云南小?？Х裙ぶ泄z的提取及其水解物抑菌活性研究

李曉嬌,付文相,楊麗華,侯洪波,宋志姣

(保山學院資源環境學院,云南保山 678000)

咖啡屬茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)多年生常綠灌木或小喬木,原產于非洲埃塞俄比亞,其中以小粒種(Coffeaarabica)、中粒種(C.canephora)和大粒種(C.liberica)咖啡栽培較多[1]。我國的咖啡主產區在云南,其中小?？Х鹊漠a量占全國98.80%,因其獨特的氣候條件,所產的小?？Х绕焚|優異,云南省中以普洱市、保山市、臨滄市和德宏州為主要種植區[2]?？Х燃庸み^程中會產生大量的咖啡果皮[3],Emaille等[4]和Saenger等[5]的研究報道表明,干法加工每生產1 t咖啡豆,大約會產生1 t的咖啡果皮,而在濕法加工產生咖啡果皮的量可達到2 t以上。大量的咖啡果皮通常會被丟棄,或用作堆肥,不僅資源浪費,而且在一定程度上污染環境[6]。

果膠是由α-1,4糖苷鍵連接半乳糖醛酸與鼠李糖、阿拉伯糖等中性糖聚合而成的雜多糖,主要是由原果膠、果膠酯酸和果膠酸組成[7],具有良好的生理和藥理活性,如抑癌、降糖、降脂和調節機體免疫等作用[8-9]。果膠經果膠酶降解成的低聚物具有明顯的抑菌活性,可作為一種新型的天然抑菌劑[10-11],柚皮果膠的水解和抑菌研究結果表明,其對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌和殺菌效果[12]。常見的果膠提取方法主要有酸法、超聲波、微波輔助法、堿法、酶法、鹽提法和離子交換法等[13]。其中酸法是工業中使用最廣泛的果膠提取方法,其優點是成本較低,得率穩定,反應條件容易控制。目前,國內外對小?？Х裙Y源利用的研究主要集中在提取咖啡因、土壤調節劑、作為燃料、飼料、重金屬的生物吸附劑和硬質纖維板的原料等方面[14-17],而從小?？Х裙ぶ刑崛」z還未見報道。市場上的商品果膠主要提取自檸檬、蘋果、柑桔,對小?？Х裙すz的提取研究還比較少,也無小?？Х裙すz水解物的抑菌活性研究的相關報道。

考慮到提取成本,以及后期果膠的中試生產的研究,本文采用酸法對小粒咖啡果皮果膠進行提取。以云南保山小?？Х裙樵?以果膠得率為指標,在單因素實驗基礎上通過正交試驗優化小?？Х裙すz的提取工藝,并測定其半乳糖醛酸含量、干燥失重、總灰分、pH、酯化度等理化性質及對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用,以期為小粒咖啡果皮果膠的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小?？Х裙?云南保山老基地咖啡有限公司提供;無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸 均為分析純,重慶川東化工有限公司;半乳糖醛酸、咔唑、檸檬酸 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;磷酸氫二鈉 分析純,成都化學試劑廠;果膠酶(酶活力≥500000 U/g)成都科隆化學品有限公司;牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限公司;氯化鈉 分析純,南匯彭鎮營房化工廠;瓊脂條 福建省石獅市環球瓊膠工業有限公司;商品果膠 進口分裝,Sigma;供試菌種:大腸桿菌Escherichiacoli(標準菌株ATCC25922)、金黃色葡萄球菌Staphyloccocusaureus(標準菌株ATCC259226538)、枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(標準菌株ATCC6633) 均購自廣東省微生物菌種保藏中心。

UV5100紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;FE20 pH酸度計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;NDJ-85旋轉粘度計 上海昌吉質地儀器有限公司;HZQ-X100A恒溫培養振蕩器、DZF-602真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;LDZX--75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 小粒咖啡果皮預處理 小粒咖啡果皮(濕法加工),60 ℃下烘干至恒重后粉碎,過20目篩,于干燥器中保存備用。

