臺州地區結核分枝桿菌分離及耐藥特征分析

池宏波， 楊英梅

[1.浙江省臺州市臺州恩澤醫療中心（集團）恩澤醫院檢驗科，浙江 臺州 318000；2.浙江省臺州市中心醫院 臺州學院附屬醫院檢驗科，浙江 臺州 318000]

結核病是傳染病的首要死因，是嚴重威脅人類健康的公共衛生問題[1]。我國是全球結核病和耐藥結核病的高負擔國家之一，耐藥結核病和耐多藥結核病（尤其是利福平和異煙肼雙重耐藥）發病率和病死率更高，是我國結核病防控和治療工作面臨的一大挑戰[2-3]。結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的菌種鑒定及耐藥性檢測對結核病的診斷、治療和預后起著至關重要的作用。目前，絕對濃度法、比例法檢測MTB耐藥性耗時長（通常需要4～8 周），不易標準化，而羅氏固體培養法周期長、操作繁瑣，均易延誤患者的治療。基因芯片法具有速度快、通量高、靈敏度高、易于標準化等優點，可用于快速篩查耐藥結核病。本研究采用DNA微陣列芯片法調查浙江臺州地區MTB和非結核分枝桿菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）的感染情況，及MTB對利福平和異煙肼的耐藥基因特征，以期為該地區結核病（尤其是耐藥結核病）的診斷和個體化治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年8月—2019年2月恩澤醫院3 334例患者的各類臨床樣本，患者男2 296例、女1 038例，年齡（55±19）歲。臨床樣本來源包括痰液、穿刺液（胸腹水、腦脊液、心包積液、關節液等）、肺泡灌洗液、膿液或分泌物、尿液、脫落細胞、咽拭子和組織塊等。剔除同一患者相同樣本類型的同一分離菌株。

1.2 主要儀器與試劑

E x t r a c t o r 3 6 T M核酸快速提取儀、E-CyclerTM 96 PCR儀、BioMixer II芯片雜交儀、SlideWasherTM芯片洗干儀、LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀、分枝桿菌核酸檢測試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）試劑盒、MTB耐藥基因檢測試劑盒和HybSet基因微陣列芯片雜交盒均購自北京博奧生物集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取 采集研究對象痰液、穿刺液（包括胸腹水、腦脊液、心包積液、關節液等）、肺泡灌洗液、膿液或分泌物、尿液、脫落細胞、咽拭子和組織塊等臨床樣本，采用Extractor36TM核酸快速提取儀，按照分枝桿菌核酸檢測標準操作規程進行DNA提取和純化。

1.3.2 分枝桿菌菌種鑒定 嚴格按照分枝桿菌菌種鑒定（DNA微陣列芯片法）試劑盒說明書和儀器的標準操作規程進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增、芯片雜交、洗滌甩干和掃描結果判讀。

1.3.3 MTB耐藥基因檢測 本研究檢測指標包括利福平及異煙肼的3個耐藥相關基因——rpoB基因啟動子的野生型及不同突變型，其中利福平耐藥相關基因rpoB基因檢測6個位點，共13種突變型：511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、 531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、533位CTG→CCG。異煙肼耐藥相關基因katG基因和inhA基因各檢測1個位點，分別為katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2個突變型，inhA基因-15位C→T突變型。嚴格按照MTB耐藥基因檢測（DNA微陣列芯片法）試劑盒說明書和儀器的標準操作規程進行PCR擴增、芯片雜交、洗滌甩干、掃描結果判讀。以芯片自帶的陰性、陽性對照作為質控，陽性對照點rpoBIC、katGIC 、inhAIC應為陽性，陰性對照點為陰性則判斷實驗有效，否則判定該次實驗無效。

1.3.4 質量控制 PCR擴增和芯片雜交設立陽性和陰性對照，所有操作均嚴格按照儀器和試劑盒的標準操作規程進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計數資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同類型樣本分枝桿菌分離情況

3 334 份送檢樣本中，檢出MTB 837株，總檢出陽性率為25.10%；檢出NTM 265株，總檢出陽性率為7.95%，居前3位的分別為胞內分枝桿菌（4.44%）、淺黃分枝桿菌（1.32%）、鳥分枝桿菌（0.75%）。MTB和NTM的樣本來源均以痰液為主，分別占28.33%和9.12%。見表1。

