高效降解氨氮的芽孢桿菌篩選及發酵條件優化

張冠根，陳鵬程，鄭璞*，吳丹，喬慧，張文宜，蔣速飛

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 2(中國水產科學院淡水漁業研究中心，江蘇 無錫，214081)

目前對枯草芽孢桿菌高密度發酵的研究較多，產芽孢量也較高，可達到7×1010CFU/mL[6]。但有關解淀粉芽孢桿菌產芽孢發酵報道較少，REN等[7]通過優化培養基的碳源、氮源、無機鹽，產芽孢數可達到 8.05×109CFU/mL，為目前所報道的最高產芽孢量。

本文利用以(NH4)2SO4為唯一氮源的選擇性培養基，采用96孔板高通量篩選方法，在淤泥中篩選出1株可快速去除氨氮的解淀粉芽孢桿菌菌株。考察了它的脫氮性質，并優化發酵產芽孢的條件。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

實驗樣品：江南大學池塘內土壤(N31°28′47″，E120°15′59″)。

孔板培養基(g/L)：葡萄糖3.75，(NH4)2SO40.25，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

氨氮培養基(g/L)：葡萄糖3.75， (NH4)2SO40.5，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

亞硝酸氮培養基(g/L)：葡萄糖3.75，NaNO20.49，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

優化發酵培養基(g/L)：葡萄糖12.0，蛋白胨15，酵母粉15，KH2PO40.8，MnCl20.1，NaCl 1，CaCl20.1，pH 7。

培養基1(g/L)：酵母粉2，大豆蛋白粉4，酵母浸膏2，糖蜜2，玉米蛋白粉1，KH2PO40.05，MgCO30.05，CaCO30.3，NaCl 0.03，pH 7.0。

培養基2(g/L)：葡萄糖17.51，酵母粉 9.88，CaCl22.11，pH 7。

培養基3(g/L)：玉米粉3，糖蜜10，豆粕粉10，魚粉10，K2HPO42，Na2HPO42，MgSO40.5，MnSO40.5，pH 7.0。

培養基4(g/L)：乳糖10，蛋白胨7.45，NaCl 5，MgSO4·7H2O 2.46，CaCl21.22，K2SO40.087，pH 7。

培養基5(g/L)：麩皮15，豆粕15，NaCl 5，CaCO30.2，MnSO4·H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。

培養基6(g/L)：葡萄糖36.0，大豆蛋白胨15，酵母粉18，玉米漿12，KH2PO40.8，MnCl20.1，NaCl 1，CaCl20.1，pH 7。

1.2 實驗內容及方法

1.2.1 菌株篩選

將采集的土壤按30 g/L的質量濃度接種于(NH4)2SO4為唯一氮源的富集培養基[8]中，37 ℃、110 r/min進行富集馴化培養2 d。培養結束后，將菌液稀釋至10-1～10-9，取合適濃度的稀釋液0.1 mL在富集培養基平板上進行涂布，37 ℃培養箱中培養3 d后用牙簽將獲得的單菌落接種于裝有1 mL孔板培養基的96深孔板中，30 ℃，110 r/min搖床培養48 h。培養完成后將96深孔板于3 000 r/min 下離心15 min，對上清液中剩余氨氮濃度進行測定，對培養基中剩余氨氮濃度較低的菌株做進一步篩選。

將初篩所得菌株接種于氨氮培養基，110 r/min，30 ℃培養24 h后作為種子液以3%的接種量分別接種于氨氮培養基，30 ℃，110 r/min進行培養，每5 h取發酵液，10 000 r/min離心2 min，測定上清液中的氨氮含量，計算氨氮的去除率，保存氨氮降解率最高的菌株。

(1)

式中：C0,初始氨氮濃度;C1,剩余氨氮濃度。

1.2.2 菌株鑒定

形態學鑒定：觀察LB平板上的菌落形態及表面特征，進行革蘭氏染色以及芽孢染色。

生理生化鑒定：參照文獻[9]。

分子鑒定：在LB培養基中，30 ℃、110 r/min培養過夜，細菌DNA試劑盒提取優選菌株的基因組DNA。按照文獻[10]所述方法通過16S rDNA基因分析鑒定分離的菌株，將PCR產物測序結果在NCBI網站上進行比對，利用MEGA7.0軟件構建進化樹。

