益氣活血方對氣虛血瘀型冠心病模型大鼠的影響研究

王瑾茜　胡國恒　藺曉源　劉侃

〔摘要〕 目的 探討益氣活血方對氣虛血瘀型冠心病模型大鼠的影響。方法 32只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、益氣活血方組和芪參益氣滴丸組，每組8只。除空白組外，各組均采用“游泳力竭+控制飲食+結扎冠狀動脈左前降支”制備病證結合氣虛血瘀型冠心病動物模型，時間均為11 d。造模結束后，分別灌胃予以相應干預14 d。采集大鼠心電圖，進行Morris 水迷宮、曠場實驗并HE染色、Masson染色，并采用ELISA檢測血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogenactivator，t-PA）的含量。結果 與空白組比較，模型組心電圖ST段抬高;Morris水迷宮實驗潛伏期延長（P<0.01），穿臺次數顯著減少（P<0.01）;曠場實驗水平得分、垂直得分減少（P<0.05），中心活動時間延長（P<0.05），角落活動時間、周邊活動時間均減少，焦慮程度降低（P<0.05或P<0.01）;心肌細胞排列較紊亂，在梗死灶周圍出現核破裂，血漿中PAI-1、vWF水平明顯增高（P<0.05或P<0.01），t-PA水平明顯降低（P<0.05）。與模型組比較，益氣活血方組心電圖ST段恢復正常;Morris水迷宮潛伏期顯著縮短（P<0.01），穿臺次數顯著增加（P<0.01）;曠場實驗中心活動時間減少（P<0.05），角落活動時間延長（P<0.05），焦慮程度增高（P<0.05）;梗死灶周圍心肌細胞排列整齊，心肌細胞凋亡指數降低（P<0.05）;血漿中PAI-1、vWF水平均降低（P<0.05或P<0.01），t-PA水平增高（P<0.05）。結論 病證結合動物模型更能滿足中西醫結合研究的需要;益氣活血方能有效修復氣虛血瘀型冠心病模型大鼠心肌細胞損傷并改善記憶力減退、健忘、疲勞及反應遲鈍的癥狀，且改善高凝狀態的機制與調節vWF、PAI-1、t-PA水平有關。

〔關鍵詞〕 益氣活血方;氣虛血瘀;冠心病;記憶能力;血漿纖溶酶原激活物抑制劑;血管性假血友病因子;組織型纖溶酶原激活劑

〔中圖分類號〕R285.5;R256.22? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.004

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Yiqi Huoxue Formula on the model rats of coronary heart disease with Qi deficiency and blood stasis. Methods A total of 32 SD rats were randomly divided into a blank group， a model group， a Yiqi Huoxue Formula group and a Qishen Yiqi dropping pill group， with 8 rats in each group. Except for the blank group， each group used "swimming exhaustion + diet control + ligation of left anterior descending branch of coronary artery" to prepare the animal model of coronary heart disease combined with Qi deficiency and blood stasis syndrome， and the duration was 11 days. At the end of modeling， the drugs were given by gavage for 14 days. ECG of rats were obtained. Morris water maze， open field test， HE staining and Masson staining were performed. The contents of plasminogen activator inhibitor （PAI-1）， von Willebrand factor （vWF）， tissue plasminogen activator （t-PA） were measured by ELISA. Results Compared with the blank group， ST segment of ECG in the model group was elevated; in the Morris water maze experiment， the latency was prolonged （P<0.01）， and the number of platform penetration was significantly shortened （P<0.01）; For the open field experiment， the horizontal score and vertical score were decreased （P<0.05）， and the central activity time was prolonged （P<0.05）. The corner activity time， the peripheral activity time， and the degree of anxiety were decreased （P<0.05 or P<0.01）; the arrangement of myocardial cells was more disordered， with nuclear rupture around the infarct. In the plasma， the expression of PAI-1， vWF were significantly increased （P<0.05 or P<0.01） and t-PA was decreased （P<0.05）. Compared with the model group， ST segment of ECG in Yiqi Huoxue Formula group returned to normal， and the latency of Morris water maze was significantly shortened （P<0.01）. The times of platform penetration was significantly prolonged （P<0.01）， and the central activity time of open field experiment was decreased （P<0.05）. The activity time of corner was prolonged （P<0.05）， and the anxiety degree was increased （P<0.05）. The arrangement of myocardial cells around the infarct was orderly， and the apoptosis index of myocardial cells was decreased （P<0.05）. The PAI-1 and vWF levels in plasma were decreased （P<0.05 or P<0.01）. The level of t-PA increased （P<0.05）. Conclusion The animal model of the combination of disease and syndrome can better meet the needs of the study of the combination of traditional Chinese and western medicine. Yiqi Huoxue Formula can effectively repair the myocardial cell injury of the model of coronary heart disease of Qi deficiency and blood stasis， improve the symptoms of memory loss， forgetfulness， fatigue and slow response， and the mechanism of improving the hypercoagulable state is related to the regulation of vWF， PAI-1 and t-PA levels.

