基于網絡藥理學的枳實薤白桂枝湯治療冠心病的分子機制研究

張星　李曉　周國鋒　陳紀燁　王永成　彭波　董峰　林海青

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學方法研究枳實薤白桂枝湯治療冠心病的作用機制。方法 利用中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）篩選與枳實薤白桂枝湯相關的化學成分及其作用靶點;通過OMIM和NCBI數據庫獲取與冠心病相關的靶點，將疾病靶點與藥物靶點進行交集，篩選得到疾病-藥物成分共同靶蛋白。應用STRING平臺構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡模型;利用Cytoscape軟件構建“復方-活性成分-作用靶點-疾病”相互作用網絡;運用R語言進行KEGG 通路和GO功能富集分析。結果 經數據庫分析共獲得了1 801個疾病靶點，42個藥物作用靶點。對其中26個共同相關靶點（占枳實薤白桂枝湯靶點的62%）進行分析，發現共有119個生物學過程及58條通路被顯著富集。結論 枳實薤白桂枝湯治療冠心病具有多靶點、多通路的特點。其作用機制可能與調控冠心病發展過程中細胞代謝與凋亡、脂質代謝等過程有關。

〔關鍵詞〕 枳實薤白桂枝湯;冠心病;靶點;通路;網絡藥理學

〔中圖分類號〕R256.22? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.05.012

〔Abstract〕 Objective To analyze the action mechanism of Zhishi Xiebai Guizhi Decoction in the treatment of coronary heart disease based on network pharmacology. Methods TCMSP was used to select the chemical compounds and the effect targets related to the Zhishi Xiebai Guizhi Decoction; The targets related to coronary heart disease were screened through OMIM and NCBI databases. The common targets of disease-drug component were selected by intersecting disease targets with drug targets. A protein-protein interaction （PPI） network model was constructed using the STRING platform. The

"Compound-Active Compounds-Targets-Disease" interaction network was constructed by Cytoscape software. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway and Gene Ontology （GO） functional enrichment analysis were performed by R language. Results A total of 1801 disease targets and 42 drug targets were screened out by network analysis. For 26 of the common targets （62% of the target of Zhishi Xiebai Guizhi Decoction） were analyzed. A total of 119 biological processes and 58 pathways were found to be significantly enriched. Conclusion Zhishi Xiebai Guizhi Decoction in the treatment of coronary heart disease has the characteristics of multiple targets and multiple pathways. Its mechanism may be related to the regulation of cell metabolism and apoptosis， lipid metabolism and other processes in the development of coronary heart disease.

〔Keywords〕 Zhishi Xiebai Guizhi Decoction; coronary heart disease; targets; pathway; network pharmacology

冠心病的主要特征是冠狀動脈狹窄甚至梗阻，誘發冠脈功能改變，最終導致心肌缺血或壞死[1]。世界衛生組織最新統計數據表明，2012年全球有740萬人死于冠心病[2]。冠心病的治療常需采用昂貴的外科手術，而且伴隨手術風險較高的代價，已成為影響人們生命質量的重要危險因素。

冠心病屬于中醫學“胸痹”“真心痛”的范疇。醫圣張仲景在《金匱要略》記錄了冠心病治療的研究，提出“胸痹心中痞氣，氣結在胸，胸滿，脅下逆搶心，枳實薤白桂枝湯主之”，創立了枳實薤白桂枝湯。方中的枳實、厚樸功在開痞散結，下氣除滿;桂枝上可宣通心胸之陽，下以溫化中下二焦之陰氣，既通陽又降逆。降逆則陰寒之氣不會上逆，通陽則陰寒之氣不會內結。胡鏡清等[3]結合《金匱要略》成書年代以及“痰”的歷史發展淵源，認為方中的瓜蔞性苦寒滑潤，功專開胸行氣;并以溫通滑利、通陽行氣止痛之薤白為輔，驅逐寒濁之邪使之下行，遵“心傷宜食薤”之經旨;對于陽氣不通、陰邪為勝的胸痹療效顯著。

近年來研究證實，枳實薤白桂枝湯治療冠心病取得一定臨床效果，特別是其與西藥的聯合應用，臨床上取得了較為顯著的療效[4-5]。研究表明，枳實薤白桂枝湯聯合瑞舒伐他汀治療老年冠心病的療效確切，可減輕患者的高炎癥狀態及氧化應激反應，改善心臟功能[6]。枳實薤白桂枝湯能夠改善冠心病合并高脂血癥患者臨床癥狀，并能修復內皮功能及改善脂代謝[7]。枳實薤白桂枝湯聯合西藥可有效治療血瘀、痰濁為主的不穩定性心絞痛患者[8]。前期研究表明枳實薤白桂枝湯是治療冠心病的有效中藥復方，但是對于其具體作用機制尚不明確。

