近紅外長余輝納米探針ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+的制備及Fe3+含量的時間分辨檢測

林 靜邵 康王 鍇張 聰滕淵潔潘再法佘遠斌

(浙江工業大學化學工程學院，浙江杭州 310000)

1 引 言

鐵是人體必需的微量元素之一[1]，作為人體中重要的生命要素[2]，在人體的新陳代謝過程中具有重要作用[3]。缺鐵會導致人體的免疫力降低，出現缺鐵性貧血。通常情況下，攝入鐵的主要方式有食補和補鐵保健品，其中服用補鐵口服液是最為常見的方法。補鐵口服液具有補氣補血的效果，可有效增強人體中的含氧量，改善氣血循環。但是過度攝入鐵則會導致組織損傷、器官衰竭甚至死亡[4]，因此測定補鐵口服液中鐵元素的含量具有非常重要的意義。

常見鐵的測定方法有分光光度法[5]、原子吸收光譜法[6]、比色法[7]、熒光光譜法[8]等。相比于其他檢測方法，熒光光譜法具有操作簡便、重復性好、靈敏度高等優點[9-11]，可實現Fe3+含量的簡便快速檢測。至今為止，已有研究人員采用多種熒光材料構建熒光探針用于檢測Fe3+的含量，但是大多檢測Fe3+含量的探針尚存在一些缺點，如背景干擾大、選擇性不強或隨pH值變化影響等[12-14]。2017年，Jiang等合成一種星形三苯并噻唑基苯(TBB)作為熒光探針檢測水中的Fe3+，TBB的熒光性能受到pH的影響較大，在強堿性環境下具有良好的耐受性，但在強酸的條件下會發生質子化，導致電荷轉移引起熒光變化，對Fe3+的測定會產生干擾[15]。2019年，Jayaweera等[16]采用榴蓮殼為原料制備熒光碳點，用于檢測水體中的Fe3+，采用365 nm作為最佳激發波長，可產生藍色熒光，但無法實現免實時激發檢測，未能有效避免激發光產生的背景干擾。Ye等[17]采用摻雜鑭系配位聚合物制備碳點構建比率型熒光傳感用于自來水中Fe3+的定量檢測。目前檢測Fe3+含量的熒光探針大多無法避免激發光和復雜樣品自體熒光的干擾，常應用于水樣或其他簡單樣品的實際測定，在復雜樣品的Fe3+檢測方面仍需進一步探究。因此，開發新型熒光探針用于復雜樣品中Fe3+的快速準確檢測具有重要意義[18]。

長余輝材料又稱為夜光材料，在經過外界光源激發之后，可將能量儲存在陷阱中，在停止激發后仍可持續發光，在安全顯示、光電儲存、儀表顯示以及生物成像等領域具有廣泛的應用[19]。由于長余輝材料在停止激發后，仍具有較強熒光，因此可做到免實時激發檢測，有利于消除激發光源及復雜樣品自體熒光的干擾。另外，由于長余輝材料具有獨特的余輝特性，不需要采用具有熒光時間分辨功能的昂貴儀器，就可實現磷光的時間分辨測定，可有效消除復雜樣品的自體熒光的干擾，實現無背景干擾下的高信噪比檢測[20-21]。2010年，嚴秀平等[22]首次利用 Ca1.86Mg0.14Zn-Si2O7∶Eu2+，Dy3+與金納米粒子結合，根據熒光共振能量轉移(FRET)機理構建綠光長余輝熒光探針，并成功應用于血清樣品中甲胎蛋白(AFP)的檢測，有效地避免了血清樣品的自體熒光和激發光的干擾，檢出限低至0.41 μg/L。2018年，Hu等[23]采用綠光長余輝材料Sr2Al14O25∶Eu2+，Dy3+構建熒光傳感用于抗生素和2，4，6-三硝基酚(TNP)的檢測，該生物傳感器有效地避免了背景干擾并成功地應用于牛奶、水樣中污染物的檢測。陳學元等[24]制備了近紅外長余輝材料ZnGa2O4∶Cr3+，將其進行生物素化后用于構建熒光傳感體系，有效地避免了蛋白質自體熒光的影響，可在白光激發下實現重復激發，實現了親和素蛋白的異構測定。

