保加利亞乳桿菌微膠囊的制備及特性研究

周 莉,王曉瑞,平 洋,譚 靜,張立攀,朱海華,關炳峰,劉紅偉,徐 鐘

(河南省商業科學研究所有限責任公司,河南鄭州 450002)

保加利亞乳桿菌是益生菌中被廣泛應用的乳酸桿菌[1],分布較廣,不僅在傳統發酵制品(酸奶、奶酪、冷凍乳制品[2]等)中常見,同時也存在于人體和動物的腸道中[3],有著非常重要的生理功能。乳桿菌具有調整腸道菌群平衡[4],抑制腸道中的致病菌和腐敗菌的繁殖[5],促進營養物質的吸收[6],免疫調節[7]，抗癌[8]等多種功能。隨著保加利亞乳桿菌的生理功能不斷被深入研究,保加利亞乳桿菌也得到了越來越多的關注。然而,保加利亞乳桿菌不宜儲存,而且抗逆性較差,對高酸性環境敏感,活菌數易降低或喪失[9]。保加利亞乳桿菌進入人體后,通過食管抵達胃部,但是人類胃液的pH較低,會導致此菌無法忍受胃液的高酸環境,最后無法發揮益生菌的作用[10]。

微膠囊化包埋技術可以降低腸胃對益生菌的殺傷,提高益生菌的存活率[11]。微膠囊包埋技術是一種新型的保護技術,可增強益生菌對外界不良環境的抵抗能力,有效提高益生菌的存活率,使益生菌順利到達腸道內定殖并真正發揮功效;同時避免不良反應的發生,改善食品在儲藏和運輸下的損失,延長貨架期[12]。因此,為了益生菌能夠達到益生作用,有必要開發新型包埋技術保護益生菌的活性,為其應用提供技術和參考價值[13]。壁材的選用是微膠囊包埋技術的關鍵。海藻酸鈉由于具有廉價、適用性高、安全無毒、生物相容性高的優點,是目前最廣泛用于包埋益生菌的壁材。肖雨等[14]利用海藻酸鈉和氯化鈣對保加利亞乳桿菌進行包埋,產酸量能達到59.4和55.8 g/L,產酸效果較好且保持了菌種的高活性。王偉潔等[15]以海藻酸鈉和果膠復合包埋制備保加利亞乳桿菌微膠囊,包埋率達到91.8%,提高了其在產品中的存活率。Krasaekoopt等[16]將雙歧乳桿菌與海藻酸鹽的混合液注入CaCl2固化液制得雙歧桿菌微膠囊,發現微膠囊化效果較好。殼聚糖由于成本低、無毒、具有生物可降解性已經被廣泛地應用于醫學和食品行業,它具有抗菌和抗氧化的特性[17]。有文獻報道,海藻酸鹽殼聚糖微膠囊有助于對細胞的保護[18],并且殼聚糖可以增強包埋的有效性[19]。

國內外有關益生菌微膠囊的研究大多停留在方法和壁材上,關于益生菌微膠囊在胃腸道的釋放情況研究甚少。本研究利用海藻酸鈉和殼聚糖復合包埋保加利亞乳桿菌,分別進行單因素實驗和正交試驗,以包埋率為指標,確定最佳包埋條件。研究在模擬胃腸道中活力變化及釋放特性,并觀察微膠囊在儲存期間活菌數的變化。本研究不僅有助于解決乳酸桿菌不耐人體胃腸道惡劣環境(如胃液低pH)的問題,同時為研究具有腸道緩釋功能的益生菌微膠囊壁材開辟了新思路,并通過益生菌來調節胃腸道微生態平衡,從而為益生菌保健功效的發揮奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS肉湯、MRS培養基、莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂 鄭州亞世生物技術有限公司;保加利亞乳桿菌 廣東環凱生物科技有限公司;純牛奶(250 mL/盒) 內蒙古伊利實業集團股份有限公司;胃蛋白酶(1∶3000)、胰蛋白酶(1∶250) biofroxx公司;海藻酸鈉(98%)、殼聚糖(脫乙酰度≥90%) 上海源葉生物科技有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈣、氯化鈉、鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司。

