T淋巴細胞表型對慢性HBV感染免疫狀態的影響及應用價值

趙金花， 李俊峰， 毛小榮

1 蘭州大學第一臨床醫學院， 蘭州 730000； 2 蘭州大學第一醫院 a.傳染病研究室; b.感染科， 蘭州 730000

Effect of T-lymphocyte phenotype on immune status in chronic hepatitis B virus infection and its application value

ZHAOJinhua,LIJunfeng,MAOXiaorong.

(TheFirstClinicalMedicalCollege,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the association between T-lymphocyte phenotype and immune status in chronic hepatitis B (CHB) and its application value.MethodsA total of 77 CHB patients who attended The First Hospital of Lanzhou University from January 2015 to May 2019 were enrolled, and according to the status of HBeAg and the serum levels of alanine aminotransferase (ALT), HBsAg, and HBV DNA, they were divided into immune tolerance group and non-immune tolerance group. The laboratory results of T-lymphocyte phenotype, HBV serological test, HBV DNA load, routine blood test, and liver function were obtained, and aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index (APRI) and fibrosis-4 (FIB-4) were calculated. Thettest was used for comparison of normally distributed continuous data between two groups; and the Mann-WhitneyUtest was used for comparison of non-normally distributed continuous data between two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups. Spearman correlation analysis was used to test the correlation effect between the two variables. The diagnostic efficacy of Treg, CD8+PD-1+T lymphocyte percentage and CD8+CD45RO+T lymphocyte percentage were evaluated by AUC.ResultsCompared with the non-immune tolerance group, the immune tolerance group had significantly higher percentages of Treg and CD8+PD-1+T cells (U=12.0 and 59.0,P<0.001,P=0.013) and significantly lower percentages of CD3+CD8+T cells and CD8+CD45RO+T cells (U=50.0 and 38.5, bothP<0.05). Compared with the high HBV DNA load group, the low HBV DNA load group had significantly lower percentages of Treg and CD8+PD-1+T cells (U=178.5 and 255.0,P=0.003 and 0.018) and significantly higher percentages of CD3+T cells and CD8+CD45RO+T cells (U=104.0 and 149.5,P=0.033 and 0.025). APRI was negatively correlated with the percentage of Treg (r=-0.379,P=0.013), and FIB-4 was negatively correlated with the percentages of CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD4+CD45RO+, and CD8+CD45RO+T cells (r=-0.259, -0.275, -0.233, and -0.229,P=0.023, 0.016, 0.041, and 0.045). Treg, CD8+PD-1+T cells, and CD8+CD45RO+T cells had an area under the ROC curve of 0.793 (95% confidence interval [CI]: 0.651-0.936), 0.802 (95% CI: 0.678-0.927), and 0.816 (95% CI: 0.706-0.927), respectively, in evaluating immune status.ConclusionThere are various T-lymphocyte phenotypes in patients with chronic HBV infection, and different T lymphocytes have different abilities to eliminate HBV. Detection of T-lymphocyte phenotype helps to understand the immune status and adjust the immune function in CHB patients and can provide a reference for the functional cure of CHB patients.

Keywords：hepatitis B, chronic； T-lymphocyte subsets； immunity, cellular

HBV感染是引起慢性肝病的主要原因，其特點是炎癥、肝細胞損傷和肝纖維化的緩慢進展。據世界衛生組織估計，每年約有2.4億人感染HBV，只有不到1%的慢性HBV感染通過抗病毒治療治愈，因此就產生了長期或終生治療的需求[1]。HBV的清除在很大程度上依賴有效的T淋巴細胞免疫反應，在慢性HBV感染中，這種反應通常會變得失調。研究[2]表明，即使在急性HBV感染期間循環內的特異性T淋巴細胞頻率也是適中的，并且在慢性感染中進一步降低。感染HBV還可以通過處理和遞呈異常高水平的病毒粒子和亞病毒顆粒對免疫系統長期攻擊，反復觸發T淋巴細胞受體，導致T淋巴細胞衰竭[3-4]。目前的抗病毒治療很少達到治愈的目的，迫切需要新的治療方法來恢復HBV特異性T淋巴細胞免疫，以盡快達到慢性HBV的功能性治愈。初治慢性HBV感染者的轉錄基因顯示，在慢性HBV感染的不同階段有不同的血液基因特征，這表明不同階段T淋巴細胞的激活是不同的[5]。此外，肝臟免疫狀態是通過肝臟炎癥反應表現，免疫反應越強，炎癥程度越強，但嚴重的炎癥反應可導致肝纖維化程度的增加而加快肝硬化進展。因此，評估慢性HBV感染患者免疫狀態是實現HBV功能性治愈的基礎，通過研究不同T淋巴細胞表型百分比與肝纖維化程度的相關性，尋找治療與肝臟炎癥反應之間的平衡點。本研究擬通過觀察慢性HBV感染初治患者外周血T淋巴細胞表型百分比與不同免疫狀態及HBV DNA不同水平以及與肝纖維化程度之間的相關性，為了解慢性HBV感染初治患者的免疫狀態及恢復HBV特異性免疫功能提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年1月-2019年5月在蘭州大學第一醫院就診的慢性HBV感染初治患者77例，篩選流程見圖1。其中免疫耐受期68例，非免疫耐受期9例。慢性HBV感染患者診斷依據臨床實踐指南[6]。排除標準：(1)合并肝細胞癌、肝移植、脾切除、血液系統疾病、丙型肝炎及戊型肝炎、AIDS、遺傳代謝性肝病、酒精性和非酒精性脂肪性肝病；(2)合并有活躍的自身免疫性疾病、藥物或可能影響免疫功能的共同疾病。本研究方案經由蘭州大學第一醫院倫理委員會審批(批號：LDYYLL2019-254)。