1.2.3 菌株的脫氮性質研究

1.2.3.1 氨氮以及亞硝酸鹽的去除途徑

將菌株分別接種于氨氮培養基、亞硝酸氮培養基，30 ℃，110 r/min培養24 h后作為種子液以3%的接種量分別接種于相應培養基，30 ℃，110 r/min培養，每隔 4 h取樣，檢測培養液中氨氮、亞硝態氮、硝酸鹽濃度以及菌濃OD600。

1.2.3.2 氨氮耐受性研究

將菌株接種于氨氮培養基，30 ℃，110 r/min培養24 h后作為種子液以3%的接種量接種于氨氮濃度分別設置為100、200、500、800、1 000 mg/L 氨氮培養基，30 ℃，110 r/min培養24 h后測定氨氮降解率以及菌體濃度OD600。

1.2.3.3 有機氮存在下菌株對氨氮的降解情況

將菌株接種于氨氮培養基，30 ℃，110 r/min培養24 h后作為種子液以3%的接種量接種于胰蛋白胨質量濃度分別設置為0、0.8、1.6、3.2、6.4 g/L的氨氮培養基，30 ℃，110 r/min培養24 h后測定氨氮降解率。

1.2.4 菌株的高密度產芽孢發酵

1.2.4.1 初始發酵培養基篩選

將斜面保存的菌株用接種環接入LB培養基，30 ℃，110 r/min培養12 h后，以5%的接種量分別接入培養基1～6[11-16]，37 ℃，110 r/min培養36 h后取樣測定菌體濃度(OD600)以及芽孢數。

1.2.4.2 搖瓶發酵培養基優化

將初始發酵培養基中的氮源改為蛋白胨15 g/L，酵母膏15 g/L，同時碳源改為分別添加3、6、12、24 g/L的葡萄糖，將初始發酵培養基中的碳氮比(質量比)分別設置為0.33、0.67、1.32、2.64。B4斜面上挑取1環菌接入初始發酵培養基，30 ℃，110 r/min培養12 h后，以5%的接種量分別接入不同碳氮比(質量比)的發酵培養基中，37 ℃，110 r/min培養36 h后取樣測定菌體濃度以及芽孢數。

1.2.4.3 3 L發酵罐葡萄糖補料發酵

于斜面上挑取1環菌接入優化發酵培養基，110 r/min，30 ℃培養12 h，按5%的接種量接入裝有優化培養基的發酵罐。發酵參數：溫度37 ℃，轉速400 r/min，通氣量1.0 vvm，裝液量1.5 L。用4 mol/L NaOH維持發酵液pH 6.5～7.0。初始葡萄糖耗盡后，開始進行葡萄糖的補料，補料速度分別設置為10以及20 g/(L·h)，菌體濃度達到最高后停止補料，補料結束后不再調節pH，發酵過程中每2 h取樣測定菌體濃度(OD600)以及記錄pH和溶氧變化，24 h后取樣測定芽孢數。

1.2.5 所制備菌劑對模擬養殖水體中氨氮的降解

為模擬不同氨氮濃度養殖水體，取自來水分別加入不同量的NH4Cl，使氨氮質量濃度分別為1、10、20、50 mg/L，另外對應加入葡萄糖使水中m(碳)∶m(氮)=10∶1。取所制備的B4菌劑，分別投入裝有30 mL配制好的不同氨氮質量濃度為1、10、20、50 mg/L水體的250 mL搖瓶中，使菌株B4終濃度均為105CFU/mL，30 ℃，110 r/min搖瓶培養48 h，每12 h取樣測定氨氮質量濃度。

1.2.6 檢測方法

氨氮濃度的測定采用靛酚藍比色法[17]；亞硝態氮的濃度測定采用N-乙二胺分光光度法[18]；硝酸氮測定采用紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)；芽孢計數方法為：將發酵液置于80 ℃水浴10 min以殺死不能形成芽孢的活菌后，采用平板涂布法(GB 20287—2006)進行芽孢計數。

1.2.7 數據分析

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的高通量初篩

氨與苯酚和次氯酸鈉在酸性條件下，經亞硝基鐵氰化鈉催化生成藍色的靛酚，利用這一原理建立了96孔板高通量篩選的方法。樣品經富集、分離、純化得到428顆單菌落，經過48 h培養，其中6株菌可將孔板培養基中的50 mg/L的氨氮完全去除，分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6。

