鮮食白木納格蒸餾酒的發酵工藝優化

王浩臣,馬吉祥,陳新軍,李學文,楊曉君,宋晶晶,趙 昊,武 運,*

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆中信國安葡萄酒業有限公司,新疆昌吉 832200)

木納格葡萄(VitisviniferaL. cv.Munage),又名冬葡萄、戈壁葡萄。歐亞種,分為紅木納格和白木納格株系,粒大、皮薄、色澤鮮艷、口味甘美、果肉厚而脆,可切片,“木納格”,即維吾爾族語“晶瑩透亮”的意思[1],是最具新疆特色和地域性的鮮食、晚熟地方品種[2]。2004年,木納格葡萄產量為14.46萬噸[3],2014年達到28.55萬噸[4],十年期間總產量翻了近一倍,為新疆地區發展較為迅猛的葡萄品種之一。而我國鮮食葡萄產品以滿足國內市場需求為主,但由于鮮食葡萄自身不耐貯運的屬性,加之替代產品豐富,鮮食葡萄集中上市導致階段性供過于求[5],會有大量鮮食葡萄資源浪費,所以本研究選以鮮食白木納格葡萄作為原料,經發酵、蒸餾作為飲品,可以減少資源浪費。

酒中所含的甲醇和雜醇油能與有機酸結合成酯,使酒具有獨特的香味,但又會帶有一定的毒性[6]。甲醇對人體中樞神經有抑制的作用,尤其對視網膜神經系統具有一定的毒性,在人體內累積,會導致眼睛失明[7]。而高級醇尤其是異丁醇和異戊醇對人體中毒作用與麻醉作用比乙醇還強,其毒性會隨分子量的增加而增大,能引發頭痛頭痛惡心等癥狀,并且長期攝入導致慢性中毒[8-9]。劉跟生等[10]用游離脂肪酸相(FFAP)毛細管柱直接進樣測定自釀白酒中甲醇,操作簡單,樣品未進行處理直接進樣。童永鑫等[11]用氣相色譜法測定石榴葡萄酒中的甲醇和雜醇油,具有較高的精密度。出于安全性和產品風味的考慮,須控制蒸餾酒中甲醇和雜醇油中異丁醇和異戊醇的含量。

目前,針對工藝優化的方法主要有正交試驗和響應面優化試驗等。李潔等[12]通過單因素實驗和正交試驗確定木薯渣發酵生產生物飼料的最佳工藝。張少云等[13]通過單因素和響應面試驗確定紅棗蒸餾酒發酵的最佳工藝。王芳等[14]采用單因素和響應面法優化法確定茶葉梗發酵生產單寧酶的最佳工藝。最終優化出最佳工藝參數的試驗值和預測值基本相同,說明建立的模型符合實際生產。因此,使用響應面法能夠快速準確地找到影響發酵工藝的主要參數,確定主要參數的值,提高優化的準確性。隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強,需要適當減少蒸餾酒中甲醇和雜醇油中異丁醇和異戊醇的含量[15]。本研究以鮮食白木納格葡萄為原料,用鮮食白木納格發酵原液的甲醇含量和異丁醇異戊醇總含量及酒精度作為考察指標,通過單因素實驗和響應面試驗優化鮮食白木納格發酵工藝參數,為鮮食白木納格蒸餾酒的制作提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮食白木納格葡萄(初始糖度17.0 Brix,pH=3.54) 新疆九鼎農產品批發市場;安琪葡萄酒果酒專用酵母 安琪酵母股份有限公司;偏重亞硫酸鉀 北京奧博星生物技術有限責任公司;果膠酶(酶活8600 PGNU/g) 法國拉氟德公司;甲醇、異丁醇、異戊醇 天津市致遠化學試劑有限公司;所有試劑 均為國產色譜純。