表1 不同類型臨床樣本分枝桿菌分離情況

2.2 不同性別、年齡患者MTB檢出情況

不同性別患者MTB檢出率不同，男性MTB檢出率為26.88%，高于女性（21.19%）（χ2=12.258，P＜0.05）。不同年齡患者MTB的檢出率也不相同（χ2=28.167，P＜0.05），尤其是＜30歲組，MTB檢出率（34.29%）顯著高于30～59歲組（25.56%，χ2=12.765，P＜0.05）與≥60歲組（22.10%，χ2=28.150，P＜0.05），而30～59歲組與≥60歲組MTB的檢出率相近，分別為25.56%和22.10%，差異無統計學意義（χ2=4.734，P＞0.05）。見表2。

表2 不同性別、年齡患者MTB的檢出情況

2.3 MTB耐藥基因特征分析

從837例MTB感染患者中隨機篩選384例進行耐藥基因檢測，其中對利福平的耐藥率為8.33%（32/384），對異煙肼的耐藥率為7.03%（27/384），利福平和異煙肼雙重耐藥率為14.84%（57/384）。89例利福平耐藥樣本中，rpoB基因耐藥位點分布為：511位點占8.99%（8/89），513位點占1.12%（1/89），516位點占8.99%（8/89），526位點占26.97%（24/89），531位點占53.93%（48/89）。84例異煙肼耐藥樣本中，katG基因315位點占91.67%（77/84），inhA基因-15位點占13.10%（11/84）。

3 討論

隨著我國結核病患者的增多，結核病已逐漸呈現出高感染率、高發病率、高耐藥率和高死亡率等特點[4]。掌握結核病的疫情和MTB的耐藥情況，對結核病的預防和控制具有重要意義。

本研究3 334份臨床樣本中，MTB的檢出率為25.10%，高于上海地區的平均水平[5]，NTM的感染率為7.95%，明顯高于青島地區（2.86%）[6]，提示臺州地區MTB和NTM感染相對較嚴重，應引起足夠的重視。本研究分離的837株MTB和265株NTM的樣本來源均以痰液為主，提示呼吸系統對MTB的易感性最強。此外，脫落細胞和咽拭子中均未檢出MTB和NTM，可能與樣本取材不規范或樣本數量過少有關。

本研究結果顯示，男性患者MTB的檢出率（26.88%）高于女性（21.19%），可能與男性吸煙人數相對較多有關；不同年齡組中，＜30歲組分枝桿菌檢出率最高（34.29%），其次為30～59歲組（25.56%）。＜30歲人群檢出率最高，可能與該年齡段人群生活壓力較大、作息不規律、生活習慣不良等導致其免疫力低下，從而造成的機會性感染有關。因此，應加強該年齡段人群結核病的監測，并及時采取干預措施，特別是該年齡段男性人群結核病的篩檢和預防。

利福平與異煙肼是最重要的一線抗結核藥物，檢測MTB對利福平與異煙肼的敏感性對治療具有重要的參考價值。本研究通過DNA微陣列芯片法進行MTB對利福平和異煙肼的耐藥性檢測，發現結核病患者的總耐藥率為30.20%，單耐藥率為 15.36%，雙重耐藥率為14.84%，均明顯高于賈慶軍等[7]報道的杭州市的水平，提示臺州地區MTB的臨床耐藥情況比較嚴重，應給予足夠的重視，嚴格按照耐藥類型和特點，科學制定應對方案，選擇有針對性的抗結核藥物，有效預防結核病的發生、發展。

有研究結果顯示，抗結核藥物作用的靶基因或靶基因調控區發生基因突變與MTB耐藥高度相關[8]。本研究結果顯示，臺州地區利福平耐藥基因rpoB主要優勢突變位點為531位點（53.93%）與526位點（26.97%），異煙肼耐藥基因突變位點主要是katG基因315位點（91.67%），與曾方林等[9]的報道一致。

本研究仍有一些不足之處，因只是隨機篩選384株MTB進行耐藥基因檢測，樣本量相對較少，結果可能會存在一定偏移。后續研究將進一步擴大樣本量，使結果更具有代表性。

綜上所述，臺州地區的結核病疫情，尤其是耐藥結核病疫情較嚴重。進一步加強患者的早發現、早治療，加強對結核病患者的耐藥監測，并采取有針對性的控制措施，對于結核病的預防和控制意義深遠而重大。