復方ANBP對小鼠皮膚移植創面愈合的療效觀察

周暢　陳麗　胡晉婷　王霄霜　楊丁丁　王婷婷　高嵐天　周忠志　陳聰

〔摘要〕 目的 觀察復方ANBP[由仙鶴草（Agrimonia eupatoria， A），藕節（Nelumbo nucifera Gaertn， N），乳香（Boswellia carteri， B）和蒲黃（Pollen Typhae， P）組成]對皮膚移植創面愈合的促進作用。方法 選用40只雌性C57BL/6小鼠，制成背部直徑1.2 cm圓形全層皮膚缺損小鼠模型，后進行自體原位皮膚移植術，隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予復方ANBP粉末敷于皮膚移植區，對照組不予處理。通過肉眼、HE染色觀察比較兩組皮膚移植區14 d及21 d時皮膚愈合情況，計算創面愈合率并進行統計學分析。結果 （1）皮膚移植14 d、21 d后，實驗組小鼠創面愈合率高于對照組（P<0.05）。（2）HE染色結果：皮膚移植14 d，實驗組較對照組皮膚移植交界處平坦、表皮嵴淺且連接緊密;皮膚移植區表皮層變薄、新生毛囊數量較多且發育良好。皮膚移植21 d，實驗組較對照組皮膚移植交界處皮下組織緊密呈更強的收縮感;皮膚移植區毛囊更成熟、發育趨于完善，出現了明顯的毛干、皮脂腺等皮膚附屬器。結論 復方ANBP能夠加快皮膚移植區與周圍皮膚銜接，加速皮膚移植愈合，促進皮膚附屬器發育及皮膚塑形，提高愈合質量。

〔關鍵詞〕 中藥復方;皮膚移植;創面愈合

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.007

〔Abstract〕 Objective To observe the improvement of compound ANBP[（Agrimonia eupatoria， A），（Nelumbo nucifera Gaertn， N），（Boswellia carteri， B），（Pollen Typhae， P）] for the wound healing of skin grafting. Methods Forty female C57BL/6 mice were used to create a 1.2 cm round full-thickness skin defect wound on the back of each mouse. Autologous skin transplantation was performed and randomly divided into a control group and an experimental group. The experimental group was given compound ANBP powder applied to the skin grafting area and the control group was not treated. The skin tissue healing of the 2 groups of skin grafting at 14 d and 21 d was observed and compared by naked eye and HE staining， and the wound healing rate was calculated and statistical analysis was performed. Results （1） After 14 d and 21 d of skin grating， the wound healing rate of the experimental group was higher than the control group （P<0.05）. （2） HE staining results showed that at 14 d of skin grafting， the experimental group had a flat skin at the junction of the skin graft， and the epidermis was shallow and tightly connected; the epidermal layer of the skin graft area became thinner， and the number of new hair follicles was larger and the development was good. At 21 d of skin grating， the experimental group had a stronger contraction of the subcutaneous tissue at the skin graft junction than the control group; the hair follicle in the skin graft area was more mature and developed， and there was obvious hair shaft structure and sebaceous gland. Conclusion Compound ANBP can accelerate the connection between the skin graft area and the surrounding skin， accelerate the healing of skin grafts， promote the development of skin appendages and skin shaping， and improve the quality of healing.

〔Keywords〕 Chinese compound formula; skin grating; wound healing

皮膚移植術是一種廣泛應用于臨床的有效治療手段，但如何提高植皮后創面愈合率仍需進一步探索[1-2]。目前，多種細胞生長因子、負壓引流技術、干細胞療法均被應用于提高皮膚移植創面愈合率，促進創面愈合[3-6]。但是，從中醫藥角度出發，將具有綜合作用的中藥應用于皮膚移植創面仍然比較少見。

