超聲對燕麥蛋白氧化聚集體結構及特性的影響

徐 悅,郭亞男,李順秀,馬 軍,李明月,王中江,江連洲,劉 軍,*

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.山東禹王生態食業有限公司,山東禹城 251200)

燕麥被稱為“第三主糧”,是一種產量豐富、營養價值極高的全價食品,具有平穩血糖、降低血壓血脂等功效。2002年,燕麥作為美國《時代》雜志評選的“全球十大健康食品”中唯一上榜的谷類食品位列第五,其中含量豐富的燕麥蛋白已成為近幾年的研究熱點[1]。燕麥蛋白是一種由四種單純蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白)組成的優質谷物蛋白,在燕麥中含量高達15%左右,是小麥粉、大米的1.6～2.3倍[2]。燕麥蛋白的氨基酸組成接近FAO/WHO推薦的營養模式,人體利用率高,而且含有一般谷物中缺少的賴氨酸和精氨酸。有研究表明,賴氨酸對幼兒骨骼生長和大腦發育非常有益,色氨酸具有改善睡眠和防止頭發脫落等作用[3]。燕麥蛋白具有良好的營養特性和功能特性,可廣泛應用于食品行業中。但燕麥中含有豐富的脂肪,其含量高達10.57%,這導致燕麥蛋白極易被氧化。燕麥蛋白氧化變性,其構象發生變化,分子內部基團暴露后重組形成寡聚體,在疏水性和靜電引力的作用下進一步形成大分子量聚集體,導致溶解度和界面活性降低,進而導致燕麥蛋白功能特性的下降[4]。

目前,通過物理手段對氧化蛋白聚集體進行調控的研究比較廣泛,如超聲波處理[5]、脈沖電場處理[6]和高壓均質處理[7]等,通過改變蛋白質聚集體的空間結構來改善蛋白質的功能特性。但高壓均質處理技術因耗能較大、處理量小,無法進行工業化生產;脈沖電場處理技術對環境如pH、溫度等要求較高,操作難度大。而超聲作為一種非熱物理加工技術,由于其綠色高效、操作簡單,更加適合在食品工業中應用[8]。研究發現,超聲空化作用產生的剪切力可以破壞維持蛋白結構的作用力,如氫鍵、范德華力和疏水性等,進而改變蛋白質粒徑分布范圍[9],提高蛋白質表面的疏水性[9-10],改善蛋白質的溶解度和乳化性[11-12]以及改變蛋白質分子的聚集程度[13]等。而蛋白的氧化過程通常發生在加工之前,因此將超聲直接作用于已氧化的蛋白聚集體,以達到解聚和提高蛋白功能特性的目的,具有重要的研究意義。偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)分解產生的過氧自由基是脂質過氧化反應中最主要的自由基中間體[14],這種中間體會對蛋白質結構和性質產生重要影響,且采用此試劑構建的氧化聚集模型重現性和穩定性較好,因此常將AAPH作為構建氧化蛋白模型的氧化誘導劑。

本研究以燕麥蛋白為研究對象,采用AAPH構建過氧自由基-燕麥蛋白氧化體系,模擬工廠儲藏過程中實際產生的氧化蛋白聚集體,將氧化蛋白聚集體分別進行不同超聲功率(0、100、200、300、400、500、600 W)的超聲處理,探究超聲處理對蛋白結構特性(粒徑、PDI、濁度、電位、二級結構、官能團、疏水性)和功能特性(溶解度、乳化性和乳化穩定性)的影響,進而研究超聲對氧化蛋白結構的改變與功能特性變化的關系,以期在分子水平上探究燕麥蛋白發生結構性氧化修飾的機理,為燕麥蛋白產品的開發以及儲藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥蛋白 純度85%,西安皓源生物技術有限公司;二硝基苯肼 天津博迪化工股份有限公司;三氯乙酸 天津市致遠化學試劑有限公司;疊氮化鈉(NaN3) 山東浩中化工有限公司;乙酸乙酯 天津市光復精細化工研究所;β-巰基乙醇 Geniview公司;過硫酸銨 Geniview公司;偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH) 美國Sigma公司;2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA鈉鹽 天津市博迪化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 上海浩洋生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA) 廣州奈姆塔貿易有限公司;8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS) 上海將來實業股份有限公司;尿素(Urea)試劑 武漢博士康生物工程有限公司;Tris-Gly緩沖液(pH8.0) 北京強欣博瑞生物技術有限公司;山歌玉米油 山東山歌食品有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 索萊寶生物科技有限公司。