在長余輝材料中，采用Cr3+摻雜的鎵酸鹽長余輝材料具有良好的化學穩定性，可在強酸強堿等環境下保持良好的發光性能，并在近紅外區域具有較強的熒光發射。由于Cr3+摻雜的鎵酸鹽長余輝材料具有良好的余輝性能、化學穩定性和組織透過性等優點[25]，在生物成像和熒光傳感領域具有廣泛的應用前景，受到了廣大研究者的密切關注。因此本文采用水熱法合成Sn4+共摻的近紅外長余輝材料ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+(ZGSC)，并進一步進行包硅處理，以獲得良好的水中分散性。利用Fe3+對所合成的長余輝納米探針的猝滅效應，建立了操作簡便、選擇性強、干擾小的熒光傳感方法，實現補鐵口服液中Fe3+的含量高選擇性檢測。并且采用時間分辨光譜可有效地消除背景干擾，獲得高信噪比。市面上大多補鐵口服液的有效價態是二價鐵[26]，但目前報道的通常是測定補鐵口服液中的總鐵含量。本文可以分別測定補鐵口服液中的總鐵含量和Fe3+的含量，并根據總鐵含量和Fe3+的含量計算出二價鐵的含量，具有分別檢測Fe3+與Fe2+的優點。

2 實 驗

2.1 長余輝材料的合成

按照化學計量比稱取1 mmol Zn(CHCOO)2·2H2O、2 mmol Ga(NO3)3·xH2O、0.002 mmol Cr(CHCOO)3·2H2O及0.004 mmol SnCl4·5H2O溶于20 mL去離子水中，攪拌1 h。加入NaOH(2 mol/L)調節pH＝11，繼續攪拌2 h后，將反應物轉移至25 mL的水熱反應釜中，反應釜于200℃下反應18 h，待冷卻后離心，并用去離子水和無水乙醇洗滌3次，沉淀物置于烘箱中在60℃下干燥12 h，得到水熱后的長余輝納米材料。再將產物轉移至剛玉坩堝中，設置升溫速率為10℃/min，于1 000℃煅燒4 h，冷卻至室溫后，用研缽研磨，得到產物ZGSC。

稱取30 mg煅燒后的ZGSC，加入24 mL無水乙醇、0.1 mL硅酸四乙酯及1.44 mL氨水，攪拌反應4 h。再轉移至離心管中離心，采用去離子水與無水乙醇各洗滌3次，沉淀物置于烘箱中于60℃下干燥12 h，得到在表面包覆上硅殼的長余輝納米材料ZGSC＠SiO2。

2.2 測定條件優化及選擇性實驗

采用HCl溶液(0.1 mol/L)和 NaOH溶液(0.1 mol/L)配制 pH 為 5，6，7，8，9，10，11，12，13的溶液，備用。分別取200 μL不同pH的溶液與100 μL ZGSC＠SiO2混合均勻，測定混合溶液的熒光光譜，考察pH值對長余輝探針熒光強度的影響。

配制濃度為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5 mg/mL 的 ZGSC＠ SiO2水分散液，測定不同濃度ZGSC＠SiO2水分散液的熒光光譜，考察ZGSC＠SiO2水分散液濃度對長余輝探針熒光強度的影響。

配制濃度為10-2mol/L的 K+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Cu2+、Co2+、Cd2+、Cr3+、NH4+、Mn2+和 Ag+等金屬離子溶液備用。分別取200 μL的金屬離子溶液與100 μL ZGSC＠SiO2混合均勻，測定混合溶液的熒光光譜，考察不同金屬離子對長余輝探針熒光強度的影響。

2.3 Fe3+的定量測定及標準曲線制作

配制不同濃度的 Fe3+溶液，分別取100 μL ZGSC＠SiO2與200 μL Fe3+溶液混合，攪拌1 min后，選擇254 nm為激發波長，測定混合物的發射光譜。以最大發射波長695 nm處的熒光強度對Fe3+濃度作圖，得到Fe3+的標準曲線，用于實際樣品中的Fe3+濃度定量測定。