1.2.2 小粒咖啡果皮中果膠的提取與鑒別

1.2.2.1 小粒咖啡果皮中果膠的提取 稱取10.00 g粉碎后的小?？Х裙び?50 mL錐形瓶中,加適量蒸餾水,在90～100 ℃下煮沸5 min。趁熱過濾,濾渣用80%的乙醇洗滌3次,每次洗滌5 min(除去色素、糖酸等),洗滌完后于80 ℃烘箱中烘干。然后置于250 mL錐形瓶中,按一定料液比加入一定濃度的稀鹽酸溶液,在50 ℃下提取60 min,提取結束后冷卻、抽濾,濾液濃縮至50 mL,快速用冰水冷卻后加入1.5倍體積的無水乙醇進行醇析,減壓過濾,濾出物用一倍量的75%酒精洗滌,除去醇溶性雜質。4000 r/min離心5 min分離,濾渣于40 ℃下真空干燥至恒重,得果膠固體,稱重計算得率。

1.2.2.2 果膠的鑒別實驗 根據國標GB 25533-2010方法對所提取的小?？Х裙すz做驗證試驗。準確稱取1 g小?？Х裙すz,加入40 mL蒸餾水,不斷攪拌,看是否形成凝膠或稠狀液體。用移液管移取5 mL該粘稠狀溶液于25 mL試管中,加入1 mL氫氧化鈉(1.25 mol/L)溶液,靜置20 min,看是否出現半透明或不透明的凝膠沉淀。同時測定小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜,并與商品標準果膠的紅外光譜進行對比分析,鑒別提取物。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 料液比對果膠得率的影響 在提取溫度50 ℃、提取時間為60 min、提取液pH為1.5的條件下,考察不同料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)對果膠得率的影響。

1.2.3.2 提取液pH對果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取溫度為50 ℃、提時間為60 min的條件下,考察提取液不同pH(1.0、1.5、2.0、2.5、3)對果膠得率的影響。

1.2.3.3 提取溫度對果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取時間為60 min、提取液pH為1.5的條件下,考察不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對果膠得率的影響。

1.2.3.4 提取時間對果膠得率的影響 在料液比1∶25 g/mL、提取溫度為50 ℃、提取液pH為1.5的條件下,考察不同提取時間(40、60、80、100、120 min)對果膠得率的影響。

1.2.4 正交試驗 根據單因素實驗結果,以半乳糖醛酸含量為指標,選取料液比(A)、提取液pH(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)四個單因素進行L9(34)正交試驗,試驗因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 果膠得率計算 采用重量法[18]測定小?？Х裙すz得率。

果膠得率(%)=m/m0×100

式中:m為提取的小粒咖啡果皮果膠質量,g;m0為小粒咖啡果皮質量,g。

1.2.6 小?？Х裙すz理化性質的測定 小?？Х裙すz的理化性質測定參照GB 5009.3-2016(干燥失重)、GB 25533-2010(酯化度、感官指標)、GB 5009.4-2016(灰分測定)、半乳糖醛酸含量采用采用咔唑硫酸法[19],pH、酸不溶灰分等理化指標檢測均按果膠國家標準GB 2484-2000來進行。

1.2.7 小?？Х裙すz熱穩定性的測定 按1.2.2的方法,提取條件為:料液比為1∶30 g/mL,pH1.5,提取溫度70 ℃,提取時間100 min,提取小?？Х裙すz,并配制100 mL 1%的果膠溶液,置于95 ℃的烘箱內,分別干燥0、2、4、6、8、10 min后取出樣品,冷卻至室溫后,測定其相對粘度[20-21]。

1.2.8 培養基制作及菌種活化培養

1.2.8.1 固體培養基 稱取牛肉膏6.0 g、蛋白胨20.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂30.0～40.0 g配置2000 mL pH7.4～7.6的培養基。121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min。滅菌后于超凈工作臺中向培養皿中倒入約25 mL培養基,冷卻后倒置培養皿,備用。

1.2.8.2 液體培養基 稱取牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、氯化鈉1.5 g以蒸餾水配置300 mL pH7.4～7.6的液體培養基。分三份加入三個錐形瓶中,121 ℃、0.1 MPa高壓蒸汽滅菌30 min,備用。

1.2.8.3 菌種活化培養 菌種活化:無菌環境,接種環劃線將供試菌種接種于固體培養基內,37 ℃培養72 h。菌種培養:配制液體培養基,高壓滅菌處理冷卻后接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌,放置于培養箱中37 ℃培養20 h,使菌種濃度達到106～107CFU/mL,即紫外分光光度計最大吸收波長600 nm處測定吸光度在1.4～1.5左右。若吸光度低于1.4,則繼續培養至適宜濃度。若吸光度大于1.5,則需加適量無菌生理鹽水稀釋[22]。