FA2014N分析天平 北京東南儀誠實驗室設備有限公司;MJX-160-Z霉菌培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;LDZX-50KB型立式蒸汽滅菌器 上海申安醫療器廠;PAL-1型手持糖度計 北京陽光億事達科技有限公司;SXKW數顯控溫電熱套 北京市永光明醫療儀器廠;SB6 L三步精餾器 煙臺市吉訊釀酒設備加工廠;HP6890N氣相色譜儀 上海普迪生物技術有限公司;SDCP-5葡萄除梗破碎機 山東諸城酒莊釀酒設備制造廠;50 L氣囊壓榨機 山東諸城酒莊釀酒設備制造廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 鮮食白木納格凈汁的制備 鮮食白木納格葡萄經清洗、除梗、壓榨取汁,分別添加0.02 g/L果膠酶,0.05 g/L的偏重亞硫酸鉀,10～12 ℃澄清24 h[16],取鮮食白木納格凈汁進行后續試驗。

1.2.2 鮮食葡萄蒸餾酒的制備 使用SB6 L三步精餾器進行蒸餾,加入12 L在18 ℃接種量0.03%,發酵7 d的鮮食白木納格發酵液,蒸餾釜功率旋鈕調到最大,混液蒸餾釜溫度達到80 ℃或者剛以出酒,將電源關閉。出酒40%～50%vol時,關閉電源,廢液排掉后,將混液提餾鍋中的酒液放入蒸餾鍋、預熱器中的酒液放入混液提餾鍋中。再將預熱器打滿原料酒。后續操作重復操作直至最后一次出酒。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發酵溫度對鮮食白木納格發酵原液的影響 稱取1 L鮮食白木納格凈汁以接種量0.02%、發酵時間7 d,分別在14、18、22、26、30 ℃條件下進行發酵,發酵結束后測定發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度,考察發酵溫度對鮮食白木納格發酵的影響。

1.2.3.2 發酵時間對鮮食白木納格發酵原液的影響 稱取1 L鮮食白木納格凈汁以接種量0.02%、發酵溫度22 ℃,分別在4、5、6、7、8 d條件下,進行發酵,發酵結束后測定發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度,考察發酵時間對鮮食白木納格發酵的影響。

1.2.3.3 不同酵母接種量對鮮食白木納格發酵原液的影響 稱取1 L鮮食白木納格凈汁以發酵溫度22 ℃,發酵時間7 d,分別在接種量0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%條件下進行發酵,發酵結束后測定發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度,考察接種量大小對鮮食白木納格發酵的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素實驗基礎上,選取對甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度影響較大的發酵時間(A)、發酵溫度(B)、接種量(C)為考察因子,以發酵液的甲醇(Y1)、異丁醇和異戊醇總量(Y2)和酒精度(Y3)為響應值,利用響應面軟件Design Expert V8.0.6進行響應面優化試驗設計。

1.2.5 酒精度和甲醇、異丁醇、異戊醇含量的測定

1.2.5.1 酒精度的測定 參照GB 5009.225-2016 《酒中乙醇濃度的測定》方法[17]。

1.2.5.2 甲醇和異丁醇、異戊醇的測定方法 使用毛細管柱氣相色譜法通過HP6890N氣相色譜儀測定,準備溶液用稱量法分別準確稱取甲醇、異丁醇、異戊醇0.4722、0.4506、0.4470 g于預先儲盛有20 mL純水的100 mL容量瓶中,用純水洗瓶口,并加水稀釋至刻度,置冰箱保存。

1.2.5.3 標準曲線繪制 于3支預先盛有2 mL 60%乙醇的10 mL容量瓶中,分別加入0.250、0.500、1.000 mL標準儲液,用60%乙醇稀釋至刻度。此時甲醇濃度為0.0012、0.0024、0.0047 mg/ml,異丁醇濃度為0.0011、0.0023、0.0045 mg/mL,異戊醇濃度為0.0011、0.0022、0.0045 mg/mL[18]。

