皮克林乳液聚合法制備辣根過氧化物酶印跡材料

馬珍珍,趙 濤

(齊魯工業大學(山東省科學院)食品科學與工程學院,山東濟南 250353)

糖蛋白是由寡糖和多肽鏈共價修飾連接而形成的一類重要生理活性物質。糖蛋白對于增殖的調控、受精、發生、分化以及免疫等生命現象,起著十分重要的作用[1-4]。糖蛋白還是一種重要的診斷標記物,病變的細胞表面的糖蛋白脫落進入體液或血液循環,糖蛋白的異常表現作為疾病診斷重要依據[5-6]。針對糖蛋白的分離材料以及快速檢測手段受到了研究者的廣泛關注,然而糖蛋白的分離分析研究中存在豐度低以及基質干擾嚴重等問題[7-8]。在近些年的研究中,苯硼酸作為一種糖類親和試劑受到了廣泛的關注,特別是在大分子糖類物質的分離、分析以及保護方面[9-13]。

苯硼酸的糖類親和性主要依靠硼酸配體與順二羥基結構之間形成的可逆共價鍵,圖1展示了苯硼酸與含有順二羥基結構物質識別的過程。當體系中的pH超過苯硼酸配體的pKa值時,硼酸基團與體系中的羥基絡合,形成sp3雜化軌道,呈現四面體結構,這種結構能夠特異性的識別糖類的順二羥基結構,并通過脫水形成五元或者六元環酯。當體系中的pH降低時,硼酸酯之間的共價鍵通過水解斷裂,苯硼酸基團恢復至sp2的平面結構?？赡婀矁r鍵之間的轉換特性賦予了苯硼酸良好的糖類親和特性以及pH響應特性,可應用于糖類物質的快速分離和檢測[14-16]。

圖1 苯硼酸與順二羥基結構之間的關系Fig.1 Relationship between phenylboronic acidand cis-dihydroxy structure

皮克林乳液是利用固體顆粒代替表面活性劑來穩定兩相形成的乳液[17-18]。皮克林乳液聚合法制備分子印跡材料能夠避免表面活性劑對于材料結構以及性能的影響,同時提高材料在生物大分子以及活體檢測上的應用[19]。皮克林乳液聚合法作為一種制備分子印跡材料的新手段受到了研究者的廣泛關注[20-22],特別是在制備蛋白印跡材料方面[23-25]?，F階段大部分研究都是以二氧化硅作為穩定劑來制備分子印跡材料,例如:Zhou等[26]利用二氧化硅為皮克林乳液穩定劑,在水包油體系中通過皮克林乳液聚合的方式制備了人體血紅蛋白印跡材料。以二氧化硅為皮克林乳液穩定顆粒制備分子印跡材料存在一個問題,即在合成分子印跡材料的最后階段需要用氫氟酸去除二氧化硅顆粒,氫氟酸會破壞合成的分子印跡材料的印跡孔穴。

常規的糖蛋白分子印跡材料在水相中制備,苯硼酸功能單體在水相中溶解性差,制備的分子印跡材料為塊狀結構,印跡位點分布不均勻,材料形貌差。本研究以聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)微球作為糖蛋白識別單元,通過兩相界面上的聚合反應,制備高特異性的糖蛋白印跡材料,可以解決苯硼酸功能單體溶解性差,糖蛋白印跡材料識別位點分布不均的問題,利用糖蛋白(辣根過氧化物酶、雞卵蛋白、轉鐵蛋白、伴清蛋白)以及非糖蛋白(牛血清蛋白、細胞色素C)對合成的辣根過氧化物酶印跡材料的選擇吸附能力、吸附動力學性能以及可重復性能進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二乙烯基苯混合物(DVB) 純度80%,國藥集團;偶氮二異丁腈(AIBN)、4-乙烯基苯硼酸(4-Vinylphenylboronic acid,PBA)、堿性氧化鋁(Alkaline alumina、N-異丙基丙烯酰胺(N-Isopropyl acrylamide,NIPAAm) 國藥集團;辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP) 酶活度150 U/mg,美國Sigma-Aldrich公司;雞卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)、伴清蛋白(Conalbumin,CON) 純度≥97%(HPLC),美國Sigma-Aldrich公司;轉鐵蛋白(Transferrin,TRF)、牛血清蛋白(Bovine albumin,BSA) 純度≥98%,美國Sigma-Aldrich公司;細胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C) 純度≥95%,美國Sigma-Aldrich公司;所有使用有機溶劑 均為國產分析純。