2.4 實際樣品檢測

選擇3種不同的市售補鐵口服液(10 mL/支)作為實際樣品，取適量體積的補鐵口服液樣品稀釋至50 mL使得待測樣品的濃度在Fe3+的線性范圍內，定容備用。分別取100 μL ZGSC＠SiO2、100 μL 雙氧水與100 μL 待測樣品于比色皿中，超聲1 min混合均勻。其中補鐵口服液中的Fe2+可被雙氧水氧化為Fe3+，故可測定樣品中的總鐵含量。測定混合物的發射光譜，計算總鐵含量。 取 100 μL ZGSC＠ SiO2、100 μL 去離子水與100 μL待測樣品混合均勻，超聲1 min，測量混合物的發射光譜，測定樣品中Fe3+的含量。計算總鐵含量和三價鐵含量的差值，可得樣品中Fe2+的含量。

2.5 儀器與測試

采用Fluoromax-4P熒光光譜儀(法國HORIBA Jobin Yvon公司)測定長余輝材料的發射光譜，ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+的激發波長為 254 nm，發射光譜的監測波長為695 nm。X'pert PRO X射線衍射儀(荷蘭PANlytical公司)用于測定樣品的X射線衍射譜。采用高分辨透射電子顯微鏡(荷蘭Tecnai G2 F30)分析樣品的形貌，加速電壓300 kV。

3 結果與討論

3.1 長余輝材料的結構表征

ZnGa2O4晶體具有立方尖晶石結構(空間組Fd3m)，Zn2+占據四面體格位(Td)，占據八面體格位(D3d)。由于摻雜的Cr3+離子與Ga3+具有相同的原子價和相似的離子半徑(0.061 5 nm vs.0.062 nm)，因此它們優先占據晶體Ga3+位置[27]。同時摻雜 Cr3+與 Sn4+可有效地提升ZnGa2O4的余輝性能。采用X射線衍射儀(XRD)以及高分辨透射電子顯微鏡(TEM)對長余輝材料的晶體結構和尺寸形貌進行表征分析。分別對1 000℃高溫煅燒后的ZGSC以及包硅之后的ZGSC＠SiO2兩種樣品進行了XRD表征，如圖1所示。兩種不同階段長余輝材料的XRD圖譜均與ZnGa2O4的標準卡片相符。從圖1中可看出，經過煅燒之后ZGSC的峰尖且窄，說明經過煅燒后樣品結晶性完好，包硅處理均未改變長余輝材料的晶體結構。圖2分別為水熱處理、高溫煅燒及包硅處理之后的ZGSC的TEM圖。

圖1 ZGSC和 ZGSC＠SiO2的XRD圖，ZnGa2O4的標準卡片為PDF#86-0413。Fig.1 XRD of ZGSC and ZGSC＠ SiO2.The standard card of ZnGa2O4is PDF#86-0413.

圖2 (a)～(b)ZGSC的透射電鏡圖；(c)1 000℃煅燒后ZGSC的透射電鏡圖；(d)包硅處理后ZGSC＠SiO2的透射電鏡圖。Fig.2 (a)-(b)TEM and HRTEM images of ZGSC.(c)TEM of ZGSC after 1 000℃calcination.(d)TEM of ZGSC＠SiO2.

圖2 (a)、(b)均為水熱處理之后長余輝材料的TEM圖。從圖2(a)中可觀察到水熱反應獲得的ZGSC粒徑較小，其平均粒徑均小于50 nm，且晶體粒徑較為均一。從圖2(b)中可觀察到水熱制得的ZGSC具有清晰的晶格條紋，其間距為0.158 nm，由此可說明水熱反應制得的ZGSC結晶性良好。圖2(c)為1 000℃煅燒后ZGSC的TEM圖，從圖中可觀察到，其晶體大小較為均勻，經過煅燒后晶體粒徑有所增大，但其平均粒徑均小于200 nm。圖2(d)為包硅處理后ZGSC＠SiO2的TEM圖，從圖中可觀察到在ZGSC表面包覆了一層明顯的硅層，經過包硅之后，ZGSC表面修飾上大量的硅羥基Si—OH，因此ZGSC的親水性得到有效地提高，從而提升了ZGSC在水相中的分散性。并且經過包硅處理，ZGSC＠SiO2可在水相中穩定分散1 h以上，由此說明包硅效果良好。

