張黎明,彭巧玲,金雪芹,閆鵬超,何希宏,郝利民,,*,劉 陽,魯吉珂
(1.天津科技大學,工業發酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;2.軍事科學院軍需工程技術研究所,北京 100010;3.鄭州大學生命科學學院,河南鄭州 450001)
淀粉是一種廣泛存在于小麥、玉米、薯類等植物中的多糖類化合物,根據分子鏈上脫水葡萄糖單元的連接方式可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。在一定條件下,直鏈淀粉可以被一些疏水性分子誘導形成左手單螺旋結構,即V型結構[1-3]。這種螺旋結構外部由淀粉羥基組成,內部由葡萄糖骨架組成,其內徑大約0.54~0.85 nm,外徑1.36~1.62 nm[1]。客體分子進入螺旋結構內部,通過疏水作用結合形成包合物[2]。具有疏水性的風味物質分子與直鏈淀粉的這種包結絡合作用(Complexiation)相當于將風味物質微膠囊化[3]。
近年來,由于淀粉具有價格低廉、來源廣泛且實用性較強等優點,使淀粉對風味物質的微膠囊化成為研究熱點。不同的淀粉因其直鏈淀粉的含量和結構不同而表現出不同的包結絡合作用,常用來包合風味物質的淀粉有玉米淀粉[4]、馬鈴薯淀粉[5-6]、木薯淀粉[1]、大米淀粉[6]等。影響淀粉與風味物質包埋效果的因素主要有:直鏈淀粉含量(最主要因素)[4,6]、淀粉分子的聚合度[7]、淀粉來源[1]、糊化特性[6]、顆粒大小形態等[8]。例如Gelders等[7]采用不同鏈長的直鏈淀粉與脂質分子進行包埋處理,發現淀粉聚合度越高,與客體分子包埋效果越好;Jouquand等[8]研究了馬鈴薯淀粉和玉米淀粉對C6芳香化合物的包埋特性,結果發現馬鈴薯淀粉較玉米淀粉具有更好的包埋效率。
大蒜素(Allicin)是多年草本生蔥屬植物大蒜(AlliumsavitumL.)在細胞組織遭外界破損時,細胞中的蒜氨酸經酶解產生的[9],是大蒜的主要的風味物質,也是主要的活性物質,具有殺菌力強、抗菌譜廣,對大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌有顯著的抑制或殺滅作用,被譽為“天然廣譜植物抗菌素”。因此,有關大蒜素制劑的研究愈來愈引起人們的重視,成為研究的熱點[10]。但由于其熱穩定性差,通常在大蒜深加工過程中將其微膠囊化以掩蔽其氣味增加其穩定性[11-13]。如潘艷等[11]采用綠豆分離蛋白為壁材,利用噴霧干燥法制備大蒜素微膠囊,實際包埋率可高達93.4%。Piletti 等[12]以β-環糊精為壁材制備了大蒜油微膠囊,實驗表明該大蒜油微膠囊的熱穩定性得到了改善。辛露露等[13]以大蒜素為模型藥物,采用復凝聚法制備了海藻酸鈉/明膠/殼聚糖復合微球,載藥量最高為24.3%,包埋率最高為69.4%。這些制備方法的缺點是大蒜油和大蒜素的前期提取工藝較為復雜,成本高,且所得成分不穩定。天然淀粉來源廣泛,價格低廉,是作為大蒜素微膠囊化的理想壁材,因此,本文選用玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和高直鏈玉米淀粉分別作為包埋壁材,新鮮大蒜中所生成的大蒜素為客體分子,采用常溫高速剪切混合法制備了淀粉大蒜素包合物,考察這3種淀粉對大蒜中的大蒜素的原位包結絡合特性,以及所制備的包含物的理化性質和抗菌活性。