〔Keywords〕 Yiqi Huoxue Formula; Qi deficiency and blood stasis; coronary heart disease; memory ability; plasminogen activator inhibitor; von Willebrand factor; tissue plasminogen activator

冠心病（coronary artery heart disease， CHD）是指因冠狀動脈阻塞等原因導致心臟的血液灌注減少，從而引起心肌缺血缺氧、能量代謝失常的一種病理狀態[1]。世界衛生組織WHO最新報道，因心血管疾病引發的死亡率占全球死亡人數的30%[2]，CHD在中醫學歸屬“胸痹”“心痛”“真心痛”等的范疇，氣虛血瘀證為CHD最常見證型[3]。益氣活血方是湖南省名老中醫胡國恒教授的經驗方，臨床治療CHD療效顯著[4]。本研究中，我們采用“游泳力竭+控制飲食+結扎冠狀動脈左前降支”制備氣虛血瘀型CHD病證結合動物模型，觀察了益氣活血方對模型大鼠行為學、心電圖、病理形態學、血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、組織型纖溶酶原激活劑（tissue-type plasminogenactivator，t-PA）水平的影響，以期為益氣活血方治療氣虛血瘀型CHD提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1? 實驗動物

選用SPF級健康雄性SD大鼠，8周齡，體質量（280±20） g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK（湘）2016-0003，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物房，使用許可證號為SYXK（湘）2015-0003。

1.2? 藥物與主要試劑

益氣活血方由黃芪30 g，當歸12 g，川芎15 g，丹參15 g組成，中藥飲片購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院。取益氣活血方加入處方劑量 10倍水，浸泡30 min后，沸水文火慢煎2次，每次40 min，合并2次藥液，過濾，濃縮至1.6 g/mL，4 ℃冰箱保存;芪參益氣滴丸（天津天力士制藥集團股份有限公司，批號：150208）。

水合氯醛（上海聯碩生物科技有限公司，批號：032819）;DAB顯色液（美國Sigma技術有限公司，批號：46658）;注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號：869037）;PAI-1 ELISA測定試劑盒（貨號：ab142349）、vWF ELISA測定試劑盒（貨號：ab108918）、? t-PA ELISA測定試劑盒（貨號：ab192151）均購自于上海艾博抗科技有限公司，蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號：20150420）、Masson三色法染色試劑盒（批號：20150424）均購自于上海歌凡生物科技有限公司。

1.3? 主要儀器

酶標儀（普天新橋技術有限公司，北京）;ALC-V10型呼吸機（奧爾科特生物技術有限公司，上海）;TP-2200B型電子天平（湘儀實驗儀器開發有限公司，長沙）;Z32HK型臺式冷凍離心機（Microsystems有限公司，美國）;XG1D型脈沖真空管滅菌鍋（新華技術有限公司，山東）;101型電熱鼓風干燥箱（永光明醫療儀器有限公司，北京）;BL-420型心電圖、Morris 水迷宮（泰盟機械有限公司，成都）;熒光顯微鏡、RM2125RTS型手動輪轉式切片機、BOND-MAX型全自動免疫組化染色機（徠卡生物有限公司，德國）。

