慢性乙型肝炎與肝硬化患者乙型肝炎病毒S蛋白變異分析

原永明， 章曉鷹， 顧 超， 張 玨， 孫學華

（1.上海大華醫院檢驗科，上海 200237；

2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科，上海 201203；3. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝炎科，上海 201203）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是肝硬化與肝癌的重要危險因子。慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的預后轉歸取決于病毒-宿主的相互作用[1]。HBV具有4個開放閱讀框（open reading frame，ORF），分別為S、C、P、X，其中S ORF包含前S1（pre-s1）、前S2（pre-s2）和S區域，編碼3個HBV表面糖蛋白，分別為小蛋白表面抗原（由S基因編碼）、中蛋白表面抗原（由S和pre-s2基因編碼）和大蛋白表面抗原（由S、pre-s2和pre-s1基因編碼）[2]。S蛋白即乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg），由226個氨基酸組成，由于S蛋白不僅僅有B細胞表位[3]，還含有輔助T細胞（helper T cell，Th）表位與細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）表位[4]，因此S蛋白在宿主相關的免疫功能刺激中扮演了重要角色[2]。S蛋白變異還能影響病毒顆粒和表面蛋白的分泌，可通過誘導表面抗原合成的不平衡使S蛋白在細胞質內質網中停留，從而引起內質網應急反應，這一機制可能與肝臟疾病的嚴重程度有關[5-7]。目前，關于我國CHB患者和肝硬化患者S蛋白變異特征及其與CHB嚴重程度相關性的報道較少。為此，本研究擬探討CHB患者和肝硬化患者S蛋白變異的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年3月于上海中醫藥大學附屬曙光醫院肝炎科就診的CHB患者114例，其中男70例、女44例，年齡5～76歲。參照《慢性乙型肝炎防治指南》[1]，將患者分成慢性HBV攜帶組（41例）、非活動性HBsAg攜帶組（38例）和肝硬化組（35例）。慢性HBV攜帶者定義為無特殊癥狀、HBsAg陽性、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）陽性、HBV DNA高載量（HBV DNA＞107IU/mL）、丙氨酸氨基轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）正常、天門冬氨酸氨基轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）正常[1]。非活動性HBsAg陽性者定義為HBsAg陽性、HBeAg陰性、乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）陽性、HBV DNA＜2×103IU/mL[1，8]。肝硬化診斷參照中華醫學會肝病學分會與感染病學分會發布的診斷標準[1]。所有患者均排除合并其他病毒，如丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等感染。

1.2 儀器和試劑

DNA提取試劑盒、DNA第1次純化試劑盒購自德國QIAGEN公司，DNA第2次純化試劑盒購自美國Applied Biosystems公司。ABI 3500 Dx Genetic Analyzer基因測序儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采用乙二胺四乙酸抗凝管采集所有對象靜脈血3 mL，離心分離血漿。

1.3.2 HBV DNA提取 取200 μL血漿，按試劑盒說明書要求提取HBV DNA。

1.3.3 引物設計 按Genbank數據庫中的HBV DNA（HBV genotype B DNA，complete genome，LC0362263；HBV genotype C DNA，complete genome，AB644286）S區序列，利用Primer Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。2種引物均涵蓋整個S蛋白。

表1 HBV NDA S區引物序列

1.3.4 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應條件及S區變異檢測 提取HBV DNA后進行第1輪PCR擴增和純化，純化后的PCR產物進行第2輪PCR擴增與純化，最后加入10 μL去離子甲酰胺，短時振蕩溶解DNA，95 ℃變性5 min，迅速置于冰上或4 ℃冷卻4 min，隨后采用ABI 3500 Dx Genetic Analyzer基因測序儀測序。第1輪PCR反應體系：總體積為50 μL，5×PCR buffer 10 μL（含Tris-HCl緩沖液、dNTP、Mg2+）、Taq酶3 μL、10 μmol/L上游引物與下游引物各1 μL（終濃度為200 nmol/L），DNA模板10 μL，補蒸餾水25 μL。第1輪擴增條件：尿嘧啶糖苷酸（防污染）50 ℃ 2 min；95 ℃預變性15 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環；72 ℃終延伸7 min。第2輪PCR反應體系：總體積為20 μL，DNA模板1 μL，BigDye 2 μL、BigDye Sequencing buffer 3 μL、F引物或R引物0.5 μL（終濃度為250 nmol/L），補蒸餾水13.5 μL。第2輪擴增條件：96 ℃預變性1 min；96 ℃變性10 s，50 ℃退火5 s，60 ℃延伸4 min，25個循環。

1.3.5 數據分析 采用Primer Primer 5.0軟件將核苷酸序列翻譯成氨基酸，采用BLAST分析軟件進行氨基酸序列比對。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，多組間采用非參數Kruskal-WallisH檢驗后，2個組間比較采用非參數Mann-WhitneyU檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組一般資料比較

慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組之間年齡和HBV DNA載量差異均有統計學意義（P＜0.01），性別及HBV基因型差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組一般資料比較