1.2.5.4 樣品測定 汽化室溫度為250 ℃[19];檢測器溫度為250 ℃;選用高純氮氣作載氣,載氣壓力為10 kPa,選擇分流進樣方式,分流旋鈕5圈;進樣體積為1 μL;程序升溫為:35 ℃保持5 min[18],再7 ℃/min升至90 ℃,保持5 min[20]。色譜圖的橫坐標為出峰時間、縱坐標為峰高,利用所制作的標準曲線來計算出樣品中甲醇、異丁醇和異戊醇的含量。

1.3 數據處理

通過Excel 2018軟件以及響應面軟件Design Expert V 8.0.6進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵溫度對鮮食白木納格發酵液中甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響 雜油醇產生的主要原因是發酵中間產物即丙酮酸生成的。丙酮酸經復雜的中間階段生成酮酸,再經脫羧主要還原成異丁醇和異戊醇等[21]。所以本研究將異丁醇及異戊醇的總和一起計算。由圖1可知,發酵溫度過高或過低都不利于酵母菌的生長代謝。當發酵溫度為14 ℃時,發酵液酒精度含量較低,甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量開始下降。當發酵溫度為18 ℃時,發酵液中酵母菌快速生長,此時鮮食白木納格發酵液的酒精度達到最高,為10.0%vol,甲醇含量為0.0015 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.012 mg/mL,當發酵溫度為22 ℃時,酒精度較開始持續下降,可能是由于發酵溫度較高,抑制了酵母菌的生長,同時加速了酵母菌的衰亡,此時酵母菌不再是發酵基質中的優勢菌群所導致,此時甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量均為最高,分別是0.006和0.013 mg/mL,并開始下降。綜合考慮,選擇發酵溫度18 ℃為宜。

圖1 發酵溫度對鮮食白木納格發酵原液甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on methanol content,total content of isobutylalcohol and isoamyl alcohol and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation solution

2.1.2 發酵時間對鮮食白木納格發酵液中甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響 由圖2可知,當發酵時間為4 d時,發酵液的酒精度含量較低,這可能是因為在4 d內酵母菌處于遲緩期,其代謝系統需要適應新的培養環境。當發酵時間在5～7 d時,發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度不斷上升,可能是因為在發酵5 d后,酵母菌生長進入穩定期,加快了糖轉化為酒精的速率,使得在7 d時酒精度達到最高為9.8%vol,此時甲醇含量,異丁醇和異戊醇總含量分別達到0.006和0.013 mg/mL,但當發酵時間超過7 d后,酵母菌的生長進入了衰亡期,酒精度有所下降,但異丁醇和異戊醇總含量仍然在上升,甲醇含量有所減少。綜合考慮,發酵時間選擇7 d為宜。

圖2 發酵時間對鮮食白木納格發酵原液甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation time on methanol content,totalcontent of isobutylalcohol and isoamyl alcohol and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation solution

2.1.3 接種量對鮮食白木納格發酵原液中甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響 由圖3可知,當接種量較少時,接入的酵母菌在鮮食白木納格發酵液中需要適應期,使得發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度都較低。當酵母菌接種量為0.02%時,鮮食白木納格發酵液的甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量達到最高值,分別為0.006和0.013 mg/mL,此時酒精度為9.8%vol。當接種量大于0.02%時,甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量開始持續下降,酒精度在0.04%時達到最大,為10.2%vol。在生產中接種量過高會增加成本;異丁醇和異戊醇同屬高級醇,雖是有害物質,但卻是構成蒸餾酒中香氣的主要物質,而此時異丁醇和異戊醇含量均符合標準。綜合考慮,發酵液的接種量選擇0.03%為宜。

圖3 接種量對鮮食白木納格發酵原液甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響Fig.3 Effects of inoculum size on methanol content,totalisobutylalcohol and isoamyl alcohol content and alcoholcontent in fresh-edible White Munage fermentation broth