1.4? 模型制作與分組干預

大鼠適應性喂養1周后，根據體質量按完全隨機數字表法隨機分為4組：空白組、模型組、益氣活血方組、芪參益氣滴丸組，每組8只。其中模型組、益氣活血方組、芪參益氣滴丸組參照文獻[5]方法制備氣虛血瘀型冠心病動物模型：在實驗第1～10天進行力竭游泳造模，每次以大鼠沉入水中10 s，以頭不能露出水平面為準。頻率為1次/d，游泳后撈出，室溫放置讓其水分自然蒸發。力竭游泳造模同時開始控制攝食量，大鼠每日攝入正常食量的1/2 飼料，連續10 d。實驗第11天，模型組、益氣活血方組、芪參益氣滴丸組進行高位結扎左冠狀動脈前降支手術。具體方法如下：左前胸去毛，順肋間隙方向于胸骨左旁第3～4肋間切開皮膚，長約1 cm，切開心包，在左心耳前下方用零號醫用縫合線結扎血管縫針，記錄標準Ⅱ導聯心電圖。造模成功標志：以心電圖ST段弓背向抬高的改變及左室前壁向外膨脹發紺、搏動減弱為結扎成功標志。術后每只腹腔注射青霉素8萬U，連續3 d以抗感染，手術1 d后，益氣活血方組給予益氣活血方6.48 g/kg灌胃（以70 kg成人生藥劑量72 g/kg換算），芪參益氣滴丸組給予芪參益氣滴丸灌胃0.14 g/kg（以70 kg成人生藥劑量1.5 g/kg換算），空白組、模型組予以等體積蒸餾水灌胃。1次/d，連續灌胃14 d。

1.5? 指標檢測

1.5.1? 心電圖采集? 以冠狀動脈左前降支結扎術后第3天上午8：00為統一觀察時間點，觀察各組大鼠心電圖變化。

1.5.2? Morris水迷宮實驗? 給藥第10天開始，將各組大鼠從平臺正對象限處頭朝池壁放入水中，自由尋找平臺，若90 s后不能找到平臺，引導至平臺停留15 s。連續訓練4 d，每天1次，訓練完成后，第5天上午于采集心電圖前開始正式實驗。自動攝像系統和計算機分析處理系統記錄每只動物進入隱藏平臺所在象限的時間（潛伏期）及穿臺次數。整個測試過程保持絕對安靜。

1.5.3? 曠場分析? 在大鼠末次給藥1 h后進行觀察，箱內共有5×5大格，規定中間9格為中心區域，角落的4格為角落區域，其余12格為周邊區域。記錄5 min之內各組大鼠在不同區域的活動時間。計算水平得分：以大鼠后肢跨入1格為評判標準，記錄大鼠水平穿越格子的次數;垂直得分：以大鼠雙前肢離地為評判標準，記錄大鼠站立的次數。并計算焦慮程度。

焦慮程度=（角落活動時間+周邊活動時間）/中心活動時間

1.5.4? HE染色? 各組大鼠在曠場實驗完成后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后迅速剖開胸腔，取心肌梗死灶組織塊，直徑約0.3 cm左右，4%多聚甲醛中固定，以不同濃度的酒精脫水，二甲苯透明，將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，浸蠟，包埋，切成5 μm厚薄片，以二甲苯脫蠟，入100%、95%、85%、70%酒精，經蒸餾水轉入染液，蘇木精染液染色，水洗玻片上多余染液，伊紅染液染色5 min。以樹膠封片。在熒光顯微鏡高倍（×40）視野下拍攝，每組隨機選擇5張，每張切片隨機選擇5個視野。

1.5.5? Masson染色? 各組大鼠取心肌梗死灶組織塊，脫水透明，浸蠟包埋，切成5 μm厚薄片，在每一個標本中各取已制備的薄片1張，應用末端脫氧核苷酸轉移酶所介導dUTP缺口末端標記法進行標記心肌凋亡細胞核中DNA3-OH的末端，并采用原位熒光法對凋亡細胞進行標記與顯示。在熒光顯微鏡高倍（×40）視野下觀察每張切片標本，每組隨機選擇5張，每張切片隨機選擇5個視野，并計算凋亡指數。