2.1.2 菌株的搖瓶復篩

對初篩所獲得的菌株每隔5 h進行氨氮殘余量的測定(表1)。6株菌中B4在15 h時就幾乎完成了氨氮的去除，氨氮去除速度為5.93 mg/(L·h)，高于一些假交替單胞菌Pseudoalteromonassp.2906[<1 mg/(L·h)][19]以及好氧反硝化菌Rhodococcussp. CPZ24[2.5 mg/(L·h)][20]，最終氨氮去除率為92.32%，展示出了較高效的氨氮去除能力，因此選擇B4菌株作進一步實驗。

表1 六株菌的氨氮去除率Table 1 Ammonia degradation rate of six strains

注: 同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 菌株的鑒定

菌落在LB平板生長初期為乳白色，后變為黃色，不透明，表面暗且較粗糙，邊緣不規則呈樹枝狀像四周伸展，菌落中心黏液呈圈狀，革蘭氏染色陽性，有芽孢。硝酸鹽反應、淀粉水解、V-P反應、丙二酸利用、檸檬酸鹽利用、接觸酶反應、D-果糖產酸、明膠液化、厭氧生長均為陽性；卵磷脂酶反應、吲哚實驗、苯丙氨酸脫氫酶實驗均為陰性。將B4的16S rDNA測序結果在NCBI網站進行比對，利用MEGA7.0軟件以Neighbor-joining法構建系統進化樹[21]，并結合其生理生化實驗，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖1 基于菌株B4的16srDNA構建的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of strain B4

2.2 菌株的脫氮特性研究

2.2.1 菌株對氨氮與亞硝酸鹽的去除特性

菌株B4對氨氮的降解過程中，氨氮濃度伴隨菌體濃度的增加逐漸減少，表明菌株的生長與氨氮去除同步(圖2-a)。20 h以后，菌液濃度呈下降趨勢，氨氮濃度不再下降，并且整個生長過程中并無亞硝酸鹽或硝酸鹽產生，說明菌株并不進行硝化作用而是通過銨鹽同化以合成細胞物質。

亞硝酸氮與氨氮去除過程略有差別(圖2-b)，在亞硝酸氮為氮源的培養基中，菌株B4的生長延滯期更長，相同的是，亞硝酸氮濃度也是在菌株的指數生長期內快速降低，經過20 h培養，培養基中50 mg/L的亞硝酸氮被完全去除。同時在B4生長過程中未檢測到氨氮的存在，這說明B4通過硝酸鹽同化作用吸收亞硝酸氮。

a-菌株的生長與氨氮去除關系；b-菌株生長與亞硝酸鹽去除關系圖2 B4對氨氮和亞硝酸鹽的去除特性Fig.2 Degradation and growth of ammonia and nitrite by strain B4

2.2.2 氨氮耐受性研究

相比于氨氮質量濃度為100 mg/L，氨氮質量濃度增加至200、500、800、1 000 mg/L時，氨氮去除率有所下降,分別為49.91%、21.90%、20.06%、27.41%(圖3)，不過氨氮濃度增加后，B4可正常生長，菌體濃度有所提高，并且24 h內去除了更多的氨氮，有更快的氨氮降解速度。不同氨氮濃度下的菌體生長以及氨氮去除速率表明B4可適應高濃度氨氮的環境，具有處理高濃度氨氮工業廢水的潛在應用價值。

圖3 B4對不同濃度氨氮耐受性Fig.3 B4 tolerance to different concentrations of ammonia

2.2.3 有機氮存在下菌體對氨氮的降解情況

實際養殖體水體存在多種含氮有機物。本實驗以胰蛋白胨作為含氮有機物代表，研究了菌體在復雜有機氮環境中的除氨氮能力。由圖4可知，胰蛋白胨質量濃度在3.2～6.4 mg/L時，培養基中的氨氮沒有被去除，而且濃度高于初始值，這可能是高濃度的有機氮抑制了細菌對無機氮的吸收，同時細菌的氨化作用產生了更多的氨氮；在胰蛋白胨質量濃度≤3.2 mg/L時，胰蛋白胨含量的增加對氨氮去除率有一定的影響，不過仍保持著較高的氨氮去除率。由此可知，在一定濃度的有機氮存在下，菌株B4仍能對水體中的氨氮進行有效地去除，這有利于其在水產養殖中的應用。

圖4 不同胰蛋白胨質量濃度下氨氮的去除情況Fig.4 Removal of ammonia at different tryptoneconcentrations