3.2 熒光性能表征

長余輝材料的激發發射光譜如圖3所示，從激發光譜圖中可觀察到，通過監測695 nm處的發射，在紫外-可見區存在以254，369，497 nm 為中心的3個寬激發帶。其中在254 nm處有一強的激發帶可歸因于帶間躍遷(CB→VB)及Cr3+的4A2(4F)→4T1(4P)躍遷，在369 nm和497 nm處的兩個峰分別是由于Cr3+的4A2(4F)→4T1(4F)和4A2(4F)→4T2(4F)的躍遷產生。從發射光譜圖中可看出，在254 nm激發下，可觀察到600～800 nm的近紅外區有一個寬的發射帶，其峰值位于695 nm，可歸因于2E→4A2躍遷。

圖3 ZGSC＠SiO2的激發和發射光譜Fig.3 Excitation and emission spectra of ZGSC＠ SiO2

除了激發光譜和發射光譜之外，還測定了ZGSC＠SiO2的衰減曲線和時間分辨光譜(TR)。如圖4所示，采用254 nm作為激發光源，對長余輝材料進行充能，5 min之后關閉激發光源，300～600 s為衰減過程。首先是快速衰減過程，激發停止之后產生快速衰減的原因是被較淺的陷阱所捕獲的電子快速釋放；隨后是慢速衰減過程，慢速衰減是由于較深陷阱中的電子被緩慢釋放所導致。從圖4中可看出，經過包硅處理后，ZGSC＠SiO2在激發后所存儲的能量增大，且衰減速度沒有變快。由此可看出，包硅處理可有效地提高ZGSC的余輝性能。

圖4 ZGSC和ZGSC＠SiO2的衰減曲線Fig.4 Decay curves of ZGSC and ZGSC＠ SiO2

為了消除背景熒光的干擾，本文還測定了ZGSC＠SiO2在 I＝I0/e時(取 300 μs)的時間分辨光譜(TR)，結果如圖5所示。從圖5中可以看出，在600～650 nm處，穩態光譜基線明顯比時間分辨光譜的基線高，這是由于激發光源存在下的背景干擾。以695 nm處的熒光信號強度除以600 nm處的背景噪音強度，通過計算可得到穩態下信噪比為5.9，時間分辨光譜中信噪比為42.7。可見利用時間分辨光譜，信噪比大幅提高，可有效地消除背景干擾，在時間分辨生物傳感等領域具有廣泛的應用前景。

圖5 ZGSC＠SiO2在穩態和時間分辨的發射光譜Fig.5 Steady state and time resolved emission spectra of ZGSC＠SiO2

3.3 測定條件優化及選擇性實驗

圖6 (a)ZGSC＠SiO2在不同pH值環境中的熒光強度；(b)不同濃度ZGSC＠SiO2水分散液的熒光強度。Fig.6 (a)Fluorescence intensity diagram of ZGSC＠ SiO2in different pH.(b)Fluorescence intensity of ZGSC＠SiO2water dispersion with different concentrations.

使用長余輝材料ZGSC＠SiO2作為熒光探針，其熒光強度會受到環境中pH值以及ZGSC＠SiO2在水分散液中濃度的影響，故需對以上兩種因素進行考察優化。為探究環境中不同pH值是否會對ZGSC＠SiO2熒光強度產生影響，本文分別測定了pH＝5～13的環境下ZGSC＠SiO2的熒光強度，結果如圖6(a)所示。在不同的pH環境中，ZGSC＠SiO2的熒光強度基本保持不變，不同pH值并不會對ZGSC＠SiO2的熒光性能產生較大影響，說明ZGSC＠SiO2具有良好的pH穩定性，因此ZGSC＠SiO2可用于廣泛pH范圍內的檢測。

為探究分散在水溶液中長余輝材料的濃度對熒光強度的影響，我們測定了不同濃度ZGSC＠SiO2的熒光發射光譜，取695 nm處的熒光強度進行對比，結果如圖6(b)所示。隨著ZGSC＠SiO2濃度的不斷增大，其熒光強度呈現先增大后穩定的趨勢。當濃度為0.6 mg/mL時，ZGSC＠SiO2的熒光強度達到最大值；當濃度大于0.6 mg/mL時，ZGSC＠SiO2的熒光強度逐漸趨于穩定。因此，選擇0.6 mg/mL作為ZGSC＠SiO2測定的最佳濃度。