新鮮大蒜 水分含量63.51%±3.62%,河南省開封市杞縣;玉米淀粉 直鏈淀粉含量28.21%±0.56%,天津市中英保健食品有限公司;馬鈴薯淀粉 直鏈淀粉含量12.38%±0.78%, 天津市中英保健食品有限公司;高直鏈玉米淀粉 直鏈淀粉含量68.11%±1.52%,鄭州億之源化工產品有限公司;大蒜素標準品 CAS:10084,C6H10S6,純度≥98%,中國藥品生物制品鑒定所;甲醇 色譜純,德國默克公司;蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂粉 北京索萊寶生物科技公司;其余試劑 均為分析純;大腸桿菌(Escherichiacoli,G-)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,G+)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,G+)、沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium,G-) 天津科技大學微生物實驗室。
PB12Power311型高速剪切攪拌機 廣東美的電器股份有限公司;Alpha 2-4 LD plus型冷凍干燥機 德國Martin Christ有限公司;1260型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;PhiLips XL-30型掃描電子顯微鏡 荷蘭皇家飛利浦電子公司;Pyris/Diamond TG/DTA 500型熱重分析儀 美國珀金埃爾默儀器有限公司;TU-1810PC紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。
1.2.1 淀粉大蒜素包合物的制備條件篩選
1.2.1.1 高速剪切攪拌處理時間篩選 稱取原淀粉樣品100.0 g,置于高速剪切混合儀的容器中,再加入新鮮大蒜(篩選無霉變、無發芽的大蒜鱗莖,去除蒜梗、須根及外層鱗皮,得新鮮蒜瓣,按干基質量稱取100.0 g)和100 mL蒸餾水。然后在22500 r/min轉速下對混合樣品進行高速剪切混合處理至預定時間(20、30、40、50、60和70 min)。將所得混合漿液轉移到培養皿中,真空冷凍干燥12 h后得到干燥產物。將該產物研磨過100目篩,再用無水乙醇洗滌3次,以除去未被包合的大蒜素,再在35 ℃下真空干燥12 h后得到不同處理時間的淀粉-大蒜素包合物。
1.2.1.2 淀粉/大蒜(干基)質量比的篩選 稱取原淀粉樣品100.0 g,置于高速剪切混合儀的容器中,按照淀粉/大蒜(干基)質量比2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶6加入新鮮大蒜和適量的蒸餾水,使總體積達500 mL。然后在22500 r/min的轉速下對混合樣品進行高速剪切混合攪拌處理60 min。將所得混合漿液轉移到培養皿中,在35 ℃下真空干燥12 h后得到干燥產物。其余步驟同高速剪切攪拌處理時間篩選,得到不同淀粉/大蒜(干基)質量比制備的淀粉-大蒜素包合物。
1.2.2 樣品的制備 分別稱取原淀粉、新鮮大蒜各200.0 g以及淀粉/大蒜(干基)質量比1∶2,置于高速剪切混合儀的容器中,加入適量的蒸餾水,然后在22500 r/min的轉速下對樣品進行高速剪切混合攪拌處理60 min。將所得懸浮液轉移到培養皿中,在35 ℃下真空干燥12 h并研磨過100目篩后得到淀粉對照、大蒜粉(GP)和包合物。按淀粉/大蒜(干基)質量比稱取淀粉對照和大蒜粉(總質量為20.00 g),置于250 mL的三角瓶中,在振蕩器上振蕩15 min得到物理混合物。
1.2.3 HPLC法測定淀粉-大蒜素包合物中大蒜素的含量 淀粉-大蒜素包合物中大蒜素的含量測定參考李齊歡等[14]報道的HPLC法,并作適當修改。具體操作如下:精密稱取500.0 mg樣品,加入25 mL離心管中,加入10.0 mL甲醇,密封,渦旋混勻,于25 ℃下超聲處理1 h,然后在4 ℃,10000 r/min的條件下離心分離5 min。將上述上清液過0.22 μm濾膜,然后用HPLC分析儀測定。色譜條件:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18硅膠色譜柱(5 μm,4.6×250 mm);流動相:甲醇/水/甲酸=80/20/0.1;流速0.8 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量20 μL;波長254 nm;線性范圍:在濃度范圍6.92~173 μg/mL內,峰面積(A)與大蒜素質量濃度(C)的線性關系良好,其回歸方程為A=13.84C+64.24,決定系數R2=0.9998。大蒜素含量通過下式計算:
式中:Ac:大蒜素含量,μg/mg;C:質量濃度(μg/mL),V:供試樣品溶液體積(mL),M:供試樣品質量(mg)。
1.2.4 淀粉-大蒜素包合物的理化性質分析
1.2.4.1 碘結合特性實驗 碘結合特性實驗參照萬芊[15]描述的方法,并稍有改動。具體操作如下:精密稱取淀粉對照(10.00 mg)和大蒜粉(10.00 mg),淀粉-大蒜素包含物(使樣品中淀粉的質量分數為10.00 mg)。將所有樣品置于比色管中,加入1.00 mol/mL的NaOH溶液5.00 mL,然后在100 ℃水浴鍋中加熱,使淀粉顆粒充分溶脹,懸浮液在0.5 kHz超聲波頻率下超聲5 min后得到樣品溶液。待樣品溶液冷卻至室溫后,用稀鹽酸HCl溶液調pH到3.5,再加入0.50 mL碘試劑(2% KI+0.2% I2溶液)顯色1 min。再將顯色液轉至50 mL容量瓶中,用去離子水定容。用紫外-可見光分光光度計在450~900 nm的波長范圍內對所有顯色液進行吸光度掃描。
1.2.4.2 掃描電鏡分析 將原淀粉(CS、PS、HAMS)、淀粉對照和淀粉-大蒜素包合物樣品固定在SEM樣品板上,用毛細管將恒溫干燥后的樣品轉移置導電膠上,去除板面上多余樣品,噴金觀察。儀器加速電壓20 kV,放大2000倍。
1.2.4.3 X射線衍射分析 將原淀粉(CS、PS、HAMS)、淀粉對照、大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物樣品置于長方形鋁片的孔中,隨后壓緊,用X射線衍射儀按以下方法進行測定:所用波長為0.1542 nm的單色Cu-Kα射線。測試條件為:管壓3 kV,管流20 mA,掃描速度4 °/min,掃描區域3~60 °。
1.2.4.4 熱重分析 將原淀粉、大蒜粉、物理混合物及淀粉-大蒜素包合物等在35 ℃真空干燥箱中干燥24 h待用。精確稱取10~12 mg樣品置于鉑金坩堝中,按起始溫度20 ℃,終止溫度600 ℃,升溫速率10 ℃/min,氮氣流速40 mL/min進樣分析。
1.2.5 淀粉-大蒜素包合物的抑菌活性評價 淀粉-大蒜素包合物的抑菌活性測定參考譚才鄧等[16]報道的打孔瓊脂擴散法,并稍作改動。將淀粉-大蒜素包合物,大蒜粉、淀粉對照于120 ℃條件下干熱滅菌20 min,滅菌后冷卻備用。量取預先制備好的含菌量為1×106CFU菌懸液50 μL置于培養皿中,趁熱倒入50 ℃未凝固的瓊脂培養基并混合均勻,冷卻凝固后,用打孔器在固體培養基中央打一個直徑為1 cm的孔,加入0.10 g無菌樣品粉末和100 μL 0.9%的生理鹽水,使樣品粉末吸附在培養基上,將培養皿放置在37 ℃恒溫培養箱中培養1 h,之后倒置培養24 h,觀察抑菌情況,并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑,重復3次,取平均值。用抑菌圈直徑大小評價樣品的抑菌性能。
數據均為3次重復試驗平均值,以平均值±標準誤差表示。采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析,顯著性檢驗采用鄧肯氏(Duncan)多重比較,P<0.05為差異顯著。
