞因子與特應性免疫球蛋白(IgE)和嗜酸細胞反應的促進有關，也包括IL-10，后者具有更多的抗炎反應。Th2反應將抵消Th1介導的殺菌作用[7]。Th1和Th2細胞因子平衡的改變與多種免疫相關疾病的轉歸和預后密切相關。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1月至2019年1月36例患者作為研究對象。36例受檢者根據患者情況分為對照組(n=12)，由年齡和性別相匹配的健康人組成，接受上消化道內鏡檢查，沒有病理發現。代償性肝硬化(n=12)，失代償性肝硬化(n=12)。失代償性或代償性疾病的分類基于Child-Pugh分類；Child-Pugh A被分類為代償性肝硬化，Child-Pugh B或C被分類為代償性肝硬化。所有參與研究的患者都接受了上消化道內窺鏡檢查，在檢查過程中，活組織檢查從十二指腸的第二部分獲取。3組患者一般情況(年齡、體重、性別比例、體重指數)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料對比 n=12

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：性別不拘；年齡30～70歲；如果患者被診斷為肝硬化(病毒性、酒精性或其他病因)，則有資格納入本前瞻性研究。

1.2.2 排除標準：惡性腫瘤、糖尿病、風濕性疾病、腎臟疾病、胃腸道疾病(如腹腔疾病、炎癥性腸病、過去四周胃腸道出血)或腸道手術、感染包括自發性細菌性腹膜炎(過去4周)、過去4周酗酒。服用血清或尿淀粉酶升高和治療的藥物，如抗生素，皮質類固醇，非甾體類抗炎藥和抗氧化劑(維生素C和E，別嘌呤醇，N-乙酰半胱氨酸)。

1.2.3 醫學倫理學問題：所有參與研究的患者均得書面知情同意；依據臨床指南的相關原則充分保障患者的治療安全;對患者診療記錄進行保密，保護患者的隱私權。

1.3 方法

1.3.1 內毒素測定：在內窺鏡檢查之前，所有患者都要從外周靜脈進行血液取樣以測量內毒素。血液樣本在無內毒素的小瓶中收集，然后分離血漿，并在-80℃下儲存，直到處理。內毒素濃度通過定量顯色鱟-阿米巴細胞溶解物試驗(LAL，QCL-1000，Lonza，Walkersville，MD，USA)測定，并以EU/ml表示。樣品按照說明書進行處理。

1.3.2 腸道脂質氫過氧化物(looh)測定：腸道樣本在0.1 ml 10 mm磷酸鹽緩沖液(pH值7.2)中均勻化(使用微管裝)，為蛋白質定量10 μl。用0.09 ml氯仿：甲醇(2∶1，v∶v)萃取19份勻漿，離心(15 000 g，5 min)，氯仿層真空干燥，用0.25 ml甲醇溶解。

1.3.3 腸黏膜增殖和凋亡的組織病理學評價：十二指腸活檢用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，蘇木精和伊紅染色。

1.3.4 流式細胞術：細胞用合適的fitc-、藻紅蛋白或cychrome結合abs在PBS中培養30 min，其中0.1%胎牛血清和0.02 mmol/L NaN3。細胞質CTLA-4由細胞內染色確定。用5-和6-羧基氟烷二乙酸酯琥珀酰亞胺酯(CFSE；Molecular Probes，Inc.，Eugene，or)標記純化的CD4細胞。清洗后，在facscan(加利福尼亞州圣何塞市Becton Dickinson)上分析標記的細胞樣品。

1.3.5 細胞因子和生化參數：通過免疫化學發光分析測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)；化學發光分析測定白介素-6(IL-6)；cent分析IL-4；酶聯免疫測定法測定IL-10，此外，患者進行常規實驗室評估，包括凝血酶原活性、血清白蛋白、膽紅素和IgG，計算作為Th1/Th2激活替代標記物的IFN-γ/IL-10、IFN-γ/IL-4和IFN-γ/IL-13的比值。

2 結果

2.1 內毒素測定 失代償和代償組內毒素濃度較對照組明顯增高(P<0.05)。見表2。

組別內毒素對照組 1.25±0.13代償肝硬化組 4.35±2.02*失代償肝硬化組4.35±0.34*F值6.472P值0.002

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 腸道脂質氫過氧化物 失代償期肝硬化組的腸道脂質過氧化顯著增加(P<0.05)。見表3。

2.3 腸黏膜有絲分裂和凋亡活性 在每個腸黏膜標

組別looh/ml對照組 2.45±2.65代償肝硬化組 4.67±0.98*失代償肝硬化組3.25±4.67*#F值8.439P值0.006

注：與對照組比較，*P<0.05；與代償肝硬化組比較，#P<0.05

本中，通過形態學分析鑒定和計數腸上皮的有絲分裂和凋亡體。代償性和失代償性肝硬化組的黏膜有絲分裂計數明顯低于對照組(P<0.05)。細胞凋亡有增加的趨勢(P<0.05)。與對照組比較，B組和C組的有絲分裂/凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 健康受試者(A)和代償性肝硬化患者(B)腸上皮細胞有絲分裂的顯微照片(紅色箭頭，HE×200)；失代償性肝硬化患者(C)腸上皮細胞凋亡體的檢測(紅色箭頭，HE×200)