Biosafer 650-92超聲波細胞破碎儀 賽飛有限公司;HH-6數顯水浴鍋 山東愛博科技貿易有限公司;LW-1600 FC紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;Zetasizer Nano ZSP 馬爾文儀器公司;F-4500熒光分光光度計 日本HITACHI公司;MAGNA-IR 560傅立葉變換紅外光譜 美國尼高力公司;Ultra-Turrax T 25高速分散器 德國IKA公司;ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司;PHSJ-4A型實驗室pH計 中國上海雷磁公司;DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;XW-80 A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 可溶性超聲燕麥蛋白的氧化聚集體的制備 根據王丹丹等[15]的方法并修改,將燕麥蛋白溶于0.01 mol/L pH7.4(含NaN30.5 mg/mL)的磷酸鹽緩沖溶液配制成10 mg/mL的燕麥蛋白溶液,加入AAPH于燕麥蛋白溶液中使AAPH濃度為1 mmol/L,在避光37 ℃恒溫條件下氧化處理24 h后,加入14000 kDa透析袋中,于4 ℃透析72 h,每6 h換一次去離子水,透析后的液體100 mL在冰浴條件下放置于超聲波細胞破碎儀中,液面浸沒變幅桿3 cm,在超聲功率(0、100、200、300、400、500、600 W)條件下超聲5 min,工作時間和間歇時間均為5 s,以循環冷熱水控制超聲溫度,將超聲處理后的溶液轉移至4 ℃離心機中二次離心處理,離心條件為9000 r/min,20 min,留存上清液倒入板中經過24 h冷凍干燥后即可得到7種可溶性超聲燕麥蛋白聚集體,包含原可溶性燕麥蛋白在內共得到8種樣品分別命名為SOAP、SOOAP、U-100 W-SOOAP、U-200 W-SOOAP、U-300 W-SOOAP、U-400 W-SOOAP、U-500 W-SOOAP、U-600 W-SOOAP。

1.2.2 濁度的測定 參照李云[16]的方法,并稍作修改。將樣品溶于去離子水中配制成所需的濃度,在室溫下磁力攪拌60 min。分光光度計在600 nm下測定其吸光度。以去離子水作空白,測定其吸光度值A,濁度計算公式為

式(1)

式中:A表示稀釋乳液在600 nm處的吸光度;V表示稀釋倍數;I表示光程差0.01 m。

1.2.3 粒徑分布的測定 將樣品配成0.05 g/mL的溶液,攪拌均勻后,緩慢加入測量池中,當遮光度達到8%左右時即停止加樣,使用Zetasizer Nano ZS測量其粒徑值和PDI值。

1.2.4 電位分析 參照Crudden等[17]的測定方法,并稍作修改。采用Zetasizer Nano ZSP對蛋白溶液的Zeta電位進行測定。將蛋白樣品分散到50 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液中,配成質量分數為0.2%的蛋白溶液,上樣體積為1 mL,測定溫度為25 ℃。

1.2.5 紅外光譜分析 參照袁德保[18]的方法,并稍作修改。將凍干樣品置于干燥器內充分干燥,稱取1 mg樣品于100 mg溴化鉀中混勻,在瑪瑙研堝中研磨并用壓片器壓片,于紅外光譜儀中測定吸收光譜。測量條件:波數范圍為4000～400 cm-1的,分辨率4 cm-1,波數精度0.01 cm-1,掃描次數64次,溫度25 ℃。

1.2.6 表面疏水性測定 參照Kato等[19]的方法,并稍作修改。用0.1 mol/L的中性磷酸鹽緩沖溶液稀釋,10000 r/min高速離心處理0.5 h除去沉淀物,以Lowery法分析測試上清液中蛋白濃度,通過磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋,調控蛋白溶液濃度于0.05～0.4 mg/mL,取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同濃度的蛋白溶液4 mL,經振蕩混勻后靜置3 min,在熒光分光光度計下進行熒光強度測試,測試條件為激發波長設置為λex=390 nm,發射波長設置為λem=468 nm,掃描夾縫設置為5 nm,掃描速度設置為10 nm/s。將熒光強度與蛋白濃度作線性圖,以初始段的斜率值計為樣品的表面疏水性大小。