除此之外，為探究近紅外長余輝材料ZGSC＠SiO2檢測Fe3+的可行性，我們考察了本傳感系統的選擇性。分別配制了濃度為10-2mol/L的不同金屬離子溶液，加入一定量的ZGSC＠SiO2水分散液中混合，測定其熒光強度，從而探究常見陽離子 K+、Na+、Mg2+、Al3+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cr3+、Co2+、NH4+、Mn2+、Ag+、Cd2+對 ZGSC＠SiO2熒光性能的影響，實驗結果如圖7所示。從圖7中可看出，加入其他常見陽離子后，ZGSC＠SiO2熒光強度沒有變化或變化不大，僅有Fe3+可使ZGSC＠SiO2熒光強度產生大幅猝滅的現象。加入濃度為10-2mol/L的Fe3+之后，長余輝材料ZGSC＠SiO2的熒光被大幅猝滅，其猝滅效率達到了96.72%。

圖7 加入不同陽離子后ZGSC＠SiO2的熒光強度圖Fig.7 Fluorescence intensity of ZGSC＠ SiO2in the presence of various ions

由此表明，長余輝材料ZGSC＠SiO2對Fe3+具有良好的選擇性，可用于實際樣品中Fe3+含量的選擇性檢測。Fe3+可使ZGSC＠SiO2產生熒光猝滅的原因可能是由于長余輝材料與Fe3+之間產生了光電子轉移。即由于ZGSC＠SiO2的表面含有大量的羥基，加入Fe3+后，ZGSC＠SiO2表面的羥基與Fe3+發生配位反應，可能導致激子的非輻射復合概率增加，從而產生猝滅效應[28-31]。

3.4 Fe3+的定量測定及標準曲線制作

基于Fe3+可使ZGSC＠SiO2產生熒光猝滅的現象，本研究建立了一種快速檢測Fe3+的傳感方法。為了探究Fe3+溶液的濃度與ZGSC＠SiO2熒光強度之間的關系，向ZGSC＠SiO2中加入濃度為0～10-2mol/L的Fe3+溶液后，測定了ZGSC＠SiO2在254 nm激發時的發射光譜，如圖8(a)所示。從圖中可以看出，隨著 Fe3+的濃度在0～10-2mol/L之間不斷地增大，ZGSC＠SiO2的熒光強度逐漸減弱，猝滅程度逐漸增大。選取695 nm處的熒光強度與Fe3+的濃度繪制標準曲線，結果如圖8(b)所示。在50～800 μmol/L之間，熒光強度與Fe3+之間具有良好的線性關系，線性方程為y＝ -6.4×104×lgC-1.9×105(R2＝0.998 5)，其中y為ZGSC＠SiO2的熒光強度，lgC為Fe3+濃度的對數。重復測定3次以上，200 μmol/L Fe3+的相對標準偏差(RSD)為2.18%，檢出限為25.12 μmol/L。因此，本文構建的熒光傳感體系可用于Fe3+的檢測。

圖8 (a)與不同濃度Fe3+溶液混合后ZGSC＠SiO2的發射光譜；(b)檢測Fe3+的標準曲線。Fig.8 (a)Fluorescence emission spectra of ZGSC＠ SiO2in the presence of Fe3+with different concentration.(b)Relationship between the fluorescence intensity of ZGSC＠SiO2and concentration of Fe3+.

3.5 實際樣品的測定

為驗證采用長余輝材料ZGSC＠SiO2用于檢測Fe3+含量的可行性，本文選用了市面上3種常見市售補鐵口服液作為實際樣品，樣品為1種乳酸亞鐵口服液和2種鈣鐵鋅口服液。分別測定了與不同實際樣品混合之后，ZGSC＠SiO2的穩態發射光譜以及關閉激發光源后I＝I0/e(取300 μs)時的時間分辨光譜，結果如圖9(a)、(b)所示。從圖9(a)、(b)中可看出，隨著樣品中Fe3+的濃度增加，ZGSC＠SiO2的熒光猝滅程度均逐漸增大。分別對兩種光譜的信噪比進行計算，穩態下的信噪比為5.3，時間分辨光譜中的信噪比為33.4，說明采用時間分辨技術檢測鐵含量的信噪比明顯提高。通過圖9(a)與(b)的對比可看出，時間分辨光譜有效地消除了背景干擾，實現了免實時激發檢測。

圖9 (a)加入不同樣品時的ZGSC＠SiO2的穩態發射光譜；(b)與不同樣品混合后的ZGSC＠SiO2的時間分辨光譜。Fig.9 (a)Emission spectra of ZGSC＠ SiO2in different samples.(b)Time-resolved spectra of ZGSC＠SiO2 in different samples.

