強心一號復方對膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡的影響?

王雪蕊 徐霄龍 黃 坡 哈雁翔 張 瑞 郭玉紅 劉清泉 △

（1.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 100010；2.中醫感染性疾病基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010；3.北京市中醫研究所，北京 100010）

膿毒癥是指宿主應對微生物感染的應答反應失調進而導致的危及生命的多器官功能障礙[1]。膿毒癥是重癥監護病房（ICU）內死亡的主要原因，約占ICU死亡率的10%～50%[2]。膿毒癥心功能不全是膿毒癥的嚴重并發癥，其發生率為40%～50%，病死率高達70%～90%，與未合并心功能障礙的膿毒癥患者相比，此類患者病死率增加20%[3]。膿毒癥心功能不全屬于可逆性的心臟損傷，因此早期對其進行干預治療對于降低膿毒癥的病死率具有重要的意義[4]。課題組根據多年臨床經驗，總結出益氣溫陽、活血利水的中藥復方強心一號，發現其對于膿毒癥患者心臟功能具有改善作用。前期基礎研究也證實，該復方顯著降低盲腸結扎打孔（CLP）膿毒癥小鼠的死亡率，并顯著改善其射血分數和縮短分數等心功能指標[5]。本研究旨從心肌細胞凋亡和心臟凋亡相關蛋白調節的角度，探討強心一號復方對膿毒癥小鼠的心臟保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用C57BL/6J北京小鼠，雄性，10周齡，體質量20～23 g，均為SPF級飼養，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2014-0004，使用許可證號：SCXK（京）2015-0023，由北京中醫醫院中醫研究所按純系動物要求專人飼養。各組小鼠自由進水進食，保持室溫恒定，實驗方案通過北京市中醫研究所動物倫理委員會認可，實驗過程中對動物的處置符合有關善待實驗動物的規定。

1.2 實驗藥物 參照《中華人民共和國藥典》，所有藥物由首都醫科大學附屬北京中醫醫院中藥房提供。強心一號復方組成：水紅花籽30 g，黃芪30 g，茯苓20 g，丹參20 g，五味子10 g。按原方比例，110 g藥材加水400 mL浸泡30 min，沸騰后煎煮30 min，濃縮至110 mL，以質量濃度1 g/mL作為實驗用藥劑量，并放于冰箱4℃冷藏備用。

1.3 儀器和試劑 光學顯微鏡（BX51型，日本Olympus），臺式離心機（Allegra X-30R 型，美國 BECKMAN），酶標儀（ELx808型，美國Biotek），Odyssey雙色紅外激光成像系統（Odyssey CLX，美國Odyssey）。WGA 工作液（批號L4895，美國Sigma），TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（ab206386，美國abcam），BCA蛋白測定試劑盒（23225，美國Thermo），蛋白酶抑制劑（78429，美國Thermo），戊巴比妥鈉（批號57-33-0，上海榕柏生物技術有限公司），抗B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（ab182858，美國abcam），抗Bcl-2相關 X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（ab32503，美國abcam），抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）抗體（ab13847，美國abcam），抗裂解的caspase3（Cleaved caspase3）抗體（ab2302，美國abcam），抗GAPDH抗體（TA309157，北京中杉金橋）。

1.4 分組與造模 采取隨機數字表法將動物分為對照組、模型組、強心組，每組12只。模型組、強心組小鼠進行CLP造模。模型制備方法：1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠，固定，消毒，于腹中線開口，輕柔取出盲腸，結扎1/2長度盲腸，使用5 mL注射器針頭于結扎段貫穿盲腸1次。對照組小鼠麻醉后進行假手術操作，不進行結扎和穿刺。術畢小鼠背部皮下注射生理鹽水2 mL防治休克。

1.5 干預方法 強心組于造模后2 h給予1 g/kg強心一號復方灌胃，灌胃體積1 mL。模型組與假手術組于造模術后2 h給予1 mL生理鹽水灌胃。各組均每日干預1次，持續48 h。