本研究基于網絡藥理學對枳實薤白桂枝湯治療冠心病的作用靶點、通路進行了探索，旨在揭示其從痰、寒論治冠心病的分子機制，從而為臨床研究提供研究依據。

1 材料與方法

1.1? 冠心病靶點的篩選

從人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org/）、美國國立生物技術信息中心數據庫（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），搜索關鍵詞“冠狀動脈粥樣硬化性心臟病”的官方英文名稱“coronary heart disease”，獲得疾病相關靶點。

1.2? 枳實薤白桂枝湯靶點的篩選

通過TCMSP數據庫依次檢索枳實、薤白、桂枝、瓜蔞、厚樸，并篩選口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的藥物成分，并將相關靶點用Uniprot數據庫處理，以確保靶點的規范化，建立靶點數據集，構建藥物成分作用靶點數據集。

1.3? 藥物-疾病靶點網絡構建

將疾病靶點與枳實薤白桂枝湯的靶點使用R語言（版本3.6.0）程序進行對比，以此篩選出共同的靶點，同時繪制韋恩圖。將得到的疾病藥物共同靶點輸入STRING 11.0網站（https：//string-db.org）構建蛋白-蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI）[9-11]，物種設為“Homo sapiens”（人類），其余參數保持默認設置，獲取相互作用關系，并根據連接度Degree調節節點的大小，繪制PPI網絡圖。

1.4? 交集靶點分析

利用Cytoscape 3.7.1軟件的關聯功能構建“復方-活性成分-作用靶點-疾病”網絡模型。利用Bioconductor平臺（http：//bioconductor.org/biocLite.R）和R語言對獲得的基因進行KEGG通路和GO功能富集分析。

2 結果

2.1? 冠心病靶點數據庫的篩選

基于OMIM以及NCBI數據庫，輸入關鍵詞“coronary heart disease”初步得到1 984個相關靶點，去除重復后保留1 801個靶點。

2.2? 枳實薤白桂枝湯靶點的篩選

基于TCMSP數據庫，得到53個活性化合物（見表1），其中厚樸2個、枳實22個、薤白11個、瓜蔞11個、桂枝7個（其中重復2個）。初步得到151個靶點，由于化合物靶點存在多重對應關系，篩選后最終確定42個唯一靶點。

2.3? 枳實薤白桂枝湯治療冠心病相關靶點預測和PPI網絡構建

將42個藥物預測靶點與1 984個冠心病相關性靶點，作為候選子集錄入R中，交集中共同靶點有26個。將共有的26個靶點導入STRING數據庫中，設置中度置信度，最小互作需求得分（minimumrequired interaction score）為0.400，最終得出101個作用關系，構建 PPI 網絡（見圖1），得到EGFR、PPARG、CASP3等關鍵靶點。應用 Cytoscape（3.7.1）軟件構建枳實薤白桂枝湯主要藥物成分-靶點-復方-疾病網絡拓撲圖（見圖2）。

2.4? GO生物功能和KEGG代謝通路富集分析

將26個靶點導入R中的ClusterProfiler[12] GO包和ClusterProfiler KEGG包，得到GO條目372個（P<0.01），其中涉及生物學過程326個;細胞組分13個;分子功能33個。列出生物學過程中P值最小的前20個（見圖3）。KEGG通路富集分析得出相關通路58條。其中有20條通路與之明顯相關（見圖4），Estrogen signaling pathway（雌激素信號通路）、Apoptosis（細胞凋亡通路）、p53 signaling pathway（p53信號通路）、VEGF signaling pathway（血管內皮生長因子通路）等。在富集通路中發現4個關鍵靶點：CASP9、CASP3、CASP8、RELA。

3 討論

冠心?。ㄐ乇裕┑牟±硪蛩匾蕴?、瘀、濕、熱、濁、毒為主，其中痰、瘀最為常見。冠心病痰濁證常伴脂質代謝紊亂，進而導致脂質過氧化;血行瘀滯，易發生組織缺血缺氧;而伴隨的內皮炎癥常誘導免疫細胞活化、聚集，致使血管損傷[13-15]。動脈粥樣硬化是冠心病的發病基礎，該過程中炎癥因子通過刺激巨噬細胞產生IL-6、TNF等細胞因子，產生過氧化狀態造成神經損傷;在肝臟合成C反應蛋白，通過激活補體系統產生大量終末產物，攻擊血管內膜造成內膜損傷，引起鈣離子超載，進而引起血小板黏附、聚集，形成不穩定斑塊，阻礙血液流動，導致血管栓塞[16-17]，最終引發血管性疾病。