Cary 50-Bio型紫外分光光度計 澳大利亞Victoria公司;Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier Transform Infrared Spectrometer,FTIR) 美國Nicolet公司;SU1510型掃描電鏡(SEM) 日本Hitachi公司;ZK-35BS型真空干燥箱 天津三水科學儀器有限公司;PHSJ-3F型pH計 上海雷磁儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗藥品的處理 采用重結晶法處理引發劑偶氮二異丁腈(2,2-Azobisisobutyronitrile,AIBN)。處理過程如下:將200 mL乙醇加入到500 mL錐形瓶中,80 ℃水浴加熱15 min。將20 g偶氮二異丁腈加入到上述溶液中,超聲使其完全溶解,趁熱立即抽濾,待濾液冷卻后,收集析出的白色晶體。將重結晶后的偶氮二異丁腈低溫保存在棕色瓶中備用。

二乙烯基苯(Divinylbenzene,DVB,80%)混合物中阻聚劑的去除,其過程如下:取200 mg的堿性氧化鋁裝填至固相萃取小柱中,取3 mL的二乙烯基苯混合物過柱,將純化后的二乙烯基苯低溫避光儲存。

N-異丙基丙烯酰胺(N-Isopropyl acrylamide,NIPAAm)純化過程如下:正己烷中重結晶3次,室溫真空干燥,得白色針狀晶體,低溫避光儲存。

1.2.2 溶劑熱法制備聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)微球 將4-乙烯基苯硼酸(1.48 g,10 mmol)和二乙烯基苯(1.30 g,10 mmol)加入到80 mL乙腈中,超聲充分溶解后,將上述溶液加入到100 mL反應釜中。加入引發劑AIBN(60 mg,0.37 mmol),超聲溶解,充氮氣15 min后,置于110 ℃烘箱中反應8 h。將產物通過砂芯漏斗(G5)抽濾,去除反應溶劑,然后用甲醇洗滌三遍,去除未反應的試劑,最后真空干燥。

1.2.3 皮克林乳液聚合法制備辣根過氧化物酶印跡材料 辣根過氧化物酶印跡材料制備:首先將200 mg聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)微球加入到裝有15 mL甲苯的螺口試劑瓶中,超聲(功率:360 W,頻率:40 kHz,)30 min。然后在水相(5 mL)中加入10 mg辣根過氧化物酶,150 mg 丙烯酰胺以及50 mg異丙基丙烯酰胺作為功能單體,10 mg N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺作為交聯劑,孵育20 min。將甲苯與水相混合,大力搖晃3 min,直至形成穩定的皮克林乳液,加入引發劑10 mg過硫酸銨,以及催化劑四甲基乙二胺(20 μL),30 ℃水浴反應24 h。聚合反應結束后,通過傾析去除上層透明油相,然后將乳液倒入G5砂芯漏斗中,用十二烷基硫酸鈉(10%,v/v)和乙酸(10%,v/v)洗滌,去除模板分子,直至紫外檢測無模板信號,真空干燥得到最終的辣根過氧化物酶印跡聚合物。

非印跡材料的合成方法除不加入模板辣根過氧化物酶外,與上述印跡材料合成方法一致。

1.2.4 材料的表征

1.2.4.1 紅外光譜表征 準確稱取三份干燥的溴化鉀晶體150 mg,分別放入三個研缽中。分別加入2 mg已干燥的聚合物微球。研磨混勻,壓片,用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析測試。