1.2.7 游離氨基含量測定 參照周麟依等[20]的方法,并稍作修改。400 mg OPA試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中,而后依次向溶液中加入預先配制的濃度為200 g/L SDS溶液2.5 mL及濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL,繼而轉移至通風櫥內加入100 μL的β-巰基乙醇,最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL,制備成OPA溶液用于后續檢測分析,量取OPA試劑4 mL與200 μL氧化米糠蛋白樣品充分混勻后進行35 ℃水浴處理2 min,以蒸餾水空白組為對照在340 nm處測定吸光值。

1.2.8 蛋白游離巰基和二硫鍵含量的測定 參照Ellman等[21]的方法,并稍作修改。稱取400 mg的DTNB,加入Tris-Gly緩沖液定容至100 mL,配成Ellman試劑。分別稱取2 mg蛋白樣品溶解于2 mL的TrisGly緩沖液(pH8.0)和0.02 mL的Ellman試劑。測定時溶液振蕩快速混合后在25 ℃下保溫反應15 min,用分光光度計測定其在412 nm處的吸光度,以不加Ellman試劑為空白,以13600 L/(mol·cm)消光系數計算游離巰基含量。將樣品蛋白用磷酸鹽緩沖液配成0.5 mL質量濃度為5 mg/mL的蛋白質溶液,置于10 mL塑料離心管中,加入2.5 mL含8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸(10.4 g Tris 6.9 g甘氨酸,每升加1.2 g EDTA,pH8.0),每隔1.5 min加入20 μL DTNB(0.004 g DTNB用Tris-甘氨酸溶解定容至1 mL,避光),反應25 min,立即在412 nm處測吸光度。對照組不加蛋白質溶液,其他處理方法相同,以13600 L/(mol·cm)消光系數計算總巰基含量。根據標準曲線(y=0.0502x-0.0009,R2=0.9994)計算出蛋白質質量濃度ρ。使用摩爾消光系數13600 L/(mol·cm),根據公式計算巰基和二硫鍵含量。

式(2)

式(3)

式中:A412表示加Ellman試劑時樣品的吸光度;D表示稀釋系數;C表示樣品蛋白最終質量濃度,mg/mL。

1.2.9 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 參考安然[22]的方法,并稍作修改。樣品緩沖液包含25 g/100 mL甘氨酸、12.5 g/100 mL的0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)、2 g/100 mL SDS及1 g/100 mL溴酚藍,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為5%。樣品處理:將蛋白樣品中加入2%(v/v)β-巰基乙醇,電泳前煮沸5 min,上樣量為10 μL,凝膠電泳在恒流模式下進行,在濃縮膠中電流80 mA,進入分離膠后增至120 mA。凝膠染色液采用0.25%考馬斯亮藍(R250)溶液,脫色采用高甲醇的醋酸溶液,甲醇/冰乙酸/去離子水按227∶37∶236 (v/v/v)。

1.2.10 蛋白溶解度的測定 參照Petrucelli等[23]的方法,并稍作修改。2%(w/w)的燕麥蛋白的分散液經充分攪拌后離心(10000×g,10 min,20 ℃)。用凱氏定氮法測上清液的蛋白含量。上清液的蛋白總含量與樣品蛋白總含量的比值即為溶解度。

式(4)

式中:S表示溶解度,%;P0表示上清液中蛋白質的總量,mg;P1表示樣品中蛋白質的總量,mg。

1.2.11 乳化性和乳化穩定性的測定 參照Pearce等[24]的方法,并稍作修改。在管內在測試管中分別加入15 mL 0.1%(w/v)蛋白質溶液和5 mL玉米油,乳液經高速均質機(24000 r/min)處理1 min后,從測試管底部取出50 μL乳液,用0.1%(w/v)的SDS溶液稀釋100倍后,在500 nm波長下測出吸光度。乳化活性指數(EAI)和乳化穩定性指數ESI的計算公式為:

式(5)

式(6)

式中,DF表示稀釋引子,DF=100;A0、A30分別表示0、30 min時的吸光度;c表示蛋白濃度,g/mL;φ表示光程,φ=0.01 m;θ表示油相所占分數,θ=0.25。

1.3 數據處理

每個實驗均進行三次重復平行實驗,利用SPSS Statistics 22軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析,用Tukey’s HSD法進行ANOVA差異性檢驗,差異顯著P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12軟件分析等進行數據分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結果與分析