為了驗證所構建的傳感體系的實用性，本研究利用ZGSC＠SiO2/Fe3+傳感體系檢測了3種實際樣品中的總鐵含量和Fe3+含量，并進行了加標實驗。實驗結果如表1、表2所示。表1為實際樣品中的總鐵含量和Fe3+含量的測定結果。從表1中可看出，本方法測得的實際樣品中總鐵含量與標注的總鐵含量較為相符，且實驗結果表明實際樣品中Fe3+的含量較高，均大于總鐵含量的60%。實際樣品中總鐵含量的RSD為2.416%～3.808%，Fe3+含量的RSD為3.263%～4.296%。實驗結果證明，采用本研究構建的熒光探針檢測實際樣品中Fe3+含量具有良好的重現性。

對實際樣品中的總鐵含量以及Fe3+含量分別進行了加標實驗，實驗結果如表2所示。從表2中可看出，3種實際樣品中總鐵含量的平均加標回收率為99.00%～99.79%，Fe3+含量的平均加標回收率為99.90%～102.69%，測定結果符合測定要求，說明采用ZGSC＠SiO2/Fe3+傳感體系檢測Fe3+的含量是可行的。除此之外，還可根據所測得的總鐵含量以及Fe3+的含量計算出實際樣品中的有效組分Fe2+含量，且實際樣品中Fe2+的含量較少，因此可說明在補鐵口服液的生產、運輸及儲存過程中，Fe2+被大量氧化成Fe3+。可見本方法也可用于補鐵口服液中有效價態Fe2+的質量控制檢測。

通常大多數采用熒光分析法檢測Fe3+都需要實時激發，而常見的補鐵口服液的成分較為復雜，測定時存在強本底干擾，無法避免激發光和自體熒光的干擾[8]。與常見的補鐵試劑中Fe3+含量的檢測方法相比，本方法的優勢是可同時檢測Fe3+和Fe2+含量，操作簡單，簡化了前處理過程。并且由于長余輝材料具有獨特的余輝性能，可采用時間分辨技術實現免實時激發檢測，避免激發光造成的干擾，對于成分復雜的補鐵藥品采用時間分辨技術可有效避免其本底干擾，有利于補鐵藥品中鐵含量的檢測。

表1 樣品中總鐵含量和Fe3+含量的測定結果Tab.1 Determination results of total iron content and Fe3+in the samples

表2 樣品中總鐵含量和Fe3+含量加標回收的測定結果Tab.2 Recovery test results of total iron content and Fe3+in the sample

4 結 論

本研究采用水熱法合成了納米級的近紅外長余輝材料 ZnGa2O4∶Cr3+，Sn4+，并對其進行了表面包硅處理得到ZGSC＠SiO2，有效提高了長余輝材料在水中的分散性。對長余輝材料的晶體結構和余輝性能進行表征分析，考察了其余輝特性。基于Fe3+可使長余輝材料ZGSC＠SiO2發生熒光猝滅現象，本文構建了新型熒光傳感體系用于Fe3+含量的檢測，并實現了對3種補鐵口服液樣品中總鐵含量的檢測以及Fe3+含量的檢測。與其他檢測方法相比，本方法可通過測定實際樣品中的總鐵含量以及Fe3+含量，實現Fe3+與Fe2+的同時檢測，可應用于補鐵口服液中有效價態Fe2+的質量控制。本方法具有信噪比高、無背景干擾、操作簡便等優點。并且采用時間分辨技術測定實際樣品中的鐵含量，有效地避免了激發光的背景干擾以及復雜樣品中的本底干擾，在保健品及復雜的生物樣品中鐵含量的檢測方面都具有廣泛的應用前景。