1.2.4.2 掃描電鏡 使用掃描電子顯微鏡對合成的材料進行觀察。

1.2.5 辣根過氧化物酶印跡材料的選擇性吸附試驗 以辣根過氧化物酶(HRP)、雞卵白蛋白(OVA)、伴清蛋白(CON)和轉鐵蛋白(TRF)作為糖蛋白對照組,牛血清蛋白(BSA)和細胞色素C(Cyt-C)作為非糖蛋白對照組,進行選擇性試驗。選擇性試驗過程如下:稱取辣根過氧化物酶印跡材料以及非印跡材料各10 mg分別加入到不同試管中,配制濃度為1 mg/mL的不同類型蛋白的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH9.0)。取1 mL 樣品標準液加入到試管中。放置在搖床上,4 ℃下振蕩一段時間后,離心取上清液(4000 r·min-1,15 min)。在波長為403 nm條件下,利用紫外分光光度計進行檢測。吸附容量用以下式(1)進行計算:

Q=(Ci-Cf)V/m

式(1)

其中,Ci和Cf分別代表溶液中模板分子吸附前和吸附后的濃度,mg/mL;V為樣品溶液的體積,mL;m為合成材料的質量,g。

1.2.6 辣根過氧化物酶印跡材料的等溫吸附曲線 配制0.1～1 mg/mL的辣根過氧化物酶標液,稱取辣根過氧化物酶印跡材料以及非印跡材料各10 mg分別加入到不同試管中,然后分別加入不同濃度的辣根過氧化物酶標液,置于搖床上,4 ℃下振蕩一段時間,離心取上清液。在波長為403 nm條件下,利用紫外分光光度計進行檢測。吸附容量用式(1)進行計算,所得的數據利用Origin軟件進行擬合。

1.2.7 辣根過氧化物酶印跡材料的吸附動力學試驗 將10 mg辣根過氧化物酶印跡材料分散于裝有5 mL辣根過氧化物酶Tris-HCl緩沖液(1 mg/mL)的離心管中。將其放置于搖床上,在低溫下振蕩,取振蕩不同時間后的樣品,4000 r/min離心15 min進行分離。取分離后的上清液,利用紫外分光光度計進行檢測。吸附容量用式(1)進行計算。

1.2.8 辣根過氧化物酶的重復性能評價 為了評價合成的辣根過氧化物酶的重復使用的性能,對合成的材料進行了重復性試驗:稱取合成的辣根過氧化物酶印跡材料(10 mg),加入1 mL 的1 mg/mL的辣根過氧化物酶的Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L,pH9.0)。放置在搖床上,4 ℃下振蕩40 min,離心取上清液,測定吸附容量。回收吸附后的辣根過氧化物酶印跡材料,利用SDS(10%,v/v)和乙酸(10%,v/v)混合液洗滌,去除模板分子,直至紫外檢測無模板信號。將洗脫后的材料再次浸入到1 mL的1 mg/mL的辣根過氧化物酶的Tris-HCl緩沖液中,重復上述吸附分離整個過程,重復五次,計算每循環吸附一次后的吸附量。

1.3 數據處理

采用Excel、Origin 8.0和GraphPad Prism 7軟件進行數據處理。使用Adobe illustrator和Power point軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 材料表征

圖2A結果表明,合成的聚合物微球形貌規整,其粒徑在1 μm左右,達到了亞微米級別。如圖2B所示,3446、1342 cm-1處的峰為硼酸基團的-OH的伸縮振動峰,3018 cm-1處的峰為苯環上的C-H鍵,1608 cm-1為苯環的C=C鍵振動,2237 cm-1處為B-O鍵,1803和1922 cm-1處分別為直鏈烯烴中的R-CH=CH中C-H和C-C振動,1608 cm-1處為共軛型的C-C振動。紅外結果表明成功合成了聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)。

圖2 材料的表征Fig.2 Characterization of materials注:聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)微球的掃描電鏡圖(A)和傅里葉紅外圖譜(B);皮克林乳液的光學顯微圖(C)和照片(D);辣根過氧化物酶印跡材料整體掃描電鏡圖(E)和表面掃描電鏡圖(F)。

圖2C結果表明合成的聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)能夠在甲苯和水的兩相體系中形成穩定的皮克林乳液。