1.6 標本采集與檢測 1）膿毒癥小鼠臨床評分。CLP術后6 h及24 h，根據SHIRPA協議[6-7]，基于以下參數對膿毒癥小鼠進行臨床評分測定。每一項參數如有變化得1分，最多12分。觀察參數包括腹部扭動，立毛，糞便變化（如腹瀉），流淚，瞼閉合，運動活性低，體溫低（低于35℃計1分），反射性逃避觸摸，自發活動變化，握力降低和呼吸頻率變化（換氣過度）。2）心臟組織病理切片制備及染色。各組小鼠CLP術后48 h進行麻醉，用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟，剪下心臟組織，4%多聚甲醛中固定過夜，然后進行常規脫水包埋制作石蠟切片。3）采用WGA染色檢測心肌細胞面積。切片經二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，檸檬酸抗原修復90 s，PBS緩沖液洗3遍，用血清封閉液室溫封閉30 min，WGA工作液10 μg/mL 37℃孵育60 min，PBS緩沖液洗3遍，DAPI封片。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進行病理圖像采集，使用NIS Br 4.0軟件對心肌細胞面積進行數據分析。4）心臟組織TUNEL細胞凋亡測定。根據試劑盒說明書，將石蠟切片脫蠟至水。由20 μg/mL蛋白酶K溶液通透，室溫孵育8～10 min，PBS泡洗。3%過氧化氫溶液室溫孵育20 min后PBS泡洗。制備rTdT孵育緩沖液并進行室溫孵育60 min后終止反應。配制Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液進行顯色，可見TUNEL染色陽性（棕色）的凋亡細胞。采用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進行切片觀察，NIS Br 4.0軟件對陽性細胞百分比進行統計。5）Western blotting法檢測。各組小鼠取心臟組織勻漿后，使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白的濃度。配制凝膠，進行SDS-PAGE電泳，電轉，血清封閉等步驟。加入Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase3抗體、Cleaved caspase3抗體、GAPDH一抗（1∶1 000）孵育，4℃過夜。第2天室溫平衡，TBST洗滌后加入對應熒光二抗孵育。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統對硝酸纖維膜上的蛋白進行量化測定，Bcl-2和Bax以GAPDH作為參比蛋白，Cleaved caspase3以Caspase3作為參比蛋白，Image J對灰度進行分析統計。

1.7 統計學處理 所有數據以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，并用Turkey法（方差齊時）或Dunnett′s T3（方差不齊時）作組間多重比較。當檢驗變量不服從正態分布時，采用非參數統計中的Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠臨床評分比較 見表1。與對照組相比，模型組6 h和24 h的臨床評分值均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，強心組的臨床評分在24 h顯著下調（P＜0.05），6 h時無顯著差異。提示強心一號復方對CLP術后小鼠的大體狀態具有一定改善作用。

表1 各組小鼠臨床評分比較（分，±s）

表1 各組小鼠臨床評分比較（分，±s）

與對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。下同

組別對照組模型組強心組24 h 0.0±0.2 7.0±1.2*5.0±1.5#6 h 0.0±0.5 6.0±3.0*5.0±3.0

2.2 各組小鼠心肌細胞結構比較 見圖1，表2。結果發現對照組心肌細胞排列規律，大小一致。與對照組相比，模型組小鼠心肌細胞面積顯著增大（P＜0.05），排列不規律。與模型組相比，強心組心肌細胞面積顯著下降（P＜0.05）。說明強心一號復方對膿毒癥小鼠心肌細胞代償性肥大具有一定改善作用。

圖1 各組小鼠心肌細胞結構（WGA染色，400倍）

表2 各組小鼠心肌細胞面積比較（μm2，±s）

表2 各組小鼠心肌細胞面積比較（μm2，±s）

項目心肌細胞面積對照組263.74±9.47模型組429.23±10.65*強心組298.53±16.72#

2.2 各組小鼠心肌細胞凋亡比較 見圖2，表3。采用TUNEL染色評價CLP術后48 h對照組、模型組、強心組小鼠心臟組織凋亡情況，并統計各組TUNEL陽性細胞的百分比。結果發現對照組心臟組織幾乎沒有凋亡細胞。與對照組相比，模型組小鼠心肌細胞凋亡顯著增多（P＜0.05）。與模型組相比，強心組心肌細胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。說明強心一號復方對膿毒癥術后小鼠心臟組織的凋亡具有改善作用。