2.1.1 高速剪切混合處理時間 高速剪切混合處理時間對包合物中大蒜素含量的影響結果如圖1所示。由圖1可以看出,包合物中大蒜素含量隨著處理時間的延長表現為先增加后緩慢降低的趨勢,包合物中大蒜素含量最高時,CS-A、PS-A和HAMS-A的處理時間分別為40、60、40 min。3種包合物中大蒜素含量高低次序為HAMS-A>PS-A>CS-A。大蒜在高速剪切作用力下隨著時間延長,細胞壁被打破,大蒜中的蒜氨酸在相關酶的作用下生成了大蒜素和其他含硫化合物[9]。在此過程中誘導直鏈淀粉形成單螺旋結構,進而通過主客體相互作用形成包含物[17]。在高速剪切混合過程中形成的HAMS-A的大蒜素含量較CS-A高,這是主要是由于HAMS的直鏈淀粉含量高的緣故。直鏈淀粉含量是影響淀粉與大蒜素包合作用的主要因素[4,6]。PS和大蒜在高速剪切處理50~70 min時,PS-A中大蒜素含量相對較高,這可能與馬鈴薯淀粉顆粒大,分子聚合度高、脂質含量少,結晶結構易被破壞等因素有關[2]。

圖1 高速剪切混合時間對淀粉-大蒜素包合物中大蒜素含量的影響Fig.1 Effect of high speed blending time on thecontent of allicin in starch-allicin complexes
2.1.2 淀粉/大蒜(干基)質量比 淀粉/大蒜(干基)質量比對包合物中大蒜素含量的影響結果見圖2。由圖2可知,3種淀粉包合物在不同淀粉/大蒜(干基)質量比的制備條件下所包埋的大蒜素含量不同,CS-A、PS-A和HAMS-A的最優質量比為1∶2、1∶6、1∶2,此時包合物CS-A、PS-A和HAMS-A中的大蒜素含量分別為(1.18±0.05)、(1.28±0.03)和(1.42±0.03) μg/mg。3種包合物中大蒜素含量均隨著大蒜(干基)占比增加呈先增加后穩定的趨勢,這一結果與Yeo等[3]研究結果一致,直鏈淀粉在和客體分子進行包合過程中,客體分子占比較低時,包合作用會隨著客體分子濃度的增加而增強,但增加到一定閾值后,過多的客體分子將不會被完全包合,包合物中大蒜素的含量不再改變。由于3種淀粉的差異,在相同的淀粉/大蒜(干基)質量比的情況下,HAMS-A中的大蒜素含量明顯高于另外兩種包合物,PS-A則略高于CS-A。

圖2 淀粉/大蒜(干基)質量比對淀粉-大蒜素包合物中大蒜素含量的影響Fig.2 Effects of the starch/garlic(dry basis)mass ratioson the content of allicin in starch-allicin complexes
2.2.1 淀粉-大蒜素包合物的碘結合特性 淀粉對照、大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物碘結合特性結果如圖3所示。CS、PS和HAMS與碘反應后所得溶液在450~700 nm處均有吸收峰,其最大吸收峰分別出現在605、584、604 nm處。根據吸光度值判斷其碘結合能力大小次序為:HAMS>CS>PS。大蒜粉的碘結合實驗結果沒有出現吸收峰,這表明大蒜粉中的物質不干擾包合物的碘結合測定結果。當淀粉與大蒜素形成包含物后,所得包合物與碘反應后的溶液的吸光值都較原淀粉的低,且最大吸收波長向低波長方向移動。根據3種淀粉-大蒜素包合物與碘結合后所制備的溶液的吸光值判斷其碘結合能力大小次序為:CS-A>PS-A>HAMS-A。造成這種結果的原因是,碘分子在淀粉溶液中能誘導直鏈淀粉形成單螺旋結構,并進入該單螺旋結構的空腔內,形成碘與直鏈淀粉的藍色絡合物[18];因大蒜中的大蒜素也能進入直鏈淀粉的單螺旋空腔產生競爭而抑制了碘與直鏈淀粉的包結絡合[19],因此形成包合物后與碘的結合能力下降,包含物中大蒜素的含量越多,與碘的結合力越弱。

圖3 淀粉對照,大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物的碘結合能力Fig.3 Iodine-binding capacities of starch control,garlic powder and starch-allicin complexes注:a0,CS;b0,PS;c0,HAMS;d,GP;a1,CS-A;b1,PS-A;c1,HAMS-A。