1.2 研究方法

1.2.1 觀察指標 收集患者的一般資料、T淋巴細胞表型、HBV血清學標志物、HBV DNA載量、血常規、肝功能等主要實驗室指標，并計算肝纖維化血清學診斷指標APRI及FIB-4。

1.2.2 流式細胞術T淋巴細胞亞群及調節性T淋巴細胞(Treg)檢測 外周血單個核細胞中加入熒光素標記的單克隆抗體CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD4+CD25+Foxp3(Treg)和小鼠IgG1-FITC及小鼠IgG2-PE做為對照(美國BD公司)直接標記全血細胞，溶血素溶解紅細胞，PBS洗滌兩次，流式細胞儀(美國BD公司)檢測T淋巴細胞，CellQuest軟件獲取分析細胞進行分析，計算CD3+、CD4+、CD8+、Treg、CD8+PD-1+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+細胞。

圖1 研究對象的篩選流程

1.2.3 免疫狀態分期 根據國內指南[6]，將年齡較輕、HBV DNA>107IU/ml、HBsAg水平較高(通常>104IU/ml)、HBeAg陽性及ALT持續正常患者列為免疫耐受期患者，其余患者均列為非免疫耐受期患者。

2 結果

2.1 一般資料 慢性HBV感染初治患者中HBeAg陰性組44例，其中男32例，女12例，HBeAg陽性組33例，其中男22例，女11例，根據HBeAg狀態分為2組，CD3+CD4+T淋巴細胞百分比和HBsAg水平在HBeAg陽性組與HBeAg陰性組間差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 不同免疫狀態下T淋巴細胞表型百分比的比較結果

慢性HBV感染后患者不同免疫狀態表現出不同的T淋巴細胞表型百分比。Treg和CD8+PD-1+細胞百分比在免疫耐受期明顯高于非免疫耐受期，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；CD8+CD45RO+百分比和CD3+CD8+百分比在免疫耐受期明顯低于非免疫耐受期，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表2)。

2.3 不同HBV DNA載量組各T淋巴細胞表型百分比的比較結果 為了進一步評估不同T淋巴細胞表型對HBV DNA的清除作用，根據HBV DNA載量將患者分為HBV DNA高載量組(>500 IU/ml)和HBV DNA低載量組(≤500 IU/ml)。結果顯示Treg和CD8+PD-1+百分比在HBV DNA低載量組明顯低于HBV DNA高載量組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)；CD3+和CD8+CD45RO+百分比在HBV DNA低載量組明顯高于HBV DNA高載量組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表3)。

2.4 不同T淋巴細胞表型的百分比與肝纖維化血液學診斷指標的相關性 分析結果顯示，不同T淋巴細胞表型百分比中僅有Treg與APRI有相關性，且呈負相關(P=0.013)；而與FIB-4相關性分析顯示，CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RO+這四種T淋巴細胞百分比與FIB-4呈負相關(P值均<0.05)，隨著上述四種T淋巴細胞百分比的降低肝纖維化程度逐漸加重(表4)。

表1 不同HBeAg狀態的慢性HBV感染初治患者指標比較

表3 不同HBV DNA載量組各T淋巴細胞表型的比較(%)

表4 不同T淋巴細胞表型百分比與肝纖維化血液學診斷指標的相關性

2.5 Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+百分比對于免疫狀態的評估效能 T淋巴細胞表型百分比評估免疫狀態的ROC曲線分析結果顯示，Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+的AUC值均>0.7(表5)。

表5 3種T淋巴細胞百分比對于免疫狀態的評估效能

3 討論

人體感染HBV后，體內抵御病毒的免疫反應主要是細胞免疫，如T淋巴細胞通過細胞溶解途徑和非細胞溶解途徑清除病毒，感染即可得到控制，反之，病毒將長期存在[7]。近年來，關于慢性HBV感染的免疫功能研究越來越多，其中大部分是基于動物實驗，而對于檢測患者外周血中不同T淋巴細胞表型的研究尚處于初始階段。本研究通過流式細胞術檢測不同T淋巴細胞表型的表達水平并首次將其用于評估慢性HBV感染患者的免疫狀態，為進一步調節慢性HBV感染患者免疫功能進而達到功能性治愈提供依據。本研究顯示，Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+T淋巴細胞百分比與免疫狀態及HBV DNA載量有關，可以推測這三種表型T淋巴細胞百分比的下降與免疫功能的衰竭及HBV的清除能力低下有關，這與既往的研究中慢性HBV感染患者Treg對HBV清除的抑制作用及細胞毒性T淋巴細胞衰竭時表現的免疫抑制相對應。