2.1 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的結構

如圖1～圖4可知,與SOAP相比,SOOAP的粒徑增大,PDI值和濁度值也隨之增大,而電位值隨之降低;與SOOAP相比,經過超聲處理的氧化燕麥蛋白,隨著超聲功率的增大,蛋白粒徑值、PDI值和濁度值呈現先減小后增大趨勢,粒徑值、PDI值和濁度值在超聲功率為500 W時分別從855.33 nm、0.97和543下降到最小值507.34 nm、0.26和267,電位值則呈現先增大后減小的趨勢,且在超聲功率為500 W時最大。

圖1 可溶性超聲燕麥蛋白濁度值Fig.1 The turbidity value of soluble ultrasonic oat protein注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),圖2～圖4，圖6、圖8、圖9同。

圖2 可溶性超聲燕麥蛋白平均粒徑Fig.2 The average particle size of soluble ultrasonic oat protein

圖3 可溶性超聲燕麥蛋白PDI值Fig.3 The PDI value of soluble ultrasonic oat protein

圖4 可溶性超聲燕麥蛋白電位值Fig.4 The potential value of soluble ultrasound oat protein

氧化可誘導蛋白結構部分解折疊暴露出更多的疏水基團,增大蛋白結構體積和疏水相互作用,減小表面靜電荷密度,增大多肽鏈間靜電相互作用,促進了氧化聚集體的形成,顆粒大小的差異也較大,蛋白液體中懸浮物增多,進而導致蛋白粒徑、PDI值和濁度的增大。聚集過程中的對電荷的包埋掩藏作用消耗了溶液中的電荷,促使蛋白電位值減小。研究表明,超聲可通過空化作用打開蛋白聚集體,使其最大程度的解離和崩解[25],蛋白顆粒進一步減小[10],平均粒徑、PDI值和濁度值降低,電位值增大,且隨著超聲功率的增大其作用效果越明顯,并在超聲功率為500 W時效果達到最大。當超聲功率超過500 W時,粒徑、PDI值和濁度值增大可能與強烈的超聲波造成蛋白構象改變,導致一些疏水基團的嵌入而形成大的聚集體有關[10,26]。

2.2 氧化聚集體二級結構組分測定

紅外光譜圖有3組特征吸收譜帶,包括酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶,酰胺Ⅰ帶位于波數1600～1700 cm-1范圍內,主要由C=O的伸縮振動和H-O-H彎曲振動引起的,能夠反映蛋白質二級結構α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲含量的變化。如表1所示,與SOAP相比,SOOAP中β1結構增多,α-螺旋和無規卷曲結構均減少;與SOOAP相比,氧化的燕麥蛋白經過超聲處理后,隨著超聲功率的增大(100～200 W),β-折疊結構增多,α螺旋和β轉角結構減少,隨著超聲功率的進一步增大(300～500 W),β折疊結構減少,α螺旋和β轉角結構增多,而當超聲功率為600 W時β1和β2結構增多。

表1 二級結構組分含量Table 1 Secondary structure component content

研究表明,反向平行的折疊結構(β1)在聚集的蛋白質分子中形成[27],β1結構的增多從側面反映蛋白發生聚集。蛋白在經過氧化誘導時,蛋白發生解折疊反應,α-螺旋結構被打開,且暴露的疏水性基團增大到某個值時,靜電斥力和疏水相互作用的平衡被打破,促進蛋白發生聚集,因此β-折疊結構含量上升,α-螺旋和無規卷曲含量下降,這與尤翔宇等[28]研究結果一致。超聲處理產生的剪切力和空穴效應誘導蛋白質部分結構的展開[29],將不可溶性聚集體轉化為可溶性聚集體,在超聲功率為100～200 W時β-折疊結構增多,α-螺旋和β-轉角結構減少可能與轉化過程導致可溶性聚集體含量大量增多有關。隨著超聲功率的進一步增大,強烈的剪切力促使β-折疊結構進一步主要轉化為β-轉角、非天然α-螺旋結構和高度有序的超分子結構,β-折疊結構減少,α-螺旋、β-轉角和γ-無規則卷曲增多,且伴有更強的分子內部氫鍵,由此提高了蛋白的功能性質。但當超聲功率達到600 W時,高強度超聲作用可誘導蛋白構象發生變化[30],促進蛋白發生聚集,促使α-螺旋含量和無規則卷曲結構的減少,β-折疊結構的增加,這與He等[30]的研究結果相一致。

