補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量測定及其對免疫性卵巢早衰小鼠的影響

張韞玉　張思敏　劉平安　黃姍姍　張楚潔　胡金芳　劉慧萍　肖小芹

〔摘要〕 目的 研究補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量測定方法及其對免疫性卵巢早衰小鼠激素血清卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）水平的影響。方法 （1）采用HPLC，色譜柱Hypersil ODS C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，測定補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量;（2）以小鼠透明帶3為抗原，皮下多點注射BALB/c雌性小鼠，建立免疫性卵巢早衰模型，分別用補腎活血方、馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷進行干預(yù)，并設(shè)空白組、模型組為對照，酶聯(lián)免疫吸附法測定各組FSH、LH、E2含量。結(jié)果 （1）馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷的線性范圍分別在58～1 160 μg（r=1.000 0）、203～4 070 μg（r=0.999 8）及117～2 340 μg（r=0.999 4）內(nèi)，線性關(guān)系良好;這3種成分的平均加樣回收率分別為98.6%、98.0%、98.8%，RSD分別為2.18%、1.28%、1.77%;在補腎活血方中按生藥量計算，莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷的平均含量分別為（4.612±0.057） mg/g、（1.286±0.014） mg/g、（3.065±0.022） mg/g。（2）與空白組比較，模型組E2水平顯著降低（P<0.01），F(xiàn)SH和LH的水平均明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，補腎活血方組、馬錢苷組、莫諾苷組E2水平均顯著升高（P<0.01），F(xiàn)SH和LH的水平均顯著降低（P<0.01），芍藥苷組E2水平顯著升高（P<0.01），LH的水平顯著降低（P<0.01），F(xiàn)SH水平降低（P<0.05）。結(jié)論 所建立的HPLC簡便、靈敏、準確，可用于補腎活血方中莫諾苷、馬錢苷、芍藥苷的含量測定;馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷為補腎活血方中可能的藥效物質(zhì)。

〔關(guān)鍵詞〕 補腎活血方;馬錢苷;莫諾苷;芍藥苷;高效液相色譜法;含量測定;卵巢早衰;激素水平

〔中圖分類號〕R284.1;R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.006

〔Abstract〕 Objective To study a quantitative determination method of loganin， morroniside and paeoniflorin， and its effect on the level of follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH）， estradiol （E2） in mice with immune premature ovarian failure. Methods HPLC procedure was performed on the chromatographic column of Hypersil ODS C18 （200 mm × 4.6 mm， 5 μm） at 30 ℃. The mobile phase was acetonitrile （A）-0.1% phosphoric acid solution （B） in gradient elution at flow rate of 1.0 mL/min and sample size was 10 μL to determine the content of loganin， morroniside and paeoniflorin in Bushen Huoxue Formula; Mice ZP3 as antigen was injected subcutaneously into Balb/c female mice to establish a model of immune premature ovarian failure. Bushen Huoxue Formula， loganin， morroniside and paeoniflorin were used for the intervention， and the blank group and the model group were set as the control group. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to determine the contents of FSH， LH， E2. Results The linear ranges of loganin， morroniside and paeoniflorin were 58～1 160 μg （r=1.000 0）， 203～4 070 μg （r=0.999 8） and 117～2 340 μg （r=0.999 4）， respectively， and the linear relationship was good.. The average recoveries of the 3 components were 98.6% （RSD=2.18%）， 98.0% （RSD=1.28%）， 98.8% （RSD=1.77%）; the average contents of morroniside， loganin and paeoniflorin were （4.612±0.057）， （1.286±0.014） and （3.065±0.022） mg/g， respectively based on the crude drug quantity in Bushen Huoxue Formula; Compared with the blank group， the E2 level in the model group was significantly decreased （P<0.01）， while the FSH and LH levels were significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， the E2 level of the Bushen Huoxue Formula group was significantly increased （P<0.01）， and the levels of FSH and LH were significantly decreased （P<0.01）. The E2 level of the paeoniflorin group was significantly increased （P<0.01）. The level of LH was significantly decreased （P<0.01）， and the level of FSH was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion The method is simple， sensitive and accurate， which can be used for the quantitative determination of morroniside， loganin and paeoniflorin in Bushen Huoxue Formula. Loganin， morroniside and paeoniflorin are possible pharmacodynamic substance in Bushen Huoxue Formula.