凋亡指數=凋亡心肌細胞核數/正常心肌細胞核數

1.5.6? ELISA法檢測血漿PAI-1、vWF、t-PA水平? 各組大鼠腹主動脈取血，3 mL/只，按1∶1比例加入等體積0.05 mol的HCL，將PAI-1、vWF、t-PA抗原用包被液稀釋至0.5～20 ？滋g/mL，37 ℃恒溫箱孵育4 h，洗板后用5%小牛血清封閉40 min，洗滌后按順序加入稀釋好的標準液處理過的待檢樣品及陰性對照、陽性對照，37 ℃恒溫箱孵育1 h，洗滌后加入TMB底物溶液避光孵育5 min，終止液終止反應后，于20 min內放入酶標儀檢測各組光密度（OD）值。

1.6? 統計方法

采用統計學軟件SPSS 22.0分析實驗數據，計量資料以“x±s”表示，兩組比較，如果滿足正態及方差齊性，采用成組t檢驗，不滿足者采用秩和檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 益氣活血方對模型大鼠心電圖的影響

空白組心電圖正常，模型組出現ST段抬高，呈“弓背向上”抬高，為心肌梗死特異性指標之一，且QRS波抬高、增寬。益氣活血方組呈T波低平改變，芪參益氣滴丸組呈現T波倒置而ST-T無明顯抬高的心電圖。見圖1。

2.2? Morris水迷宮

與空白組比較，模型組潛伏期延長（P<0.01），穿臺次數顯著減少（P<0.01）;與模型組比較，益氣活血方組、芪參益氣滴丸組潛伏期顯著縮短（P<0.01），穿臺次數顯著增加（P<0.01）;而益氣活血方組與芪參益氣滴丸組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1，圖2。

2.3? 曠場分析

與空白組比較，模型組水平得分、垂直得分減少（P<0.05），中心活動時間延長（P<0.05），角落活動時間、周邊活動時間減少，焦慮程度降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，益氣活血方組、芪參益氣滴丸組中心活動時間減少（P<0.05），角落活動時間延長（P<0.05），焦慮程度增高（P<0.05）。見表2。

2.4? 各組大鼠心肌HE染色比較

空白組HE染色可見心肌細胞整齊、致密、均勻排列，無核固縮甚至碎裂溶解。模型組心肌細胞排列較紊亂，在梗死灶周圍出現核破裂;心肌細胞肥大且間隙不清，心肌纖維走行較為紊亂，間質可見大量炎性細胞浸潤，心肌間質出現。益氣活血方組心肌細胞排列整齊，在纖維組織中出現核固縮，周圍血管有明顯的藍色膠原纖維替代心肌組織且排列整齊;芪參益氣滴丸組可見少許炎性細胞浸潤，間質無充血。見圖3。

2.5? 各組大鼠心肌Masson染色比較

Masson染色正常細胞核染色呈藍色，肌纖維呈紅色，膠原纖維染色藍色或綠色。染色涂片可發現空白組細胞核分布均勻、輪廓清楚，肌纖維呈紅色且排列整齊;模型組細胞核排列紊亂、分布不均，肌纖維染色呈深淺不一的黃褐色，已壞死心肌結構模糊不清，可見梗死區心肌組織膠原細胞增多;益氣活血方組細胞核分布均勻，肌纖維呈深褐色且密集排列;芪參益氣滴丸組細胞核排列整齊，可見梗死區心肌組織膠原細胞降解痕跡。見圖4。

與空白組相比，模型組心肌細胞凋亡指數增大（P<0.05）;與模型組相比，益氣活血方組、芪參益氣滴丸組細胞凋亡指數顯著減小（P<0.05或P<0.01）。益氣活血方組與芪參益氣滴丸組相比，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

2.6? 益氣活血方對模型大鼠血漿PAI-1、vWF、t-PA水平的影響

模型組與空白組比較，血漿中PAI-1、vWF表達明顯增高（P<0.05或P<0.01）、t-PA表達明顯降低（P<0.05）。經過給藥后，益氣活血方組、芪參益氣滴丸組PAI-1、vWF表達水平降低，而t-PA表達水平升高，與模型組比較差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。而益氣活血方組與芪參益氣滴丸組比較差異不顯著（P>0.05）。見表4。

