電針不同穴位對腸易激綜合征大鼠精神行為及NMDA受體表達的影響研究?

覃 穎 王一凡 郭孟瑋 藍 瑩 王 珊 吉毛先 朱文蓮 任曉暄

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

腸易激綜合征（IBS）是一種典型的身心性疾病，伴有腹痛、腹瀉等腹部癥狀[1]。精神心理障礙是其重要病機之一[2]，與腹部癥狀通過腦-腸軸[3]相互影響，使“心”和“身”兩方面的病癥不斷加重。因此，在治療IBS時，應(yīng)注重“心”即精神情緒方面的治療，達到“心身”同調(diào)。

印堂與大椎穴均能調(diào)神，同屬督脈，但二穴在功能上有所差異，印堂穴偏向于治療不寐虛證、郁證等，而大椎穴偏向于治療小兒驚風(fēng)、癲狂癇證等。既往研究表明，NMDA受體與精神情緒等密切相關(guān)[4]。因此本實驗以IBS模型大鼠為研究對象，通過比較電針“印堂”“大椎”二穴對IBS模型大鼠的腹部回撤反射檢測（AWR）、曠場實驗（OFT）以及實時熒光定量PCR檢測前扣帶回皮層（ACC）中NMDA受體的陽性表達，觀察不同穴位對IBS情緒異常是否具有療效及其效應(yīng)差異，以此闡釋經(jīng)穴效應(yīng)特異性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 購入清潔級健康Wistar孕鼠5只，清潔柜飼養(yǎng)，室溫維持在（23±2）℃，12 h晝夜交替，自由飲水。

1.2 試藥與儀器 電子秤（ER-182A型，日本）；電針儀（LH-202H型，北京禎怡科技發(fā)展公司）；毫針（0.30 mm×13 mm，北京中研太和科技有限公司）；BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限責(zé)任公司）；雙腔兒科導(dǎo)尿管（BARD-FOLEY，美國）；乙酸、液體石蠟（北京化學(xué)試劑公司）；10%中性甲醛（北京百諾威生物科技有限公司）；2%戊巴比妥鈉（北京歐北科技生物科技有限公司）；Tirzol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、PCR試劑（Promega公司）；PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 造模與分組 孕鼠生產(chǎn)后，將幼鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、印堂組和大椎組，每組10只。除空白對照組外均造模，同等條件飼養(yǎng)。本實驗方案符合實驗動物倫理委員會倫理學(xué)規(guī)定。通過母嬰分離加醋酸灌腸結(jié)合結(jié)直腸擴張（CRD）聯(lián)合造模。方法如下：幼鼠出生2～21 d于8∶00～11∶00進行3 h的母嬰分離。8～21 d給予0.5%醋酸灌腸，具體灌注量見表1。22～42 d不予任何干預(yù)。6周齡時給予CRD刺激（將潤滑后的6F導(dǎo)尿管經(jīng)大鼠肛門插入，深度約為7 cm，固定，待大鼠適應(yīng)，用0.5 mL/min的速度均勻緩慢地向?qū)蚬苤凶⑺?.5 mL擴張結(jié)直腸，維持30 s，以出現(xiàn)腹部抬起為準(zhǔn)。重復(fù)3次，每次間隔5 min），加強模型的穩(wěn)定性。造模至8周齡，普通喂養(yǎng)。

表1 IBS幼鼠模型制備醋酸灌注量（mL）

1.4 干預(yù)方法 兩電針組在第9周進行電針治療。穴位定位參照《實驗針灸學(xué)》[5]：“印堂”（兩眼中點偏上2 mm處，斜刺2 mm）；“大椎”（第7頸椎與第1胸椎間，直刺5 mm）。具體操作如下：固定大鼠，將針具刺入相應(yīng)穴區(qū)，并在其旁開約1 mm的同一穴區(qū)再刺入1針，兩針不相接觸，以防短路。連接韓氏電針儀，同一對正負極連接同名穴區(qū)的兩針柄，疏密波，2/100 Hz，強度以引起大鼠肢體微動為度，20 min/次，隔日1次，共5次。