2.2 鮮食葡萄蒸餾酒發酵條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計與結果 根據單因素實驗的結果,綜合考慮選取以發酵時間(A)、發酵溫度(B)、接種量(C)為自變量,以鮮食白木納格發酵液的甲醇(Y1)、異丁醇和異戊醇總含量(Y2)和酒精度(Y3)為響應值,進行3因素3水平試驗。

鮮食白木納格蒸餾酒發酵響應面試驗設計與結果如表2所示,回歸模型方差分析結果見表3、表4和表5所示。根據表1試驗結果,進行多元回歸方程擬合,建立以鮮食白木納格發酵液的甲醇為評價指標的擬合方程為:甲醇(Y1)=2.2E-3-8.75E-4A+6.25E-4B-5E-4C-2.5E-4AB+1E-3AC-5E-4BC+5.25E-4A2+1.525E-3B2+7.75E-4C2。

表1 響應面試驗因素水平表Tabie 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 鮮食白木納格發酵條件響應面試驗設計結果與分析Table 2 Experimental design and analysis of response surface in fermentation conditions of fresh-edible White Munage

以鮮食白木納格發酵液中異丁醇和異戊醇總量為評價指標的擬合方程為:異丁醇和異戊醇總含量(Y2)=5.2E-3+5E-4A+6.25E-4B-1.125E-3C+5E-4AB+2.5E-4BC+1.775E-3A2+1.525E-3B2+1.525E-3C2。

以鮮食白木納格發酵液的酒精度為評價指標的擬合方程為:酒精度(Y3)=10+0.21A+0.16B+0.12C+0.075AB+0.05AC+0.05BC-0.19A2-0.14B2-0.012C2。

表3 以鮮食白木納格發酵液甲醇含量為評價指標響應面試驗結果的方差分析Table 3 The response surface test results and variance analysis are based on the content offresh-edible White Munage fermentation liquid methanol as the evaluation index

表4 以鮮食白木納格發酵液異丁醇和異戊醇總含量為評價指標響應面試驗結果及方差分析Table 4 Response surface test results and analysis of variance based on the total contents ofisobutylalcohol and isoamyl alcohol in fresh-edible White Munage fermentation broth

各項方差分析結果表明,模型中的一次項A、B、C,交互項AC,平方項B2、C2對鮮食白木納格發酵液的甲醇含量影響為極顯著(P<0.01)。根據3個因素的F值可以推測,3個因素對鮮食白木納格發酵甲醇含量的影響主次順序為:A>B>C,即發酵時間對鮮食白木納格發酵液的甲醇含量影響最大,其次是發酵溫度,再其次是接種量對其影響最小。由交互項F值可以判斷,發酵時間和接種量(AC)的交互作用對鮮食白木納格發酵液甲醇含量的影響為極顯著(P<0.01),其中發酵溫度和接種量(BC)影響鮮食白木納格發酵液甲醇含量的交互作用大于發酵時間和發酵溫度(AB)的交互作用。

各項方差分析結果表明,模型中的一次項A、B、C,平方項A2、B2、C2對鮮食白木納格發酵液的異丁醇和異戊醇總含量影響為極顯著(P<0.01)。根據3個因素的F值可以推測,3個因素對鮮食白木納格發酵液的異丁醇和異戊醇總含量的影響主次順序為:C>B>A,即接種量對鮮食白木納格發酵液中的異丁醇和異戊醇總含量影響最大,其次是發酵溫度,再其次是發酵時間對其影響最小。由交互項F值可以判斷,發酵時間和發酵溫度(AB)的交互作用對鮮食白木納格發酵液中異丁醇和異戊醇總含量的影響為較顯著(P<0.05),其中發酵溫度和接種量(BC)影響鮮食白木納格發酵液中異丁醇和異戊醇總含量的交互作用大于發酵時間和接種量(AC)的交互作用。

表5 以鮮食白木納格發酵液酒精度為評價指標響應面試驗結果及方差分析Table 5 Response surface test results and analysis of variance based on alcohol precision offresh-edible White Munage fermentation broth as evaluation indexes