2.3 菌株的高密度產芽孢發酵條件

2.3.1 發酵培養基的確定

考慮到芽孢桿菌產芽孢的共性，為提高優化效率，以培養基1～6進行初始發酵培養基的篩選。結果如圖5所示。菌株在培養基6中，24 h發酵芽孢數最高為1.23×109CFU/mL，因此選定培養基6為初始發酵培養基。但是，培養基6發酵過程中，B4發酵后期出現大量菌體自溶現象，需要進行進一步優化。

圖5 培養基1～6號發酵芽孢數Fig.5 Number of spores in 1-6 fermentation medium

發酵培養基的碳氮比不當，可能引起細菌生長過快造成的菌體發酵后期自溶現象，導致一部分菌體無法形成芽孢，并且過高含量的碳氮源增加發酵成本，因此本實驗選擇了較低的碳氮比(質量比)進行發酵優化，結果見圖6所示。當培養基中碳氮比為0.33和0.67時，發酵后期時因營養不足，菌體出現大量自溶，最終無芽孢產生。當培養基中碳氮比為1.32和2.64時，菌體發酵后期無自溶現象產生，分別用36 h的菌液進行芽孢平計數，碳氮比為2.64時，芽孢數為1.54×109CFU/mL，芽孢率為70%；碳氮比為1.32時，芽孢數為2.3×109CFU/mL，芽孢率為95.7%，芽孢數是初始發酵培養基碳氮比未優化之前的1.8倍，因此將發酵培養基的碳氮比定為1.32。

圖6 不同碳氮比對芽孢產生的影響Fig.6 Effect of different C/N on spore production

2.3.2 3 L發酵罐葡萄糖補料發酵

根據實驗前期搖瓶發酵數據，發酵過程中碳源含量極大影響了菌株B4最終的發酵芽孢數，太低或太高都會影響細菌前期生長速度，從而出現發酵后期菌體自溶而無法形成芽孢的現象，因此本實驗進行了罐上的葡萄糖補料控制。發酵過程中，未進行補料時，發酵芽孢數最低為2.2×109CFU/mL(圖7-a)，以20 g/(L·h)葡萄糖進行補料時，菌體在補料過程中濃度快速增加，待菌體濃度達到頂點后停止補料，這時菌體大量自溶，菌體濃度大幅降低，最終發酵芽孢數為5.62×109CFU/mL(圖7-c)；以10 g/(L·h)葡萄糖進行補料時，菌體保持較平緩的增長狀態，菌體濃度達到頂點后停止補料，菌體僅出現了發酵后期正常的少量自溶現象，最終發酵芽孢數為1.12×1010CFU/mL(圖7-b)，是未補料時芽孢數的5倍左右，為最高發酵芽孢數。

2.4 B4菌劑對模擬養殖水體中氨氮的降解

將上述產芽孢發酵液，與玉米芯粉混合干燥后制得菌劑，其中芽孢含量為2×1010CFU/g。我國的水產養殖實例表明，水體污染程度不同，其中所含無機氮的濃度也有差別[22]，因此模擬不同濃度氨氮水體進行試驗，結果如圖8所示。

a-不補料;b-10 g/(L·h)葡萄糖補料；c-20 g/(L·h)葡萄糖補料圖7 葡萄糖補料發酵過程Fig.7 Glucose fed fermentation process

圖8 B4菌劑對模擬養殖水體中氨氮的降解Fig.8 Degradation of ammonia in simulated aquaculturewater by B4 microbiological agent

在1、10、20 mg/L的低質量濃度氨氮的水體中，12 h菌劑的氨氮去除率可達100%，在50 mg/L高質量濃度氨氮的水體中，12 h的菌劑的氨氮去除率為94%，平均去除率為3.92 mg/(L·h)，48 h后，氨氮質量濃度略有回升，可能是因為菌體生長后期自溶釋放了一部分氨氮。菌劑對模擬養殖水體中氨氮的快速去除表明它在實際應用中具有良好潛力。

3 結論

以去除氨氮的能力為主要指標，篩選出1株可用于快速去除養殖水體中氨氮的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)B4，該菌株對100 mg/L氨氮以及50 mg/L亞硝酸鹽氮的去除率分別為92.32%和100%，通過優化發酵條件，發酵產芽孢數達到1.12×1010CFU/mL，制得的菌劑用于1～50 mg/L不同氨氮質量濃度的模擬養殖水體,12 h氨氮去除率達 94%以上。綜上所述，表明該菌株在水產養殖業具有利用潛力。