〔Keywords〕 Bushen Huoxue Formula; loganin; morroniside; paeoniflorin; HPLC; content determination; premature ovarian failure; hormone level

卵巢早衰（premature ovarian failure， POF）是指月經(jīng)初潮年齡正常或延遲且第二性征發(fā)育正常的女性，在40歲之前出現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征等癥狀，持續(xù)6個月以上閉經(jīng)，生殖器官萎縮，性功能降低甚至不孕，卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizinghormone，LH）水平升高、雌二醇（estradiol，E2）水平降低的一種婦科內(nèi)分泌疾病[1]。卵巢早衰歸屬于中醫(yī)學“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”等范疇，是以腎虛為主，兼瘀血阻絡(luò)的婦科臨床疑難病癥。

補腎活血方由國家第四批名老中醫(yī)藥專家尤昭玲教授經(jīng)長期臨床實踐，根據(jù)補腎活血法將左歸丸化裁而來。該方由山茱萸、熟地黃、黃精、白芍、當歸、川芎、丹參、桃仁、枸杞九味藥組成，主治腎虛血瘀型卵巢早衰。本課題組近年來對補腎活血方進行的動物、細胞實驗發(fā)現(xiàn)：該方通過上調(diào)卵巢顆粒細胞同源二聚體調(diào)控基因Bcl-2/Bax蛋白的表達，有效抑制抗透明帶抗體，從而減少卵泡閉鎖，降低卵泡耗竭速度，改善免疫性POF模型小鼠免疫狀態(tài)[2];通過下調(diào)自殺相關(guān)因子及其配體基因的表達，改善激素分泌水平，促進成熟卵泡發(fā)育、卵泡顆粒細胞的生殖分化[3];該方能促使成熟卵泡增加、原始卵泡和大量初級卵泡的形成，其改善卵巢功能的機制可能與上調(diào)顆粒細胞PI3K、Akt、Bcl-2的蛋白表達有關(guān)[4];能明顯促進免疫性POF小鼠TGF-β1/Smads信號通路的傳導(dǎo)，進而促進竇前卵泡生長、顆粒細胞的增殖和分化[5]。

通過對補腎活血方相關(guān)成分進行分析，發(fā)現(xiàn)方中君藥山茱萸能滋陰益血、補腎填精，其中有機酸及其酯類和環(huán)烯醚萜苷類是主要活性成分。環(huán)烯醚萜苷類主要有馬鞭草苷、馬錢苷、獐牙菜苷、莫諾苷、山茱萸新苷等[3-9]。有研究表明[10-12]，莫諾苷和馬錢苷通過抑制細胞內(nèi)Caspase-9和Caspase-3因子表達，增加Bcl-2/Bax蛋白比值，進而抑制細胞凋亡，延長細胞存活，同時促進細胞再生，抑制細胞氧化損傷。這與前期本課題組對該方的作用機制研究結(jié)果相符，而本方由左歸丸化裁而來，山茱萸中的莫諾苷、馬錢苷也常作為左歸丸的質(zhì)量檢測主要成分[13-15]，已被2015年版《中華人民共和國藥典》列為山茱萸的指標性成分，并對其含量作出明確規(guī)定[16]。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，柔肝止痛，斂陰止汗，平抑肝陽之功效，在此方中用量重，突出其在本方中的養(yǎng)血活血之效。現(xiàn)代研究報道[17]芍藥苷是白芍的主要有效成分。芍藥苷能影響雌激素合成素的分泌水平，使E2的分泌量明顯增加，對排卵現(xiàn)象、不孕癥、女性生殖系統(tǒng)疾病有顯著的治療作用[18-19]。

補腎活血方因藥味較多且成分復(fù)雜，具有多種藥理作用，因此，本課題組通過前期機制研究與文獻查閱，擬以補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷為研究對象，測定含量，再用馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷干預(yù)卵巢早衰模型小鼠，研究其對卵巢早衰的療效，并以臨床作為卵巢早衰診斷標準的FSH、LH、E2為評價指標，觀察激素水平變化，為研究補腎活血方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供新的思路。