各項方差分析結果表明,模型中的一次項A、B、C,平方項A2、B2對鮮食白木納格發酵液的酒精度含量影響為極顯著(P<0.01)。根據3個因素的F值可以推測,3個因素對鮮食白木納格發酵液酒精度的影響主次順序為:A>B>C,即發酵時間對鮮食白木納格發酵液酒精度的含量影響最大,其次是發酵溫度,再其次是接種量對其影響最小。由交互項F值可以判斷,發酵時間和發酵溫度(AB)的交互作用影響比發酵溫度和接種量(BC)以及發酵時間和接種量(AC)的交互作用影響大,而發酵溫度和接種量(BC)與發酵時間和接種量(AC)的交互作用影響類似。

2.2.2 響應面分析 為了考察各個交互項對鮮食白木納格發酵液甲醇含量、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的影響,利用Design Expert V8.0.6軟件對建立的回歸方程計算,做出交互項的三維響應面圖,如圖4所示,圖片能夠清楚直觀地解釋各個變量之間的交互作用對響應值的影響。

圖4 各因素交互作用對鮮食白木納格發酵液甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量及酒精度的響應面Fig.4 Response surface of interaction of various factors to methanol content,total isobutylalcoholand isoamyl alcohol content and alcohol accuracy in fresh-edible White Munage fermentation broth

2.2.3 鮮食白木納格蒸餾酒最佳發酵條件的驗證試驗 通過Design Expert V8.0.6軟件對建立的回歸方程進行發酵工藝參數的優化得到的鮮食木納格發酵的最佳工藝為:發酵溫度18 ℃、發酵時間7 d、接種量0.03%,在此發酵條件下預測鮮食白木納格葡萄發酵液的甲醇含量為0.002 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.005 mg/mL,酒精度為10.1%vol。為驗證所建模型的準確性以及保證試驗的可操作性,將鮮食白木納格最佳發酵工藝條件調整為發酵溫度為18 ℃、發酵時間7 d、接種量0.03%。得到的鮮食白木納格發酵液的甲醇含量為0.002 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.005 mg/mL,酒精度為10.0%vol。該發酵液蒸餾得到蒸餾酒的甲醇含量為0.038 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.043 mg/mL,酒精度可達到44.0%vol。國家對果酒中的甲醇有明確的規定,《GB 15037-2006 葡萄酒》中限定葡萄酒中甲醇400 mg/L[22]。酒中雜油醇(以異丁醇與異戊醇計)限量0.20 g/100 mL[23]均符合標準。鮮食白木納格發酵液實測值與預測值較為接近,說明試驗建立的模型準確可靠,能較好地預測鮮食白木納格發酵液的甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量及酒精度含量,利用該模型在實際生產中進行預測是可行的。

3 結論

試驗以鮮食白木納格發酵液的甲醇含量與異丁醇和異戊醇總含量及酒精度為響應值,對鮮食白木納格的發酵條件進行優化,通過單因素實驗以及Design Expert V8.0.6響應面優化建立了多元回歸模型,得到鮮食白木納格發酵液最優發酵條件為發酵溫度18 ℃,發酵時間7 d,接種量0.03%,鮮食白木納格發酵液的甲醇含量為0.002 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.005 mg/mL,酒精度可達到10.0%vol,通過蒸餾后,該鮮食葡萄蒸餾酒的甲醇含量為0.038 mg/mL,異丁醇和異戊醇總含量為0.043 mg/mL,酒精度可達到44.0%vol。本研究采用響應面法,以鮮食白木納格發酵液的甲醇、異丁醇和異戊醇總含量及酒精度為響應值對鮮食白木納格葡萄的發酵工藝進行優化,通過本研究制備的蒸餾酒的甲醇、異丁醇、異戊醇含量均符合國家標準[24],能有效降低甲醇和異丁醇及異戊醇的總含量并提升酒精度,保證后續蒸餾制得的蒸餾酒的風味及安全性。