1.2.9 小?？Х裙すz水解物抑菌活性測定

1.2.9.1 不同水解時間果膠水解物的制備 配制0.2 mol/L磷酸氫二鈉500 mL,0.1 mol/L檸檬酸溶液500 mL,并制備磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.4)。稱取8.0 g果膠,緩沖液溶解并定容至500 mL,得果膠液。加入0.8 g果膠酶于500 mL果膠液中,混勻后將該混合液置于50 ℃水浴中進行水解,分別于反應0、30、60、90、120、150、180、210、240 min時取樣50 ml,迅速將其于沸水中加熱10 min滅酶,冷卻后3500 r/min離心5 min,將上清液濃縮至原體積的1/2,冷藏備用[23]。

1.2.9.2 不同水解時間果膠水解物抑菌效果采用濾紙片法[24],測定抑菌圈大小,表征抑菌效果。于無菌操作臺內,移取150 μL濃度為106～107CFU/mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液,均勻涂布在固體培養基上。取6 mm濾紙片三片,分別移取5 μL不同水解時間的果膠水解物滴于濾紙片上均勻潤濕,平鋪于培養基上,放于培養箱中37 ℃培養24 h并做空白對照。觀察有無抑菌圈,用游標卡尺十字交叉法測定抑菌圈直徑。實驗平行重復三次,比較抑菌效果,通過抑菌圈大小確定最佳水解時間。

1.2.9.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用二倍稀釋法測定具有最大抑菌圈直徑水解物的MIC和MBC。第1～7管的樣品質量濃度分別為16、8、4、2、1、0.5 g/L。吸取1 mL大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液(106～107CFU/mL),將各試管置于37 ℃下培養24 h,觀察細菌生長情況,以完全無菌生長的濃度為其MIC。分別從樣品濃度不低于MIC的各試管中取1 mL培養液于營養瓊脂平板上,涂布均勻后于37 ℃下繼續培養24 h,觀察細菌生長情況。以仍無菌生長或菌落總數小于5的濃度為樣品的MBC,同時以相同濃度的山梨酸鉀作對照實驗[17]。試驗重復3次。

1.3 數據處理

采用Origin 9.5軟件作圖,SPSS 22.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 小粒咖啡果皮果膠的鑒別實驗

2.1.1 表觀特征鑒別實驗 小?？Х裙すz中加蒸餾水得到粘稠狀液體,然后加氫氧化鈉出現了半透明的凝膠沉淀。該鑒別實驗說明小?？Х裙すz符合果膠的表觀特征。

2.1.2 小?？Х裙z的紅外光譜分析 小?？Х裙すz的紅外光譜如圖1所示,小?？Х裙すz在3580～3100 cm-1出現一個來自-OH伸縮振動的寬峰,該區域的形成主要是由于分子間和分子內半乳糖醛酸聚合物的氫鍵作用[25]。在2920 cm-1附近出現的尖銳的吸收峰是烷基的伸縮振動,1732和1261 cm-1是酯化的羧基(-COOR)和羧基(COO-)中羰基的吸收峰,1048 cm-1是糖苷鍵(C-O-C)的彎曲振動峰,1200～1000 cm-1的強吸收峰是果膠分子的指紋區,對比商品果膠的紅外光譜圖[26],兩者紅外光譜圖相似,并結合果膠表觀特征和表4中半乳糖醛酸的含量已達到國家標準,可以確定小?？Х裙ぬ崛∥餅楣z。

表4 云南小?？Х裙すz的理化性質Table 4 Physicochemical property of pectin from Coffea arabica pericarp

圖1 小粒咖啡果皮果膠紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectroscopy of pectinfrom Coffea arabica pericarp

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對得率的影響 由圖2可見,隨著提取劑用量的增大,果膠得率先增加后下降。當料液比為1∶15和1∶20 g/mL時,果膠得率較低,可能因為溶劑量少,使得物料粘度大,且濃度梯度小,擴散速度慢,原料中的果膠難以大量轉移到提取液中,使得提取不完全,產率低且過濾困難[27]。當料液比為1∶30 g/mL時果膠得率最高為10.05%。繼續增加提取劑用量,則醇析消耗的乙醇量增大,濃縮時間增長、能耗增加,考慮到成本和后續濃縮環節[28],料液比應控制在1∶30 g/mL為宜。通過單因素方差分析,當料液比范圍在1∶15～1∶20 g/mL和1∶25～1∶35 g/mL時,料液比對果膠得率影響不顯著(P>0.05),但兩段料液比對果膠得率存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 料液比對果膠得率的影響Fig.2 The effect of material liquid ratioon extraction rate of pectin注:不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖3～圖5同。