枳實薤白桂枝湯是中醫臨床治療冠心病的經典方。現代研究[18-20]表明，枳實具有抗炎作用，其成分可以抑制炎性因子的釋放，減輕血管內皮損傷;薤白可顯著降低高脂血癥患者血清總膽固醇和低密度脂蛋白含量，降低甘油三酯水平，縮小動脈粥樣斑塊的厚度;同時，薤白提取物可以抑制平滑肌細胞的增生，從而抗動脈粥樣硬化;瓜蔞可舒張冠狀動脈，改善冠脈血流量，促進血小板解聚并防止其凝聚，增強機體耐缺氧能力;桂枝可促進心肌收縮。厚樸具有抑制血小板聚集和ATP釋放、松弛平滑肌的作用。枳實薤白桂枝湯對血液流變學異常也有較好的改善作用，能提高血管內皮細胞抗氧化能力，尤其在血管內皮細胞損傷的保護、高凝狀態抑制等方面有一定優勢[21]。

本文應用網絡藥理學的研究方法，通過對枳實薤白桂枝湯治療冠心病的靶點進行數據挖掘與分析，構建了“復方-活性成分-作用靶點-疾病”網絡和PPI網絡，發現各蛋白靶點之間關系密切，提示藥物作用機制復雜多樣，非單一蛋白靶標作用而成。對PPI網絡中關鍵靶點進行分析，其中EGFR是一種酪氨酸激酶受體，其變異與血糖和甘油三酯水平相關[22]，提示可能通過降低血糖與血脂保護血管內膜，進而延緩冠狀動脈粥樣硬化的發展;PPARG是參與脂質調節的關鍵因素，作為冠心病的候選基因既往已引起了廣泛關注[23]。網絡中PPARG自由度相對較高，即由PPARG直接參與的生物過程較多，提示其在整個治療中所具有的生物學重要性較大。CASP3在細胞凋亡中起著關鍵作用[24]，當細胞線粒體膜損傷時，線粒體的細胞色素釋放出來，釋放到細胞外，激活CASP3從而誘導細胞凋亡[25]。提示枳實薤白桂枝湯在保護血管內膜以及調節脂質代謝方面發揮作用。

通過對枳實薤白桂枝湯的GO功能富集分析可見，其主要富集的生物學過程包含對類固醇激素的反應、對脂肪酸的反應，以及膽固醇、脂肪酸等的代謝過程，外在凋亡信號通路等。由此可推測，枳實薤白桂枝湯可通過調節基因表達，免疫與代謝以及抗炎修復等過程來治療冠心病，其中尤其體現在調控脂質代謝的過程。

KEGG通路富集分析發現4個關鍵靶點：CASP9、CASP3、CASP8、RELA，幾乎每條關鍵通路都有他們的參與。既往研究證實，CASP3在細胞凋亡中起著關鍵作用[24]，與心律失常和心肌細胞凋亡有著密切關系[26]，當細胞線粒體膜損傷時， 線粒體的細胞色素釋放出來， 釋放到細胞外，激活CASP3從而誘導細胞凋亡[25]。而CASP8、CASP9與細胞凋亡的起始有關。RELA基因對細胞的炎癥反應、免疫應答等過程具有關鍵作用。關鍵通路包括p53信號通路、雌激素信號通路、細胞凋亡通路、血管內皮生長因子通路。研究體外細胞實驗和整體動物實驗時發現，缺氧、缺血和缺血再灌注損傷過程中，p53基因的表達都會增加;其他研究也提示p53基因在高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病的進展中發揮著重要作用[27-28]。抑制p53信號通路的激活將會成為防治心力衰竭的重要靶點[29];任良強等[30]提出雌激素信號通路是中藥薤白作用冠心病的最主要通路。本方中薤白作為君藥，尤其對緩解冠心病過程中胸悶胸痛具有重要意義。細胞凋亡通路對心室重塑具有重要意義，是影響動脈粥樣硬化以及最終的心力衰竭的關鍵環節，在枳實薤白桂枝湯治療過程中亦發揮出顯著作用;許多研究均表明血管內皮生長因子與冠狀動脈的病變程度以及預后密切相關，能反應心肌的缺血程度[31]，可顯著增加側枝依賴性缺血心肌的血流。對冠心病過程中一過性心絞痛以及心前區壓榨性疼痛感具有緩解作用。

綜上所述，可以預測枳實薤白桂枝湯通過作用于CASP9、CASP3、CASP8、RELA等關鍵靶點參與抑制炎癥破壞，減輕血管內膜損傷的過程。調控p53信號通路、雌激素信號通路、細胞凋亡通路、血管內皮生長因子通路等發揮善血液循環、延緩心室重塑，防治心力衰竭的作用，為枳實薤白桂枝湯治療冠心病的進一步研究提供了實驗基礎。

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（本文編輯? 蘇? 維）