在油包水體系中,水相以顆粒的形態分散到油相中形成乳液。利用小顆粒來代替表面活性劑作為油水兩相的穩定劑是皮克林乳液最主要的特征。要形成穩定的皮克林乳液體系,需要穩定劑既具備一定親水特性又具備一定的親油特性。聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)微球的親油性是因為其聚合單體二乙烯基苯,其親水性來自其聚合單體4-乙烯基苯硼酸的羥基基團。而常規聚(二乙烯苯-co-苯乙烯)微球由于其太過于親油,所以難以形成穩定的皮克林乳液。圖2D為辣根過氧化物酶印跡材料以及非印跡材料形成皮克林乳液的照片,試驗結果表明合成形貌規整的小球包大球的結構需要油相甲苯的量遠大于水相的量。原因可能是過量的甲苯使皮克林乳液中水相液滴能夠有效的分離,避免了成核過程中聚合反應導致的球體之間粘連。同時,辣根過氧化物酶自身具備良好的乳化效果,在制備辣根過氧化物酶印跡材料時,要控制辣根過氧化物的添加量以及乳化時間。

圖2E為辣根過氧化物酶印跡材料的掃描電鏡圖,疏水性粒子聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)顆粒附著在印跡材料的表面(圖2F),而內核為親水性水凝膠。這種結構賦予了合成材料的兩性親和性。其疏水性的外殼能夠有效的抵御外界環境影響,從而阻止內核水凝膠因吸水溶脹而破裂。同時,內部的水凝膠改善了苯硼酸類印跡材料的親水性,提高了材料在水相中的適用性。

2.2 辣根過氧化物酶印跡材料的選擇性試驗

由圖3可知,印跡材料對于辣根過氧化物酶的吸附量要明顯高于其他類型蛋白,該結果表明通過皮克林乳液聚合方式制備的辣根過氧化物酶印跡材料對于模板辣根過氧化物酶表現出良好的選擇性。該蛋白印跡材料對辣根過氧化物酶的吸附量是非印跡材料吸附量的5.00倍。同時,聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)作為皮克林乳液穩定劑與印跡材料復合,提高了印跡材料對于糖蛋白的選擇性,合成的印跡材料對于糖蛋白(辣根過氧化物酶)的吸附量是對于非糖蛋白(BSA)的吸附量的42.77倍(表1)。

表1 材料對于糖蛋白和非糖蛋白的選擇性能Table 1 Selective properties of materials for glycoproteins and non-glycoproteins

圖3 對于糖蛋白和非糖蛋白的吸附能力Fig.3 Adsorption capacity of theglycoproteins and non-glycoprotein

2.3 辣根過氧化物酶印跡材料的等溫吸附曲線

等溫吸附平衡曲線是指維持溫度不變,當達到吸附平衡時,吸附質在固-液兩相中濃度的關系曲線,即吸附劑表面的吸附量(qe)與溶液中吸附質平衡濃度(Ce)之間的關系曲線。常用的吸附等溫線模型有Langmuir等溫線模型[27]、Freundlich等溫線模型[28]。Langmuir等溫吸附模型是通過大量實驗數據歸納而來的經驗模型,是實際運用中使用最廣泛的吸附等溫線方程,其理論模型的提出基于以下假設:吸附劑表面是均勻的,即吸附位點是無差別的、完全相同的;所有吸附粒子具有相同的吸附熱和吸附能;吸附質分子之間,吸附質分子與表面活性位點之間不存在相互作用力;吸附為單分子層吸附。其表達式和線性形式分別為:

qe=Ktq0Ce/(1+KtCe)

式(2)

式中,Ce為吸附質平衡濃度,(mg·L-1);qe為吸附劑平衡吸附量,(mg·g-1);q0(mg·g-1)和 Kt(L·mg-1)分別是Langmuir等溫模型的最大吸附量和吸附常數。

Freundlich吸附等溫模型是多分子吸附,也是一種經驗模型。該理論模型的假設為:吸附劑表面不均勻,吸附劑和吸附質之間、吸附質分子之間存在多種相互作用關系。其表達式和線性形式如下所示:

式(3)

式中,q0(mg g-1)為Freundlich等溫模型的最大吸附量,KF(mg/g(L/mg)1/n)為Freundlich等溫模型的吸附常數,n為Freundlich等溫模型的線性指數。

表2的結果表明材料的等溫吸附模型更符合Langmuir等溫吸附模型,經擬合后得到印跡材料的最大吸附量為38.67 mg/g,非印跡材料的最大吸附量為7.15 mg/g。