2.2.2 提取液pH對得率的影響 由圖3可知,隨著pH的升高,果膠得率先增加后降低。當提取液pH為1時,果膠得率較低,這可能是因為當提取液的pH過低時,提取液的極性較強,果膠分子的甙鍵和酯鍵斷裂,果膠會發生解聚[29],且pH越低,溶液顏色越趨于紅褐色,影響果膠產品顏色。當提取液pH為1.5時,果膠會逐漸轉化為水溶性果膠,果膠得率最高為9.56%。當pH進一步增加時,果膠可能會轉化為果膠酸[30],得率降低。因此,選擇提取液pH為1.5為宜。通過單因素方差分析,除pH為1.0和2.0、2.5和3.0時果膠得率差異不顯著(P>0.05),其余不同pH下果膠得率均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 提取液pH對果膠得率的影響Fig.3 The effect of pH on extraction rate of pectin

2.2.3 提取溫度對得率的影響 由圖4可知,隨著提取溫度的上升,果膠得率也迅速增加,當提取溫度達到50 ℃,得率最高為10.18%,顯著高于其它提取溫度(P<0.05)。由于原果膠水解為水溶性果膠需要在一定的溫度下才能進行,溫度太低,只有部分原果膠轉化為果膠,水解不完全,得率較低。當提取溫度過高時,由于果膠的耐熱性較差,會使生成的果膠因為水解程度劇烈而進一步降解成果膠酸,導致得率下降[30]。因此,選擇提取溫度50 ℃為宜。

圖4 提取溫度對果膠得率的影響Fig.4 The effect of temperature on extraction rate of pectin

2.2.4 提取時間對得率的影響 由圖5可知,果膠得率隨提取時間的增加出現先升高后降低的趨勢。提取時間為100 min時,果膠得率最高為12.75%,顯著高于其它提取時間(P<0.05),隨著提取時間的延長,小粒咖啡果皮中的果膠得到充分水解,果膠得率也迅速升高。當提取時間過長時,則會造成果膠分子鏈發生熱降解反應,致使果膠產率下降,且在酸性條件下放置太長時間也會造成酸性降解[31-32],所以100 min是最適宜提取時間。考慮到提取時間過長,耗能增多,果膠在酸性溶液中時間過長會部分分解,所以選擇60、80、100 min進行正交試驗。

圖5 提取時間對果膠得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on extraction rate of pectin

2.3 正交試驗結果

正交試驗結果如表2所示。采用酸法提取小粒咖啡果皮中的果膠,對得率影響的大小順序為:提取溫度(C)>提取液pH(B)>提取時間(D)>料液比(A),最佳提取工藝為:A2B2C3D3,即料液比為1∶30 g/mL,pH為1.5,提取溫度60 ℃,提取時間為100 min。并在該工藝條件下,進行3組平行試驗,果膠的平均得率為15.13%。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

表3表明,提取溫度(C)、提取液pH(B)和提取時間(D)對小粒咖啡果皮果膠的得率影響極顯著(P<0.01)，而料液比(A)對小?？Х裙すz的得率影響顯著(P<0.05)。因素對得率影響的大小順序為：C>B>D>A，與極差分析結果一致。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.4 小?？Х裙すz理化性質

如表4所示,通過測定發現,小?？Х裙すz中半乳糖醛酸的含量為67.71%,均符合GB 25533-2010和QB-2482-2000標準要求。干燥失重為10.17%、總灰分22.75%、pH2.61均達到GB 25533-2010和QB-2482-2000相應的要求。酯化度在50%～75%的范圍內,屬于高酯果膠。酸不溶性灰分為1.57%,超過國家標準范圍(≤1),由于小?？Х裙すz為天然提取物,因此無機營養元素含量相對較高。