1.5 檢測指標(biāo) 1）腹部回撤反射檢測（AWR）：禁食不禁水8 h后進行AWR。本實驗參照Al-Chaer[6]的方法予以改良，具體方法：自制球囊，將球囊、微量注射泵、壓力換能器與BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)連接，并檢查保證管路的密封性。固定大鼠：將大鼠放至與微量注射泵同高度的位置，固定并將潤滑后的球囊頭端緩慢插入肛門約8 cm，用膠布帶與鼠尾固定。安撫大鼠等其適應(yīng)后打開微量注射泵，以1 mL/min的速度勻速緩慢注水，共1.5 mL，使球囊擴張，持續(xù)時間為90 s。標(biāo)記起始收縮波的潛伏期、收縮波個數(shù)。同一只大鼠檢測3次（時間間隔30 min以上），取其平均值統(tǒng)計。2）曠場試驗（OFT）：AWR測試后的第2天進行。適應(yīng)實驗環(huán)境約10 min后，打開自主行為裝置，將大鼠放入敞箱中央，記錄大鼠在5 min內(nèi)水平和垂直運動（兩個前肢同時豎立記為1次）的次數(shù)。每次測試后，清理敞箱，不留異物異味。3）實時熒光定量PCR檢測NMDA receptor1（NR1）、NMDA receptor2A（NR2A）、NMDA receptor2B（NR2B）表達水平。麻醉處死大鼠，取腦組織，檢測ACC中NMDA表達。NMDA receptor1：sense：5′-GCTGTACCTGCTGGACCGCT-3′，antisense：5′-GCAG TGTAGGAAGCCACTATGATC-3′，predicted size（bp）：219 bp；NMDA receptor2A：sense：5′-TCCATTCTTCTGTCATCC TGC-3′，antisense：5′-AAGACCGTCTCTCACTCTTGC-3′predicted size（bp）：225 bp；NMDA receptor2B：sense：TGCACAATTACTCCTCGACG-3′，antisense：5′-TCCGATTCTTCTTCTGAGCC-3′，predicted size（bp）：222 bp。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SAS8.2統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。組間差異采用單因素方差分析，繼以LSD檢驗；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠AWR實驗結(jié)果比較 見表2。與空白對照組比較，模型對照組的潛伏期明顯降低、收縮波個數(shù)明顯增多（P＜0.01）；與模型對照組比較，印堂組的潛伏期明顯上升、收縮波個數(shù)明顯減少（P＜0.01），大椎組的潛伏期上升（P＜0.05）；與印堂組比較，大椎組收縮波個數(shù)明顯增多（P＜0.01）。

表2 各組大鼠AWR實驗結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠AWR實驗結(jié)果比較（±s）

與空白對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與印堂組比較，◆◆P＜0.01。下同

n組別空白對照組模型對照組印堂組大椎組10 10 10 10潛伏期（s）82.83±6.45 51.02±11.07△△69.59±10.04△△▲▲62.25±10.47△△▲收縮波個數(shù)1.07±0.80 3.23±1.52△△1.33±0.50△△▲▲2.70±0.90△△◆◆

2.2 各組大鼠OFT結(jié)果比較 見表3。與空白對照組比較，模型對照組的水平以及垂直運動次數(shù)均明顯減少（P＜0.01）；與模型對照組比較，印堂組水平以及垂直運動次數(shù)均明顯增加（P＜0.01）；與印堂組比較，大椎組的水平運動次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。

表3 各組大鼠OFT結(jié)果比較（±s）

表3 各組大鼠OFT結(jié)果比較（±s）

組別空白對照組模型對照組印堂組大椎組n 10 10 10 10 5min水平運動次數(shù)1 575.10±255.36 1 050.70±271.56△△1 478.20±277.26▲▲1 126.90±214.48△△◆◆5min垂直運動次數(shù)151.50±36.03 81.20±36.64△△124.60±42.18▲▲103.20±23.42△△