中藥ANBP是由仙鶴草（Agrimonia eupatoria，A），藕節（Nelumbo nucifera Gaertn，N），乳香（Boswellia carteri，B）和蒲黃（Pollen Typhae，P）4味中藥組成的復方制劑，是本課題組治療創傷的經典中藥方，中醫認為其具有收斂止血、活血祛瘀、消腫生肌的功效，前期研究已證實[7-8]：復方ANBP在兔耳增生性瘢痕模型和小鼠背部皮層缺損模型中有促愈抑疤作用，但其能否促進皮膚移植創面愈合尚不清楚。本課題組通過觀察不同組別小鼠皮膚移植14 d、21 d時創面愈合情況，將兩組創面愈合率進行統計學分析，探究復方ANBP對皮膚移植創面愈合的影響，為其運用于皮膚移植治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1? 動物

選用40只成年雌性C57BL/6小鼠（4～6周、18～22 g），由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗期間動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院（許可證號：SYXK湘2015-0003）SPF級實驗室，溫度維持在20～22 ℃。所有的小鼠飼養及操作均遵循國家衛生研究院關于實驗室動物倫理準則和使用指南。

1.2? 主要藥物、試劑與儀器

復方ANBP由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室按照本課題組已有方法制備[7]。水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，250 g/瓶;批號Q/12HB 4218-2009）;4%多聚甲醛（長沙市開福區灝揚生物試劑經營部，500 mL/瓶;批號AR1068）;切片機（廠家：LEICA;型號：RM2235）;攤片機（廠家：LEICA;型號：HI1210）。

1.3? 造模與分組

完成小鼠適應性喂養3 d后，以3.5 mL/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，于小鼠背部正中剃毛形成1個4 cm×4 cm正方形裸皮區域，用絡合碘與酒精消毒處理后在小鼠背部正中用打孔器創設1個直徑為1.2 cm的圓形全層皮膚缺損區域，將取下來的皮片放入準備好的生理鹽水中浸潤以保持活力。盡可能清除背部創口區肌肉上層無血運的深筋膜，促進創面血液循環。取出浸泡于生理鹽水中的皮片，去除皮下脂肪、筋膜、血管等皮下組織，直至皮片盡可能僅包含表皮層呈半透明狀態，將其覆蓋于創口處。隨后開始植皮，用4-0的無菌縫合線、人用皮膚移植三角針進行縫合，邊緣縫6～8針。將造模成功小鼠隨機分為對照組（n=20）和實驗組（n=20），將復方ANBP粉末均勻敷于實驗組植皮區域，對照組不予處理。最后對移植區采用無菌紗布條加壓包扎，于10 d拆包。觀察到皮片成活則視為造模成功。術后分籠飼養，實驗過程中實驗組有1例由于麻醉不耐受死亡，對照組中有2例由于皮片感染未能成活，均視為造模失敗停止后續觀察。

1.4? 肉眼和HE染色觀察創面組織變化

肉眼觀察并拍照記錄皮膚移植區皮片存活狀態。計算皮膚移植區創面愈合率，創面面積使用Image Pro Plus軟件測量。

創面愈合率=（原始創面面積-測量時創面面積）/原始創面面積×100%

分別于皮膚移植14 d、21 d采用10%的水合氯醛麻醉，在小鼠背部切取以皮膚移植區為中心、深至肌層的2 cm×2 cm標本，用4%多聚甲醛固定，常溫保存，分別從兩組14 d、21 d不同時間點選取6份標本，送至湖南中醫藥大學醫學院實驗室，制成切片，行HE染色，觀察兩組皮膚移植區皮膚顯微結構形態和創面組織變化。

1.5? 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析，兩個樣本間的比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。計量資料以“x±s”表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 復方ANBP對皮膚移植創面愈合影響的肉眼觀察

對照組：皮膚移植14 d，皮片部分紅腫，壞死組織面積大呈黃黑色，皮片下滲出物多，且與周圍正常皮膚界限明顯。皮膚移植21 d，創面基本愈合，但被毛稀疏，毛發顏色暗沉無光澤。與對照組相比，實驗組皮膚移植14 d，皮片壞死面積明顯小于對照組，皮片下基本無滲出物且與周圍正常皮膚顏色一致;皮膚移植21 d，創面完全愈合，被毛豐富濃密，顏色黑亮。見圖1。