圖5 紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectrum map

2.3 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的表面疏水性

蛋白質表面疏水性是與極性水性環境接觸的蛋白質分子表面上疏水基團數量的指數,并且與其功能性質密切相關。如圖6所示,與SOAP相比,蛋白經過氧化后,其表面疏水性增大。與SOOAP相比,氧化燕麥蛋白經過超聲處理后,隨著超聲功率的增大,其表面疏水性呈現先增大后減小的趨勢,且在超聲功率為400 W時表面疏水性最大,提高了1180.4。

圖6 表面疏水性Fig.6 Surface hydrophobicity diagram

蛋白經過氧化后,氧化修飾可導致蛋白質片段化、交聯、展開和構象變化,暴露蛋白疏水性基團,使疏水相互作用增大,而疏水性的增大在一定程度上促進蛋白發生聚集,表面疏水性降低。經過超聲處理后,隨著超聲功率的增加(100～400 W),蛋白發生解折疊作用,將不溶性聚集體轉化為可溶性聚集體,蛋白分子擴大,暴露出疏水基團,表面疏水性增大。超聲處理引起的空化現象導致局部溫度和壓力的大幅增加也可促進蛋白的解聚,使位于分子內部的疏水區域暴露于表面,即表面疏水性增大,超聲功率越大解聚效果越明顯[31]。但當超聲功率超過500 W,蛋白的構象變化導致更多親水性氨基酸殘基以水為導向致使蛋白重新聚集,蛋白的表面疏水性減小[32]。

2.4 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的官能團含量

游離氨基的含量變化可從側面表征蛋白氧化的程度[33]。巰基基團(-SH)是蛋白中重要的功能基團,其含量變化可反映蛋白質的變性程度,對其功能性質的發揮具有很重要的作用。如圖所示,與SOAP相比,SOOAP的二硫鍵含量增加,氨基、巰基含量減少。與SOOAP相比,氧化的燕麥蛋白聚集體經過超聲處理后,隨著超聲功率的增大,游離氨基和游離巰基含量呈現先增加后降低的趨勢,且巰基和氨基在500 W時達到最大,而二硫鍵含量呈現先降低后增加的趨勢,且二硫鍵在500 W時達到最小值,降低了0.77 nmol/mg。

研究表明,AAPH是一種水溶性偶氮類自由基引發劑[34],其溶液在有氧條件下熱降解可形成過氧自由基,其解折疊作用促使蛋白中更多的SH基團暴露,二硫鍵斷裂,且隨著氧化程度的增大,促進蛋白發生了分子間聚集,進而導致游離巰基和總巰基含量的下降,二硫鍵含量增加,并誘導賴氨酸殘基上的ε-氨基轉化為蛋白質羰基基團,氨基含量減少[35]。超聲對蛋白二、三級結構的破壞作用促進了二硫鍵斷裂,使SH基團暴露于蛋白質的表面,即SH含量增加。而隨著超聲功率的增大,二硫鍵斷裂含量減少,SS轉化為SH,游離氨基和游離巰基含量增多[36]。隨著超聲功率的進一步增大,燕麥蛋白質變性伸展,疏水性區域[37]和游離氨基暴露,疏水相互作用的增大促使蛋白發生聚集,二硫鍵含量增多,游離氨基含量和游離巰基減少。超聲可調控分子間的聚合與解聚,改變氨基和巰基含量,進而影響蛋白的功能特性。

表2 官能團含量分布Table 2 Distribution of functional groups

2.5 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

超聲處理對可溶性氧化燕麥蛋白的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜如圖7所示,其中泳道1為標準分子量。通過凝膠成像分析儀分析SDS-PAGE圖譜,發現與SOAP相比,SOOAP中7 S蛋白的α亞基和11 S蛋白的A亞基的特征條帶的強度明顯減弱;與SOOAP相比,氧化的燕麥蛋白經過超聲處理后,隨著超聲功率的增大(100～500 W),7 S蛋白的α′亞基、β亞基含量和11 S蛋白的B堿性亞基含量逐漸增加,而當超聲功率為600 W時蛋白因氧化導致的7 S蛋白的α亞基和11 S蛋白的A亞基的特征條帶明顯減弱現象有所改善,且7 S蛋白的α′亞基、β亞基和11 S蛋白的B亞基條帶密度明顯增加。研究表明,在氧化過程中β-伴球蛋白和球蛋白會受到AAPH的侵害,導致亞基特征條帶的強度減弱[38];而隨著超聲功率的增加,蛋白亞基含量升高是因為超聲處理產生的空穴效應使二硫鍵斷裂,蛋白分子的空間結構被破壞,亞基被解聚,含量增加。當超聲功率過高時,因超聲作用被解聚的亞基又重新聚合,進而影響蛋白的結構特性[18,39]。