1 材料

1.1? 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent公司;RE52AA系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司;CP114 型電子精密天平，奧豪斯儀器有限公司;Axioplan 2 imaging E生物顯微鏡，ZEISS公司;Spark20M多功能微孔板酶標儀，TECAN公司。

1.2? 試藥

對照品莫諾苷（批號：111998-201703，質(zhì)量分數(shù)97.4%）、馬錢苷（批號：110640-201707，質(zhì)量分數(shù)99.0%）、芍藥苷（批號：110736-201842，質(zhì)量分數(shù)97.4%），均為中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈、甲醇為色譜純，湖南匯虹試劑有限公司提供;補腎活血方飲片（批號：20180830、20181218、20190215、20190910）由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供;小鼠透明帶多肽溶液：小鼠透明帶3（ZP3）第330～342個氨基酸序列（NSSSSQFQIHGPR），分析純度>90%，杭州中肽生化有限公司;弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司;FSH、LH、E2酶聯(lián)免疫試劑盒，上海晶天生物科技有限公司，批號：20190824。

1.3? 動物

選取8周齡，體質(zhì)量18～22 g的SPF級雌性BALB/c小鼠36只，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證：SCXK（湘）2016-0002，均經(jīng)陰道脫落細胞涂片篩查動情周期正常。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～70%，自由進食飼料飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1? HPLC測定補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量

2.1.1? 色譜條件? 色譜柱Hypersil ODS C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：237 nm;流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫0～5 min 95%～92% A;5～25 min 92%～85% A;25～35 min 85%～80% A;進樣量：10 μL;柱溫：30 ℃。

2.1.2? 對照品溶液制備? 分別精密稱取莫諾苷4.07 mg、馬錢苷1.16 mg、芍藥苷2.34 mg，加甲醇-水（1∶1）溶解定容至10 mL，0.45 μm濾膜濾過，制成混合對照品溶液。

2.1.3? 供試品溶液制備? 稱取補腎活血方（熟地黃15 g，黃精12 g，枸杞子12 g，山茱萸12 g，當歸15 g，川芎9 g，白芍12 g，丹參12 g，桃仁9 g）飲片于圓底燒瓶內(nèi)，加水回流提取2次，濃縮至0.0864 g/mL備用。

2.1.4? 陰性對照試驗? 分別精密吸取混合對照品、補腎活血方（全方）對照品、補腎活血方（缺山茱萸）陰性對照品溶液和補腎活血方（缺白芍）陰性對照品溶液各10 μL，按“2.1.3”法制備。結(jié)果顯示缺山茱萸陰性對照和缺白芍陰性對照在色譜上無干擾，見圖1-4。

2.1.5? 線性關(guān)系考察? 以峰面積積分值為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線。得到莫諾苷線性回歸方程：Y=17 026X-8.694，r=0.999 8，線性范圍為203～4 070 μg;馬錢苷線性回歸方程：Y=22 200X-3.268 5，r=1.000 0，線性范圍為58～1 160 μg;芍藥苷線性回歸方程：Y=12 561X-62.032，r=0.999 4，線性范圍為117～2 340 μg。

2.1.6? 方法學考察結(jié)果? 精密度試驗測得莫諾苷、馬錢苷和芍藥苷峰面積的RSD值分別0.42%、0.17%、0.78%;穩(wěn)定性試驗測得莫諾苷、馬錢苷和芍藥苷峰面積RSD值分別為1.53%、0.41%、2.23%，各主要色譜峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%;重復(fù)性試驗測得補腎活血方供試品溶液（20180830）樣品中莫諾苷、馬錢苷和芍藥苷的峰面積RSD值分別為1.80%、2.26%、2.18%，各主要色譜峰峰面積的RSD均小于3%;加樣回收率試驗測得莫諾苷平均回收率為98.6%，RSD為2.18%（n=6），馬錢苷平均回收率為98.0%，RSD為1.28%（n=6），芍藥苷平均回收率為98.8%，RSD為1.77%（n=6）。

2.1.7? 樣品含量測定? 取3批補腎活血方飲片（201808、201812、201902），按照“2.1.3”項下供試品溶液方法制備，按照“2.1.1”色譜條件，測定莫諾苷、馬錢苷和芍藥苷在補腎活血方中的含量，詳見表1。