2.2? 復方ANBP對皮膚移植創面愈合率的影響

兩組皮膚移植術后14 d、21 d創面愈合率差異均具有統計學意義且實驗組明顯高于對照組（P<0.05）。見表1。

2.3? HE染色觀察皮膚移植區創面組織變化

皮膚移植14 d，對照組皮膚移植交界處表皮嵴深淺不一、連接不平坦，皮膚移植區表皮顆粒層增厚，存在伸入真皮乳頭層的釘突，真皮層結構紊亂，膠原纖維走向雜亂，可見充血毛細血管，均勻分布大量炎癥細胞，新生毛囊較少，深筋膜結締組織排列疏松。實驗組皮膚移植交界處表皮嵴深度均勻而平坦，真皮層膠原纖維排列有序，結構清晰，炎癥細胞在真皮層散在分布，可見較多發育良好的新生毛囊，真皮淺層可見少量皮脂腺，深筋膜結締組織排列緊密，皮膚結構層次更清晰（見圖2A-2D）。

皮膚移植21 d，對照組皮膚移植交界處膠原過度沉積，真皮組織厚而松散，皮膚移植區真皮層毛囊多但毛球發育幼稚。與對照組相比，實驗組皮膚移植交界處膠原排列緊密規則，真皮層有明顯的張力收縮感，皮膚移植區可見大量發育成熟毛囊、皮脂腺等皮膚附屬器官較多（見圖2E-2H）。

3 討 論

皮膚移植術是目前臨床治療各種創面的有效手段，保證移植皮片的存活即提高皮膚移植愈合率是手術成功的關鍵。近年來，多種創新型皮膚移植技術如Meek、微粒皮膚移植技術的出現以及多種臨床廣泛使用于創傷治療的技術與療法如生長因子、負壓引流技術等也被廣泛地應用于皮膚移植的輔助治療中。然而，皮膚移植愈合過程是受多種因素影響的，不同細胞、基質及細胞因子參與的復雜過程[9-12]。本課題組前期研究基礎證實復方ANBP應用于臨床創傷愈合具有一定的療效，但其對于皮膚移植創面的影響尚不清楚。本實驗肉眼觀察到與對照組相比，實驗組皮膚移植14 d，皮片紅腫、壞死面積小，皮片下滲出物少，且與周圍正常皮膚銜接更好，皮片存活狀態較好;皮膚移植21 d，實驗組創面基本愈合，皮膚平整，質軟且被毛豐富濃密，顏色黑亮。皮膚移植14 d、21 d實驗組皮膚移植愈合率均高于對照組，以上結果提示：復方ANBP可以促進小鼠皮膚移植愈合。

HE結果顯示：與對照組相比，實驗組皮膚移植14 d，實驗組皮膚移植交界處更加平坦連接緊密，皮膚移植區表皮層變薄趨于正常皮膚組織且出現較多新生毛囊，提示復方ANBP有利于皮膚移植皮片與周圍皮膚銜接，加速皮膚移植愈合。皮膚移植21 d，實驗組皮膚移植交界處皮膚結構緊密，皮層變薄，有收縮趨勢，皮膚移植區大量毛囊發育成熟、形成皮脂腺、立毛肌等皮膚附屬器官，膠原排列疏松有序，表明復方ANBP利于皮膚移植皮膚結構趨于成熟、功能逐漸完善，提高愈合質量。此外，我們推測復方ANBP在皮膚移植愈合后期可能具有促進創面收縮、降低纖維化的作用，這種作用應用于人體創傷面修復過程中可能具有抑制瘢痕的效果。

總之，本實驗通過建立小鼠背部全層皮膚原位自體移植模型，觀察比較創面愈合情況，運用復方ANBP加速皮膚移植皮片與周圍皮膚的銜接、促進毛囊等皮膚附屬器的發育和成熟，提高愈合質量，但復方ANBP對小鼠皮膚移植創面愈合的治療機制有待進一步驗證。

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（本文編輯? 蘇? 維）