表2 印跡材料和非印跡材料對于辣根過氧化物酶的等溫吸附模型擬合參數(Langmuir,Freundlich)Table 2 Parameters of Langmuir and Freundlich model of MIP and NIP

2.4 辣根過氧化物酶印跡材料的吸附動力學

為了評價合成的材料對模板辣根過氧化物酶的吸附速率,進行了吸附動力學實驗,測定不同吸附時間下(t)材料對辣根過氧化物酶的吸附量,圖4結果表明,印跡聚合物對模板具有較快的吸附速率,在25 min內就可以達到最大吸附量的50%,吸附50 min后基本達到平衡。其原因是合成的材料內部為水凝膠,提高了合成材料的親水性以及物質傳輸速度。

圖4 辣根過氧化物酶印跡和非印跡材料的吸附動力學曲線Fig.4 Adsorption kinetic curve of HRPon the HRP-IP and NIP

為了進一步評價辣根過氧化物酶印跡和非印跡材料的傳質速率和控制過程,采用準一級吸附動力學方程(pseudo-first-order)和準二級吸附動力學方程(pseudo-second-order)對辣根過氧化物酶印跡材料的動力學數據進行了分析,方程模型用式(4)和式(5)表示。準一級吸附動力學模型的限速步驟是擴散步驟。準二級吸附動力學模型的吸附速率由吸附劑表面未被占有的吸附空位孔穴數的平方值決定,吸附過程受化學吸附機理的控制,這種化學吸附涉及到吸附劑與吸附質之間的電子共用或電子轉移。

準一級吸附動力學方程:

Qt=Qe(1-e-K1t)

式(4)

式中,K1(min-1)為準一級吸附速率常數,Qe(mg/g)和Qt(mg/g)分別是平衡時的吸附量和t時間時的吸附量,t為吸附時間(min)。

準二級吸附動力學方程:

式(5)

式中,K2(g/(mg·min))為準二級吸附動力學常數,Qe(mg/g)、Qt(mg/g)、t與準一級吸附動力學一樣。由t/Qt與t的線性關系計算出速率常數K2、Qe和相關系數R2。

擬合結果參數如表3所示,準二級吸附動力學方程的R2值(0.9844)高于準一級吸附動力學方程的R2值(0.9346),準二級吸附動力學得到的理論值Qe(cal)(40.24 mg/g)與實際值Qe(exp)(38.31 mg/g)相近。因此,可以用準二級吸附動力學來描述辣根過氧化物酶印跡材的吸附過程,由于準二級吸附動力學的主要限速步驟是化學吸附,因此限制辣根過氧化物酶印跡材料吸附速率步驟的也是化學吸附。

表3 準一、二級吸附動力學方程擬合結果Table 3 Adsorption rate coefficient for two kinetic models

2.5 重復性試驗

圖5的結果表明合成的辣根過氧化物酶印跡材料具備良好的重復性,經過6次循環后,材料對于模板辣根過氧化物酶的吸附量僅降低了2.5%,說明合成的辣根過氧化物酶印跡材料穩定性能好,能夠重復使用。其原因可能是材料表面的聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)顆粒能夠有效的阻止外界環境對印跡材料的破壞。

圖5 辣根過氧化物酶印跡材料的重復性試驗Fig.5 Repeatability test of HRP-IP materials

3 結論

以聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)顆粒作為皮克林乳液穩定劑,在甲苯包水體系中通過皮克林乳液聚合的方式制備了一種核殼結構的辣根過氧化物酶印跡材料。其表面的聚(二乙烯基苯-co-對乙烯基苯硼酸)顆粒能夠有效的提高印跡材料對于糖蛋白的選擇性,合成的印跡材料對于糖蛋白(辣根過氧化物酶)的吸附量是對于非糖蛋白(BSA)的吸附量的42.77倍;其親水性的水凝膠內核能夠提高合成的印跡材料的傳輸速度以及水溶性,吸附50 min后基本達到吸附平衡,對于模板辣根過氧化物酶的最大吸附量為38.67 mg/g;且合成的印跡材料具有良好的穩定性,6次循環后對模板辣根過氧化物酶的吸附量僅降低了2.5%。