表4 腸黏膜有絲分裂計數、凋亡計數及其比值

注：與對照組比較，*P<0.05；與代償肝硬化組比較，#P<0.05

2.4 細胞因子 代償性肝硬化組和失代償性肝硬化組IL-4、IL-13、TNF-α、IL-6水平均高于對照組(P<0.05)。失代償肝硬化組TFN-γ低于對照組、代償性肝硬化組(P<0.05)，IL-4高于對照組，低于代償性肝硬化組(P<0.05)，IL-10、IL-13、TNF-α、IL-6水平均高于對照組、代償性肝硬化組(P<0.05)。見表5。

項目對照組代償肝硬化組失代償肝硬化組F值P組IFN-γ(pg/ml)6.25±7.625.64±5.605.09±2.56*#0.3620.000IL-4 (ng/ml)0.93±1.621.79±5.30*1.15±1.34*#3.1650.000IL-10 (pmol/L)11.50±26.6710.75±5.9513.69±10.11*#13.519 0.001IL-13 (pg/ml)10.76±21.3021.68±28.07*25.38±34.01*#6.858 0.033TNF-α (pg/ml)4.80±1.826.31±2.20*8.09±4.69*#12.971 0.002IL-6 (pg/ml)5.89±4.307.19±4.74*9.96±12.81*#4.5150.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與代償性肝硬化組比較，#P<0.05

3 討論

肝硬化是臨床常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損害[8]。肝硬化反復證實腸道通透性增加，腸上皮似乎是決定腸通透性的最重要因素，在肝硬化患者的腸上皮中，TJ相關蛋白occludin和claudin-1的表達下降，在細胞水平上，促進了腸通透性的增加。腸屏障功能完整性與腸上皮細胞增殖和凋亡有關。腸上皮細胞增殖顯著減少，凋亡趨勢增加。肝硬化患者腸道的增殖/凋亡率明顯降低。在代償性和失代償性肝硬化患者中同時檢測到黏膜細胞的變化，而差異無統計學意義(P>0.05)。2組肝硬化患者存在腸屏障功能障礙和顯著內毒素血癥。腸道屏障功能障礙和腸道通透性高發生在肝硬化的早期。在失代償性疾病患者中觀察到的腸道源性內毒素血癥的更大程度可歸因于導致該組腸道屏障紊亂的其他因素，肝硬化與氧化應激密切相關[9]。在肝硬化患者的血液和肝組織中檢測到氧化應激。氧化應激介導的肝線粒體功能障礙。在失代償性疾病中觀察到，失代償性疾病是一種重要的氧化應激啟動子，通過激活全身炎性反應，并在肝病中耗盡肝細胞抗氧化防御[10，11]。代償性肝硬化患者的腸道細胞發生了改變。沒有紅色同時出現的腸道高氧化應激，表明其他因素，如全身內毒素血癥，可能與肝病早期腸道黏膜異常有關。然而，在失代償性肝硬化中，腸道氧化性很高。通過抑制細胞增殖和破壞緊密連接結構復合體，應激可能在進一步損害黏膜屏障完整性方面發揮了關鍵作用。

在研究中，患者的IFN-γ水平仍高于對照組，而IL-13和IL-10水平也較高。IL-13是主要由Th-2細胞產生。IL-13促進纖維生成，但也刺激基質金屬蛋白酶。它還具有多種抗炎功能[12]。IL-10主要由2型巨噬細胞、單核細胞、調節性T淋巴細胞和B細胞產生。作為一種負性免疫調節細胞因子，對Th1和Th2淋巴細胞、單核吞噬細胞和自然殺傷細胞具有抑制作用[13，14]。因此，發現患者的IL-13和IL-10水平可能導致免疫調節作用[15，16]。患者的IFN-γ水平也高于對照組，表明Th1淋巴細胞活性增加。

總之，研究表明肝硬化與腸上皮內穩態的顯著改變有關，通過減少黏膜增殖和增殖/凋亡率來證明。失代償性疾病與高水平的腸道氧化應激有關?；謴湍c上皮內穩態和減少腸氧化應激的治療劑，如腸免疫營養(谷氨酰胺)、益生菌、抗氧化劑和腸道調節肽(蛙皮素、神經降壓素)，可能對肝硬化患者具有潛在價值。在肝硬化患者中，Th1細胞因子，如IFN-γ，在主要Th2衍生細胞因子IL-4水平較低的情況下升高。IL-10是一種抗炎性細胞因子，它的產生與肝功能損害有關。與IL-4相比，肝硬化患者的IL-13增加。盡管由Th2細胞產生，其他類型的細胞也分泌這種細胞因子，它除了促進纖維生成外，還與IL-10一起發揮免疫調節作用。因此，在肝硬化患者中，Th1活性增加，同時IL-10和IL-13水平增加。