圖7 超聲處理對可溶性氧化燕麥蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.7 SDS-PAGE electropherogram ofsolubilized oxidized oat protein by sonication注:從1～9泳道依次對應為Marker、SOAP、SOOAP、U-100 W-SOOAP、U-200 W-SOOAP、U-300 W-SOOAP、U-400 W-SOOAP、U-500 W-SOOAP和U-600 W-SOOAP。

2.6 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的溶解度

如圖8示,與SOAP相比,蛋白經過氧化后,其溶解度減小。與SOOAP相比,氧化燕麥蛋白經過超聲處理后,隨著超聲功率的增大,溶解度呈現先增大后減小的趨勢,且在超聲功率為500 W時溶解性最大,提高了2.3%,當超聲功率為600 W時溶解度減小。AAPH氧化誘導下蛋白質結構逐漸解折疊,氧化蛋白的共價和非共價交聯相互作用弱化,暴露出更多的疏水基團,當疏水相互作用超出某一臨界值,促進了蛋白聚集,產生不溶性聚集體,降低了蛋白的溶解度[40]。已有研究表明,超聲處理可提高蛋白溶解度[41],且隨著超聲功率的增大而溶解度增大。但當超聲功率為600 W時,超聲促使蛋白發生聚集,溶解度減小[42]。

圖8 蛋白溶解度圖Fig.8 Protein solubility map

2.7 可溶性超聲燕麥蛋白氧化聚集體的乳化性和乳化穩定性

當蛋白質吸附于乳液的油水界面形成界面層,其乳化能力取決于分子結構特征和物理化學性質,包括構象穩定性、溶解度和疏水性等[43-44]。如圖9所示,與SOAP相比,SOOAP的乳化性和乳化穩定性降低。與SOOAP相比,燕麥氧化蛋白隨著超聲功率的增大,乳化性和乳化穩定性呈現先增大后減小的趨勢,乳化性在超聲功率為500 W時達到最大,提高了207.95 m2/g;乳化穩定性在超聲功率為400 W時達到最大,提高了361.48 m2/g。

圖9 乳化特性圖Fig.9 Emulsification characteristics map

AAPH氧化誘導的蛋白隨著蛋白結構的展開,其疏水相互作用逐漸增大,促進蛋白聚集,疏水性基團被重新掩埋,表面疏水性和溶解性降低,導致蛋白的乳化性和乳化穩定性降低。研究發現,超聲產生的空化效應和剪切力可破壞蛋白聚集體結構,改變顆粒尺寸,影響尺寸分布以及顆粒形狀,進而改變蛋白的功能[10]。隨著超聲功率的增大,維持蛋白質空間結構穩定性的非共價鍵被超聲造成的空化作用力破壞,蛋白質的疏水基團暴露,更多蛋白質分子擴散到水油界面,提高了蛋白的乳化特性[45]。但隨著超聲功率進一步增大,小分子蛋白吸附在界面上時易被大分子蛋白代替,導致乳化性和乳化穩定性降低[46]。

3 結論

與SOAP相比,氧化處理后的SOOAP平均粒徑、濁度、表面疏水性和二硫鍵含量顯著上升(P<0.05),蛋白質的有序結構增多,亞基含量增加,溶解度、乳化性和乳化穩定性顯著降低(P<0.05)。這表明氧化可以通過改變燕麥蛋白的空間構象和聚集形態,降低其功能特性。500 W的超聲處理,可以明顯降低SOOAP的平均粒徑、PDI和濁度,增大表面疏水性和ζ電位,并促使蛋白質有序結構往無序結構轉變,聚合后的亞基因超聲作用重新解聚,含量增加,進而提高其溶解性、乳化性和乳化穩定性。當功率超過500 W時,超聲促使蛋白質發生重新聚集。這表明超聲(500 W)能通過改變氧化后燕麥蛋白的分子間作用力,調控其空間構象和聚集形態,進而改善其功能特性。