3 討論

CHD氣虛血瘀證的發病率呈逐年上升趨勢，西醫主要采用冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）或冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG），但在六個月的周期之內仍有30%的狹窄率[6]。導師胡國恒教授臨床使用益氣活血方療效顯著。益氣活血方全方由黃芪、當歸、丹參、川芎四藥組成，方中重用黃芪，溫陽補氣，氣盛則血行，為君藥;當歸“破惡血，養新血”，為臣藥;丹參“破宿血，補新生血”;川芎“血閉者能通，為血中氣藥”。諸藥相互為用，以奏補氣活血之效。課題組前期研究發現，運用益氣活血方可促進心肌梗死模型大鼠肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素生長因子（insulin-like growth factor，IGF）等的表達，并可提高內皮祖細胞動員、增殖、遷移及黏附能力，從而達到促進心肌缺血區心肌血管新生的目的，進而闡明了益氣活血方促血管新生的作用機制[7-11]。本實驗在前期研究的基礎上，沿用廖慧玲課題組造模方法（游泳力竭+控制飲食+結扎冠狀動脈左前降支）復制氣虛血瘀型CHD病證結合模型，通過觀察心電圖、動物行為學、心肌病理形態學改變以及血漿中PAI-1、t-PA和vWF表達水平，進一步探討益氣活血方對氣虛血瘀型CHD模型大鼠的影響。

本研究結果表明，模型組出現ST段抬高，呈“弓背向上”抬高，為心肌梗死特異性指標之一。益氣活血方干預后，心電圖由T波低平取代ST段抬高表現，提示進入恢復期。Morris水迷宮實驗是檢測動物記憶水平的重要工具[12]，Morris水迷宮實驗發現模型組潛伏期均延長，穿臺次數均顯著減少，說明氣虛血瘀型CHD病證結合模型大鼠可有記憶力減退、健忘表現;與模型組比較，益氣活血方組潛伏期顯著縮短，穿臺次數顯著增加，說明益氣活血方能改善記憶力減退、健忘癥狀。曠場分析檢測則主要反映動物對新環境的探索以及伴隨的情緒變化[13]，在曠場實驗中發現模型組中央格時間延長、角落活動時間減少、探索行為減少，反映了模型組大鼠對新環境的認知能力差，對未知危險的感知能力下降。益氣活血方干預后大鼠中心活動時間減少，焦慮程度增高，說明益氣活血方可改善大鼠體力疲勞，反應遲鈍。HE染色觀察益氣活血方干預后心肌細胞排列整齊，Masson染色觀察發現益氣活血方組細胞核分布均勻，肌纖維呈深褐色且密集排列。

vWF被視為內皮損傷的標記，當血液黏度升高或凝血酶異常時，vWF釋放入血導致血液中vWF異常增高[14];t-PA是體內纖溶系統的生理性激動劑，PAI-1是t-PA的抑制劑，是纖溶系統主要的活性抑制物，具有清除纖維蛋白以及溶解血栓的作用[15]。實驗結果表明益氣活血方能提高t-PA的表達，并降低PAI-1和vWF的表達，提示益氣活血方能改善血液高凝狀態。

綜上所述，我們采用廖慧玲課題組造模方法復制氣虛血瘀型CHD病證結合模型，造模后通過觀察心電圖、動物行為學、心肌病理形態學改變以及血漿中PAI-1、t-PA和vWF表達水平來評價模型，從結果看，采用這種病因結合病理多因素復合制作氣虛血瘀型CHD動物模型確實可行，同時具備中醫的證候特征和西醫的病理學改變，更能滿足辨證論治原則下開展中醫藥研究的需要。益氣活血方能使氣虛血瘀型CHD模型大鼠急性期心電圖結果好轉，改善心肌細胞損傷，記憶力減退、健忘及疲勞、反應遲鈍的癥狀，并改善血液高凝狀態，其機制可能與抑制vWF、PAI-1及促進t-PA釋放有關。

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（本文編輯? 楊? 瑛）