2.2? 馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷對免疫性卵巢早衰小鼠的影響

2.2.1? 分組與造模? 36只雌性BALB/c小鼠，按隨機數(shù)字表法分出 6只為空白組，剩下30只小鼠造模。將訂購的6 mg ZP3透明多肽粉，加入6 mL的雙蒸水配成溶液，與弗氏完全佐劑按照1∶1配制成免疫試劑，與弗氏不完全佐劑按照1∶1配制成免疫強化試劑。參照文獻[20]給予每只小鼠0.15 mL免疫試劑注射雙后腳掌處及腹腔皮下，14 d后給予免疫強化試劑0.15 mL再次注射雙后腳掌處及腹腔皮下加強免疫，建立免疫性卵巢早衰模型?？瞻捉M小鼠則給予0.15 mL生理鹽水注射相同部位。從注射免疫試劑的第8天開始，每天上午10：00對所有小鼠進行陰道脫落細胞涂片的HE染色，在光學顯微鏡下連續(xù)觀察7 d，查看小鼠的動情周期，出現(xiàn)動情周期紊亂表示模型制備成功[21]。

陰道脫落細胞涂片的HE染色結(jié)果顯示：空白組小鼠動情周期按動情前期-動情期-動情后期-動情間期變化;模型組小鼠與空白組小鼠相比，造模組小鼠動情周期按動情前期-動情后期-動情間期-動情期變化，出現(xiàn)了動情周期紊亂的情況，提示造模成功，見圖5-6。

2.2.2? 分組干預(yù)與血清FSH、LH、E2激素水平檢測? 將30只造模小鼠隨機分成5組，每組6只，分別為模型組、補腎活血方組、馬錢苷組、莫諾苷組、芍藥苷組。采用灌胃方式給藥，模型組、空白組予以生理鹽水;補腎活血方組給藥劑量均按照“人和動物體表面積折算的等效計量表”折算成臨床成人用藥劑量的2倍，均煎成濃縮液，每毫升含有生藥1.08 g，前期實驗結(jié)果證明在此劑量干預(yù)下，卵巢結(jié)構(gòu)較清晰，卵泡發(fā)育基本恢復(fù)正常[4];根據(jù)高效液相法測定的補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷測定結(jié)果，用標準品分別配成與補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量一致的溶液，也折算成臨床成人用藥劑量的2倍給藥（分別含1.286、4.599、3.065 g/kg生藥），連續(xù)給藥7 d，末次給藥后1 h，各組小鼠分別摘取眼球取血，收集血液后，靜置30 min后離心，血清留存，按ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清FSH、

LH、E2水平。

各組間小鼠血清E2、FSH、LH比較：與空白組比較，模型組E2水平明顯降低（P<0.01），F(xiàn)SH和LH的水平均升高明顯（P<0.01），提示造模成功;與模型組比較，補腎活血方組、馬錢苷組、莫諾苷組E2水平均顯著升高（P<0.01），F(xiàn)SH和LH的水平顯著降低（P<0.01），芍藥苷組E2水平均顯著升高（P<0.01），LH的水平顯著降低（P<0.01），F(xiàn)SH水平降低（P<0.05），詳見表2。

3 討論

本實驗采用HPLC對補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷進行含量測定，再予以補腎活血方、馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷對卵巢早衰模型小鼠進行灌胃，并用空白組、模型組作為對照，將臨床作為卵巢早衰診斷標準的FSH、LH、E2為評價標準，結(jié)果表明這三種苷均對激素E2、FSH、LH有改善作用。本實驗所選用的補腎活血方濃度相當于補腎活血方中劑量濃度，也是前期實驗結(jié)果證明下的最佳有效濃度，且選用的馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷單味成分含量與HPLC測定的補腎活血方中馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷含量相同，以確保能對馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷單味成分進行更好療效驗證。綜上，通過對化合物馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷的含量測定以及對卵巢早衰模型小鼠干預(yù)，本課題組認為馬錢苷、莫諾苷、芍藥苷為補腎活血方中可能的藥效物質(zhì)。

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（本文編輯? 楊? 瑛）