2.2.2 淀粉-大蒜素包合物的掃描電鏡分析 原淀粉、淀粉對照和淀粉-大蒜素包合物的掃描電鏡照片如圖4所示。由圖4可知,玉米原淀粉(CS)顆粒形狀為多角形,顆粒表面有許多大小不同的小孔(圖4a0)。馬鈴薯原淀粉(PS)顆粒大小分布較廣,呈圓形或卵圓形,表面光滑(圖4b0)。高直鏈玉米淀粉(HAMS)為多面體,部分顆粒呈近似球形或橢圓形顆粒,顆粒表面光滑(圖4c0)。原淀粉經高速剪切混合處理后,因顆粒發生溶脹而體積膨脹。對于PS而言,淀粉顆粒結構已經被破壞,并發生部分黏連(圖4b1),而其余兩種淀粉顆粒結構還保持完整。當淀粉與新鮮大蒜經過高速剪切混合處理后,在玉米淀粉顆粒的表面附著大蒜組織,部分淀粉顆粒破裂;相對于CS,PS或HAMS與大蒜組織的兼容性較好,混合程度高。實驗過程中發現對于CS或HAMS而言,經過高速剪切混合處理后淀粉顆粒形貌基本完好,但是當淀粉與新鮮大蒜共處理時,淀粉的顆粒形貌發生了明顯的變化,如HAMS的部分淀粉呈扁球形,而大蒜的組織碎片形態基本消失。由此也說明高速攪拌混合處理有利于HAMS和大蒜素形成包含物。

圖4 原淀粉,淀粉對照和淀粉-大蒜素包合物的掃描電鏡照片Fig.4 SEM pictures of native starch,starch control and starch-allicin complexes注:a0,CS;b0,PS;c0,HAMS;a1,CS對照;b1,PS對照;c1,HAMS對照;a2,CS-A;b2,PS-A,c2,HAMS-A。
2.2.3 淀粉-大蒜素包合物的X射線衍射分析 原淀粉、淀粉對照、大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物的X射線譜圖見圖5。由圖5可知,原淀粉CS、PS和HAMS分別呈現為A型、B型和A型的晶型結構[3-4]。大蒜粉(GP)未出現結晶衍射峰,為無定型結構。經高速剪切混合處理后,馬鈴薯原淀粉的衍射峰的強度明顯減弱,相對結晶度明顯降低;而CS和HAMS的衍射峰的強度變化不大。當淀粉與新鮮大蒜經過高速剪切混合處理后,包含物CS-A和HAMS-A在2θ角15°、17°、18°和23.5°處出現衍射峰,但其衍射強度明顯減弱,表明這些包含物呈現A型結晶;而包含物PS-A則轉化成無定形結構,這種結構有利于大蒜素與直鏈淀粉結合,并形成包含物。通常直鏈淀粉與疏水性分子形成包合物后呈現V構型結構,即在X射線衍射圖2θ角7°、13°和20°附近出現較強衍射峰[20]。直鏈淀粉與疏水性分子形成包合物也有非V構型結構的情況,本實驗所涉及的3種淀粉-大蒜素包含物均未出現V構型晶型衍射峰,可能與新鮮大蒜中大蒜素含量較少,組成成分相對復雜有關。

圖5 原淀粉、淀粉對照、大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物的X射線衍射圖Fig.5 X-ray diffraction patterns of raw starch,starch control,garlic powder,and starch-allicin complexes 注:A圖:a0,CS;a1,CS對照;a2,CS-A。B圖:b0,PS;b1,PS對照;b2,PS-A。C圖:c0,HAMS;c1,對照;c2,HAMS-A;d,GP。