2.3 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達比較 見表4。與空白對照組比較，模型對照組的NR1、NR2A、NR2B表達均增多（P＜0.05）；與模型對照組比較，印堂組的NR1、NR2A、NR2B表達均顯著減少（P＜0.05），大椎組的NR1、NR2B表達均顯著減少（P＜0.05），印堂組NR2A表達低于大椎組。

表4 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達比較（ΔΔCt，±s）

表4 各組大鼠NR1、NR2A、NR2B的表達比較（ΔΔCt，±s）

組別空白對照組模型對照組印堂組大椎組n 6 6 6 6 NR1 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲NR2A 0.40±0.14 0.73±0.19△0.40±0.27▲0.54±0.33 NR2B 0.49±0.17 0.92±0.36△0.59±0.14▲0.53±0.37▲

3 討 論

NMDA受體[7]（NMDAR）是一種配體門控離子型谷氨酸受體，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)許多重要的生理病理過程，是治療某些神經(jīng)精神性疾病的靶點。NR1是NMDA受體復(fù)合物的必需功能亞單位，NR2是NMDA受體活性的調(diào)節(jié)亞單位，因此高活性的NMDA受體通道必須由一個NR1以及一個或幾個NR2亞型共同構(gòu)成異寡聚體所形成[8]。NR2A和NR2B大量分布于與疼痛傳導(dǎo)密切相關(guān)的ACC中[9]，因此ACC中NMDA受體的激活（尤其是NR2A和NR2B）對疼痛情緒的產(chǎn)生發(fā)揮了重要的作用[10]。黃俊景[11]發(fā)現(xiàn) ACC 內(nèi)的NR2A和NR2B在炎癥后表達上調(diào)，增強了ACC神經(jīng)元的興奮性，這可能是導(dǎo)致疼痛情緒形成的重要原因。本實驗中，IBS模型大鼠NMDA受體在ACC中的表達增高，與以往實驗結(jié)果一致。

針灸對于情緒方面的疾病有獨有的優(yōu)勢。督脈“上入絡(luò)腦”，治療上常取督脈的穴位用以調(diào)神。印堂穴為經(jīng)外奇穴，為兩邊目系交匯，與多條陰經(jīng)聯(lián)系，如足厥陰肝經(jīng)、手少陰心經(jīng)等，心、肝二陰經(jīng)在治療情志病中有著重要作用。筆者認為印堂穴所灌注的氣血中，更多的是肝、心等陰經(jīng)的氣血，這也是古人歷經(jīng)千年并沒有將其列為督脈穴位的原因。臨床研究[12-13]發(fā)現(xiàn)印堂穴能有效改善焦慮抑郁等精神異常類的慢性疾病，且對提高IBS的排便滿意度效果良好。大椎穴是手足三陽與督脈的交會穴，其六陽之氣充盛，針刺大椎可加強元神之府對全身臟腑機能的調(diào)整作用，有除陽經(jīng)邪熱、定志安神之功。臨床研究[14-15]發(fā)現(xiàn)大椎穴多用來治療熱擾神明所致的失眠、中風(fēng)后抑郁、癲癇等急性精神類疾病，治療單純性抑郁癥的研究少見。

中醫(yī)認為，肝郁脾虛[16]是IBS主要發(fā)病因素。從其病機來看，印堂穴對IBS情緒方面的療效應(yīng)優(yōu)于大椎。本實驗造模周期長，與IBS的發(fā)病特征一致，大鼠出現(xiàn)精神淡漠等抑郁樣情緒。實驗結(jié)果表明電針“印堂”“大椎”穴后均能調(diào)節(jié)IBS大鼠抑郁樣精神行為，且印堂組優(yōu)于大椎組，與中醫(yī)理論基本相符。

綜上所述，“印堂”和“大椎”穴均可改善IBS模型大鼠的抑郁樣行為，但兩者存在效應(yīng)差異，即“印堂”穴的作用明顯優(yōu)于“大椎”穴。說明相同經(jīng)脈且有相近主治功能的穴位亦具有經(jīng)穴效應(yīng)特異性。在本實驗中，“印堂”和“大椎”穴也可緩解腹痛，降低腸道高敏感性，這也體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀，但二穴之間差異的確切機制尚有待進一步深入研究。