2.5 小粒咖啡果皮果膠熱穩定性

本實驗在60 ℃下提取小粒咖啡果皮中的果膠,其半乳糖醛酸的含量為67.71%,達到了國家標準,可見在60 ℃下小粒咖啡果皮果膠是穩定的,但由于醇析后需要對果膠進行干燥處理,因此需考慮干燥時間對果膠穩定性的影響。由圖6可知,隨著干燥時間的增加,小?？Х裙すz粘度呈下降趨勢。在干燥初始的0～4 min內,咖啡果膠粘度極速下降,在4 min后下降趨勢稍緩,這可能是由于在干燥初始時,果膠鏈間原本存在的交聯作用而產生的聚合物被熱力作用迅速破壞,故而使其粘度下降明顯。隨著時間的延長(4～10 min),因為果膠分子內部的作用力早已破壞,其粘度下降趨勢較為緩慢[33]。因此,本實驗采用了真空干燥(40 ℃)小?？Х裙すz,以確保在干燥過程中果膠的穩定性。

圖6 干燥時間對咖啡果皮果膠粘度的影響Fig.6 The effect of drying timeon pectin viscosity of coffee pericarp

2.6 小粒咖啡果皮果膠水解物抑菌活性

2.6.1 不同水解時間對果膠水解物抑菌活性的影響 如表5所示,在咖啡果皮果膠未水解時,就有一定的抑菌活性,在0～180 min內,果膠水解物的抑菌效果隨時間延長而提高,進一步延長水解時間,果膠水解物的抑菌活性開始降低。這可能是因為一定條件下,大分子的果膠水解生成小分子低聚半乳糖醛酸,低聚半乳糖醛酸具有抗菌作用,但隨著水解時間進一步延長,低聚半乳糖醛酸水解生成D-半乳糖醛酸,寧恩創等[16]、馬慶一等[15]、李學紅等[23]也發現果膠的酶解最終產物和酸解產物均無抑菌活性,因此隨著水解時間的繼續延長,抑菌活性降低,故抑制大腸桿菌、草芽孢桿菌、黃色葡萄球菌的最佳水解時間分別為180、150、150 min。在最佳水解時間下水解咖啡果皮果膠,測定其對三種菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。

表5 不同水解時間對咖啡果皮果膠水解物抑菌活性影響Table 5 Effect of different hydrolysis time on bacteriostaticactivity of pectin hydrolysate from coffee pericarp

2.6.2 果膠水解物的最低抑菌濃度(MIC) 表6所示,咖啡果皮果膠水解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC分別為8、4、8 g/L,而對照山梨酸鉀對三種菌的MIC分別為:2、4、4 g/L,可見,咖啡果皮果膠水解物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性不如山梨酸鉀,但對枯草芽孢桿菌的抑菌活性與山梨酸鉀相當。

表6 咖啡果皮果膠水解物對三種菌的MICTable 6 MIC of pectin hydrolysatefrom coffee pericarp to three bacterias

2.6.3 果膠水解物的最低殺菌濃度(MBC) 如表7所示,小?？Х裙すz水解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MBC分別為16、8、16 g/L。對照組山梨酸鉀為4、8、8 g/L。結果表明,在濃度較高時果膠的水解物對三種供試菌具有殺菌作用,且對枯草芽孢桿菌的殺菌作用與山梨酸鉀相當,但對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用低于山梨酸鉀。

表7 咖啡果皮果膠水解物對三種菌的MBC Table 7 MBC of pectin hydrolysatefrom coffee pericarp to three bacterias

3 結論

首次從云南小粒咖啡果皮中提取果膠,采用單因素正交試驗優化得到果膠的最佳提取工藝為:料液比1∶30 g/mL,pH為1.5,提取溫度60 ℃,提取時間為100 min,在此工藝條件下咖啡果皮果膠的得率為15.13%。采用果膠酶對小粒咖啡果皮果膠進行水解,考察果膠水解物的抑菌效果,結果表明,小?？Х裙すz水解物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌活性。其中,果膠水解物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為:8 g/L,MBC均為:16 g/L,比山梨酸鉀的活性弱。而果膠水解物對枯草芽孢桿菌的MIC和MBC分別為:4、8 g/L,抑菌活性和山梨酸鉀相當。該提取方法相對簡單,能耗較小,適合于鄉鎮咖啡果皮廢料提取果膠,并且提取的咖啡果皮果膠理化性質符合果膠標準,有較好的抑菌活性,可開發成為一種新的天然食品防腐劑,為云南小粒咖啡果皮的高值化綜合加工利用提供了新途徑。