2.2.4 淀粉-大蒜素包合物的熱重分析 原淀粉、大蒜粉、物理混合物和淀粉-大蒜素包合物的熱重分析曲線如圖6所示。由圖6可知,原淀粉(a0、b0、c0)的失重過程分為2個階段,第1階段主要由樣品中水分和表面結合水的損失產生(25~100) ℃,第2階段主要是淀粉分子鏈斷裂和碳化引起(280~350) ℃[20]。大蒜粉的失重過程分為3個階段(曲線d),第1階段是由大蒜粉樣品中表面水分損失和一些小分子碳氫化合物的分解造成的(50~100) ℃[21],第2失重階段屬于大蒜粉中大蒜素等活性物質的蒸發及熱分解引起的(190~260) ℃[22],最后一個失重階段主要由大蒜中纖維素等物質的碳化產生(280~350) ℃[23]。從DTG圖看,3種物理混合物的失重速率和失重溫度在前2個階段與大蒜粉一致,第3階段與其原淀粉一致,這說明物理混合只是簡單的疊加,無相互作用。CS-A的熱重曲線(曲線a2)幾乎與物理混合物重合,玉米淀粉與大蒜素的相互作用較弱;PS-A(曲線b2)熱分解的第2階段溫度范圍為225~270 ℃,失重速率在250 ℃左右達到峰值,高于大蒜粉和相應的物理混合物15 ℃;HAMS-A(曲線c2)在此階段,失重速率達到最高時的溫度比大蒜粉和其物理混合物高30 ℃。包合物與大蒜粉相比熱穩定性提高了,這說明通過高速剪切混合法制備淀粉和大蒜素復合物,可以提高大蒜中大蒜素的穩定性,3種淀粉對大蒜中大蒜素穩定作用強弱次序為HAMS>PS>CS。

圖6 原淀粉、大蒜粉、物理混合物和淀粉-大蒜素包合物的TGA曲線Fig.6 TGA curves of raw starch,garlic powder,physical mixture and starch allicin inclusion complex注:A圖:a0,CS;a1,CS和GP物理混合物;a2,CS-A。B圖:b0,PS;b1,PS和GP物理混合物;b2,PS-A。C圖:c0,HAMS;c1,HAMS和GP物理混合物;c2,HAMS-A。d,GP。
大蒜粉、淀粉對照和3種淀粉-大蒜素包合物對4種細菌的抑菌活性評價結果見表1。由表1中可知,淀粉對照對所有供試菌均無抑菌活性。而大蒜粉對于4種供試細菌顯示出較強的抑菌活性,其抑菌活性大小次序為:枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>沙門氏菌>大腸桿菌。文獻報道,大蒜中主要的抑菌活性物質是大蒜素[24],它可以對多種巰基依賴性酶系統產生抑制效應,致使細菌內一些與生命活動相關的酶失去活性而抑制細菌的生長和繁殖[25]。從表1可知,3種包合物CS-A、PS-A、HAMS-A對所有細菌都具有抑菌活性,其抑菌活性強度基本沒有因為加入淀粉后稀釋了大蒜中大蒜素而導致其抑菌活性降低。對于同一種受試菌,3種包合物抑菌效應大小次序為HAMS-A>PS-A>CS-A,這與包合物中大蒜素含量有明顯相關性。大蒜素穩定性較差,在儲藏或應用的過程中容易發生質量損失,根據前面的分析結果,淀粉與大蒜素所形成的包合物比大蒜粉具有更好的穩定性,因此抑菌活性較好。

表1 大蒜粉和淀粉-大蒜素包合物對供試菌的抑菌活性Table 1 Antibacterial activities of garlic powder(GP)and starch-allicin complexes against tested strains
采用高速剪切混合處理法探討了CS、PS和HAMS分別與大蒜中大蒜素形成包合物的特異性。結果發現,淀粉-大蒜素包含物中直鏈淀粉含量是影響淀粉對大蒜中大蒜素包合作用的主要因素,其次,淀粉的種類也影響了淀粉與大蒜中大蒜素的包結絡合。HAMS是3種淀粉中較為理想的包合大蒜素的材料。碘結合能力分析發現,3種淀粉與大蒜中的大蒜素均能形成包合物。通過掃描電鏡、X射線衍射和熱重分析發現,淀粉與大蒜通過高速剪切混合處理后,淀粉的顆粒發生溶脹和變形;淀粉的結晶度降低,但未形成V型結晶結構;形成包合物后提高了大蒜素的穩定性。通過抑菌活性評價說明,淀粉-大蒜素包合物對供試菌均具有良好的抑菌活性。高速剪切混合處理法是一種較好的包埋風味物質并使其微膠囊化的方法,這種方法操作簡單,經濟環保,未引入有毒有害試劑,是一種較好的包埋風味物質并使其微膠囊化的方法,對大蒜中大蒜素的高效利用具有指導意義。