圖2 各組小鼠心臟組織凋亡情況（TUNEL染色，100倍）

表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細胞數比較（%，±s）

表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細胞數比較（%，±s）

項目心臟TUNEL陽性細胞對照組0.268±0.098模型組4.387±0.676*強心組0.960±0.327#

2.3 各組小鼠心臟組織凋亡相關蛋白表達的比較 見表4。與對照組相比，模型組小鼠心臟組織促凋亡蛋白Cleaved Caspase3的蛋白表達顯著上調（P＜0.05），Bcl-2和Bax蛋白表達變化無顯著性差異。與模型組相比，強心組心臟組織中Bcl-2蛋白表達顯著上調（P＜0.05），Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。提示強心一號復方對CLP術后心臟組織凋亡相關蛋白的表達具有調節作用。

表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關蛋白表達的比較（±s）

表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關蛋白表達的比較（±s）

組別Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Cleaved Caspase3/Caspase3對照組模型組強心組1.044±0.024 0.883±0.080 1.990±0.206#1.024±0.036 1.082±0.078 0.426±0.042#1.030±0.035 2.072±0.112*0.624±0.127#

3 討 論

膿毒癥心功能障礙可歸屬于中醫學“心水”“喘證”“水腫”等范疇[8]。此類患者心氣陽虛，兼具水飲及血瘀等邪實互擾，多為本虛標實、虛實夾雜證，病位涉及肺、脾、肝、腎諸臟的功能失調，治宜益氣溫陽、活血利水。強心一號配方是本團隊根據本院國家級名老中醫黃麗娟教授多年中西醫結合防治心血管病的臨床觀察，在結合古代文獻及中醫經典理論的指導下形成的有效方劑。方中黃芪補氣升陽、益衛固表、利水消腫，補而不滯，為君藥；茯苓、丹參、水紅花籽可健脾、利水、滲濕、活血，為臣藥；五味子養陰收斂，可收斂心氣，防止益氣溫陽藥辛溫傷陰散氣，為佐使藥。前期基礎實驗證實該方能顯著降低膿毒癥小鼠死亡率，對心臟射血分數和縮短分數等心功能指標也有顯著的改善作用[5]。本研究根據SHIRPA協議對CLP術后小鼠進行臨床評分測定，結果發現與模型組相比，強心一號對CLP術后24 h小鼠的臨床評分具有顯著的改善作用，進一步證明了該復方對于膿毒癥小鼠的療效。

膿毒癥患者出現的心功能障礙屬于可逆性的，患者早期出現血流動力學變化，心室收縮、舒張能力輕微改變，隨著病情的發展，到后期出現心輸出力和容量反應性下降、心肌收縮能力下降、射血功能減退等，并可見以左心室為主的心室擴張重構[3，9-10]。由于心肌收縮力的改變，心肌細胞會出現代償性的心肌肥大，從而維持心功能。本研究發現CLP術后心肌細胞出現代償性肥大，與模型組相比強心一號復方可顯著降低心肌細胞面積，說明該復方對于CLP術后心臟重構具有一定改善作用。

細胞凋亡是膿毒癥發生器官功能損傷的主要病理機制之一[11-12]，膿毒癥發生時心肌細胞內凋亡相關信號通路激活，包括由Caspase-9激活介導的內源性細胞凋亡途徑、Caspase-8激活介導的外源性細胞凋亡途徑以及內質網應激等激活的凋亡相關途徑[13-14]。Caspase-3是細胞凋亡的執行者，是外源性凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內質網凋亡途徑的交匯點[15]。其活化形式是Cleaved Caspase-3，可通過識別和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸內切酶抑制因子，增強DNA內切酶的活性從而促進細胞凋亡的發生[16]。Bcl-2家族主要包括抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bid等），主要激活線粒體凋亡途徑[17]。其中Bcl-2和Bax和作為Bcl-2基因家族的代表成員，通過影響線粒體跨膜電位的穩定性和線粒體通透性轉換孔的開放，介導凋亡的發生[18]。本研究發現，與對照組相比模型組心臟組織TUNEL陽性細胞數量顯著增加，Cleaved Caspase3表達顯著上調，說明膿毒癥可促進心肌細胞凋亡的發生。強心一號復方可顯著下調心臟組織TUNEL陽性細胞的數量，上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時下調Bax和Cleaved Caspase3的表達，說明強心一號復方對膿毒癥的心臟保護作用可能與調節心肌細胞凋亡和心臟凋亡相關蛋白的表達有關。

綜上所述，本研究發現強心一號復方可顯著改善CLP小鼠術后的臨床評分，改善心肌代償性肥大和凋亡情況，其機制可能與上調Bcl-2、下調Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達有關。