本研究顯示，HBV DNA水平低者，Treg百分比低，HBV DNA水平高者Treg百分比高。Treg是一類具有免疫抑制功能的T淋巴細胞亞群，是細胞免疫中重要的調節細胞，在維持機體免疫耐受方面起著關鍵作用。既往研究[8]顯示相比未感染的動物，土撥鼠肝炎病毒感染的土撥鼠肝臟中Treg的百分比明顯升高，肝臟Treg的增加伴有抗炎細胞因子(如TGFβ1和IL-10)和免疫抑制分子如程序性死亡受體1(PD-1)及其配體(PD-L1)的表達顯著增加。此外，研究[9]顯示，HBV感染的小鼠中，濾泡輔助性T淋巴細胞是清除HBV所必需的，并且能被Treg所抑制；進一步的研究顯示，去除Treg或抑制Treg功能(用CTLA-4封閉抗體)可恢復濾泡輔助性T淋巴細胞對HBV DNA的清除。另外，Treg百分比與APRI呈負相關也可以推斷，Treg在HBV的清除過程中起抑制作用，抑制肝臟炎癥反應進而減慢肝纖維化進展。因此，阻斷Treg功能可能有助于控制HBV感染,本研究也證實了既往研究結果。

已有大量的細胞實驗和動物實驗證實，HBV特異性T淋巴細胞是HBV感染的免疫控制所必需的。因此，對于慢性HBV感染患者免疫功能衰竭的大多數研究集中于恢復T淋巴細胞的活性，特別是CD8+T淋巴細胞。CD8+T淋巴細胞是清除HBV感染細胞的主要效應T淋巴細胞，通過細胞溶解和非細胞溶解機制兩種途徑清除HBV感染細胞[10-11]。而PD-1分子是表達于CD8+T淋巴細胞衰竭時最突出的標志物，是CD8+T淋巴細胞抑制性受體，負性調節其活化、增殖和細胞因子的產生，進而抑制對HBV的清除。此前已有研究[12-13]顯示，慢性HBV感染者PD-1、PD-L1表達較健康對照組明顯升高，提示PD-1表達上調與HBV感染慢性化相關。更進一步在慢性HBV感染的研究[14]中，檢測到了與病毒逃逸相容的序列，最常見的是以表達高水平PD-1的T淋巴細胞為靶向的核心表位。同樣的基于PD-1阻斷的免疫療法將恢復CD8+T淋巴細胞的抗病毒功能。在本研究中，PD-1的表達在免疫耐受期明顯高于非免疫耐受期，且HBV DNA高載量者明顯高于HBV DNA低載量者，其與Treg一樣抑制清除病毒的免疫反應。

此外，本文評估了不同免疫狀態下慢性HBV感染者的T淋巴細胞表型百分比。關于恢復慢性HBV感染者免疫功能的研究中，主要是根據不同免疫狀態下T淋巴細胞表型百分比的變化情況進一步調整慢性HBV感染者的免疫功能，從而達到治療的目的。大多數免疫治療的目的是加強機體對HBV功能失調的特異性免疫應答，其中T淋巴細胞工程就是要人工替代HBV特異性CD8+T淋巴細胞[15]。淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒小鼠模型的實驗數據[16]顯示，T淋巴細胞衰竭的不同階段具有不同的恢復能力，提示慢性HBV感染的免疫治療可能必須根據感染不同階段CD8+T淋巴細胞表型進行調整。本研究表明隨著免疫狀態的活化，Treg與CD8+PD-1+細胞百分比呈下降趨勢而CD8+CD45RO+T淋巴細胞百分比呈上升趨勢，且三種T淋巴細胞表型百分比對慢性HBV感染者的免疫狀態的診斷效能均較高。因此，根據Treg、CD8+PD-1+和CD8+CD45RO+T淋巴細胞百分比在慢性HBV感染者的不同免疫狀態的變化情況，及時調整慢性HBV感染者體內紊亂的免疫功能，可望恢復患者清除HBV的主動免疫，從而達到功能性治愈。

綜上所述，通過對不同HBV特異性T淋巴細胞表型與免疫狀態及HBV DNA載量的研究，可以推測Treg、CD8+PD-1+及CD8+CD45RO+T淋巴細胞在慢性HBV感染者不同免疫狀態下的變化情況，及時調整免疫功能，恢復HBV特異性免疫細胞的主動免疫，從而恢復對HBV的清除功能。同時，本研究仍有難以避免的不足之處，所選樣本量較少，且由于臨床數據不足未能根據患者肝硬化Child-Pugh評分進一步分組，此外，由于回顧性研究本身特性的缺陷，大量患者缺乏后續隨訪數據，未能評估其預后情況。因此，將來的研究有待進一步的優化。