2.2 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異的比較

肝硬化組HBV S蛋白總體變異率明顯高于非活動性HBsAg攜帶組和慢性HBV攜帶組（P＜0.05、P＜0.01）。慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組S蛋白的MHR區域外變異率及CTL+Th免疫表位區變異率依次升高（P＜0.01）。3個組之間S蛋白的主要親水區（major hydrophilic region，MHR）及位于MHR區域內的“a”決定簇、LOOP1和LOOP2的變異率差異均無統計學意義（P＞0.05），MHR區域外的非免疫表位區變異率差異亦無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白及MHR、MHR外變異率比較 例（%）

2.3 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異位點比較

慢性HBV攜帶組中有1例患者同時出現MHR外Th免疫表位區、CTL免疫表位區和非免疫表位區3個位點變異，1例患者出現MHR與MHR外Th表位2個位點變異，其他患者均為單點變異，且MHR外CTL+Th免疫表位區與非免疫表位區變異率相當，呈隨機分布。非活動性HBsAg攜帶組有5例（13.15%）患者出現2個位點以上的變異，肝硬化組有9例（25.71%）患者出現2個位點以上的變異，且2個組的變異位點集中于MHR外CTL+Th免疫表位區。見表4。

表4 慢性HBV攜帶組、非活動性HBsAg攜帶組與肝硬化組HBV S蛋白變異位點比較

續表4

3 討論

此前，大部分研究者認為內源性宿主免疫壓力與外源性免疫預防或接種（疫苗或治療）均是HBV S蛋白變異的主要原因[6]。慢性HBV攜帶者均為母親HBsAg或HBeAg陽性的圍產期或嬰幼兒期疫苗逃逸的HBV感染患者，該類患者均處于免疫耐受期且未接受任何抗病毒藥物治療，臨床特征為HBsAg陽性、HBeAg陽性、ALT正常、HBV DNA高載量，肝臟炎癥非常輕微，患肝硬化的概率較小[1]。本研究結果顯示，免疫耐受狀態下的慢性HBV攜帶者HBV S蛋白的變異率相對較低，MHR內的變異主要集中于“a”決定簇中的LOOP1中，主要變異位點為126和127位點，未檢出G145R免疫逃逸位點，MHR外的變異位點呈隨機分布，CTL+Th免疫表位區與非免疫表位區變異率基本一致。經歷免疫清除，導致出現血清學轉換（由HBeAg陽性轉變為陰性）的非活動性HBsAg攜帶者的MHR區域內變異率與慢性HBV攜帶者比較，差異無統計學意義（P＞0.05）， 其變異主要出現在MHR外。本研究結果與文獻報道[9-10]明顯不同。SONG等[9]的研究結果顯示，在免疫耐受期轉化為免疫清除期過程中產生的抗體可對HBV MHR，尤其是“a”決定簇造成強烈的選擇性壓力，從而引起該位點變異，因此HBeAg陰性患者MHR變異率高于HBeAg陽性患者。也有學者認為，自然產生的變異主要集中于LOOP1區，免疫壓力導致的變異主要集中于LOOP2區[10]。而本研究結果顯示，免疫壓力導致的HBV S蛋白變異主要集中于MHR外。另外，肝硬化患者MHR外及MHR外CTL+Th免疫表位區變異率明顯升高，提示在經歷免疫清除導致出現血清學轉化的過程中，免疫壓力所致的變異位點集中于MHR外，其變異與HBeAg陰性的血清學狀態有關。由于HBeAg陰性患者變異位點多出現于“a”決定簇外或MHR外區域，因此推測體液免疫產生的抗體可能并不是HBV S蛋白發生變異的主要壓力，造成HBV S蛋白變異的免疫壓力可能更多來自于CTL與Th介導的細胞免疫壓力。有研究結果顯示，CTL、Th介導的細胞免疫在HBV清除過程中起關鍵作用，而體液免疫，即中和抗體產生相對較晚，起相對次要的作用[11]。另外，HBV變異與CHB病情加重或肝硬化具有一定的關聯性，病毒發生變異可能不僅僅是免疫壓力造成的后果。變異的HBV可能會通過免疫逃逸或內質網應急等機制使病情加重并發展成為肝硬化。

本研究尚存在一定的不足之處：首先，非活動性HBsAg攜帶者通常被認為預后良好，但其中有20%～30%會復發，這類患者的HBV載量通常接近或低于檢測限。由于HBV載量低于檢測限的患者無法進行DNA測序，因此本研究參考文獻[8]，選取HBV DNA＜2×103IU/mL的患者作為研究對象。其次，有研究提示有長期拉米夫定治療史的CHB患者的MHR變異率明顯高于未治療患者（χ2=5.803，P＜0.05）[12]。本研究中所有非活動性HBsAg攜帶者和肝硬化患者均有抗病毒藥物治療史，而慢性HBV攜帶者均未接受抗病毒藥物治療。本研究結果顯示，MHR變異率3個組之間差異無統計學意義（P＞0.05），不支持抗病毒治療對MHR變異產生影響這一結論，但抗病毒治療是否與MHR外變異有關尚無法確認。

總之，HBV S蛋白MHR外，尤其是MHR外CTL+Th免疫表位區變異不僅與HBeAg陰性血清學狀態相關，也與肝硬化相關。