YQX-Ⅱ厭氧培養箱、DPX-9162B-2電熱恒溫培養箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司;TM 3030 plus 掃描電子顯微鏡 日本日立高新技術公司;85-2恒溫磁力攪拌器 海司樂儀器有限公司;YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司;UNIVERSAL 320R型高速離心機 德國Hettich公司;QL-866型旋渦振蕩器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司;BSC-1500ⅡB2-X型生物安全柜 鑫貝西Biobase公司;SHZ-82型恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司;HH-S恒溫水浴鍋 金壇市醫療器械廠;700 Series型-80 ℃冰箱 中科美菱公司;PL202-L電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;milli-Q超純水儀 美國Milipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將實驗室保存的保加利亞乳桿菌菌種按1%的量接種于9 mL MRS液體肉湯培養基中,37 ℃恒溫(厭氧)培養18 h,活化2～3次后,再按1%的量接種于250 mL MRS液體肉湯培養基中,37 ℃恒溫(厭氧)培養15 h,4500 r/min離心10 min收集菌體,0.9%生理鹽水洗滌,離心后再洗滌兩次,即得原始濃縮菌液。

1.2.2 微膠囊的制備 海藻酸鈉溶于滅菌水中[20],70 ℃下水浴加熱過夜至粉末充分溶解,制得海藻酸鈉溶液,并經過0.22 μm濾膜過濾除菌,冷卻備用。稱取一定質量的殼聚糖,溶于含有1%(w/w)鹽酸的無菌水中,在磁力攪拌器上攪拌直至溶解完全。使用磁力攪拌器在800 r/min速度下,固化備用。

稱取一定質量的氯化鈣顆粒溶于雙蒸水,121 ℃高壓滅菌15 min,制得氯化鈣溶液,將菌液、殼聚糖和海藻酸鈉按一定的比例混合,注射器將10 mL混合液滴入100 mL 氯化鈣固化劑中,形成微囊,磁力攪拌器攪拌30 min,使微囊充分凝固,用蒸餾水沖洗3次,除去多余的鈣離子和未被包埋的益生菌,即得濕膠囊。

1.2.3 微膠囊包埋率計算 稱取1 g微膠囊,加到9 mL磷酸鹽緩沖溶液中(pH7.4),均質分散30～60 s,緩慢搖晃此均質液5 min后,取適量勻漿液,稀釋一定倍數,涂布于MRS瓊脂培養基上,36 ℃厭氧培養48 h后計數平板上的所有菌落數。微膠囊的包埋率計算公式:

包埋率(%)=微膠囊中包埋的活菌數/制備微膠囊時添加的活菌數×100

1.2.4 微膠囊形態觀察 采用掃描電顯鏡(SEM)觀察微膠囊的表面形態時,在樣品臺上貼上一層雙面膠,將微膠囊輕輕粘在上面吹去多余的粉末,然后在樣品上噴金,進行SEM觀察,并對膠囊內部結構進行觀察。

1.2.5 微膠囊制備單因素實驗

1.2.5.1 海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響 在殼聚糖濃度為1.5%,氯化鈣濃度為2%,固化時間為120 min,海藻酸鈉濃度為1%、2%、3%、5%、8%的條件下,參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后,以微膠囊的包埋率為測定指標,探究海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響。

1.2.5.2 殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉濃度為3%,固化時間為120 min,氯化鈣濃度為2%,取殼聚糖濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的條件下,參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后,以微膠囊的包埋率為測定指標,探究殼聚糖的濃度對微膠囊包埋率的影響。

1.2.5.3 氯化鈣濃度對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉濃度為3%,殼聚糖濃度為1.5%,固化時間為120 min,氯化鈣濃度為1%、2%、3%、5%、8%的條件下,參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后,以微膠囊的包埋率為測定指標,探究氯化鈣的添加量對微膠囊包埋率的影響。

1.2.5.4 固化時間對微膠囊包埋率的影響 在海藻酸鈉濃度為3%,殼聚糖濃度為1.5%,氯化鈣濃度為2%的條件下,參照微膠囊的制備工藝形成微囊后,然后用磁力攪拌器攪拌,分別固化30、60、90、120、150 min,過濾,并用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。以微膠囊的包埋率為測定指標,確定最佳的固化時間。

1.2.6 正交試驗優化包埋條件 根據單因素實驗結果,篩選出效果較優的工藝條件。采用4因素3水平L9(34)正交試驗設計,以包埋率為檢測指標,通過試驗最終確定微膠囊工藝條件。正交試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 微膠囊在模擬胃液中的耐受性 模擬人工胃液[21]:取稀鹽酸16.4 mL,加水約800 mL,調pH到2.0,胃蛋白酶10 g,攪勻后加水定容至1000 mL即可。

取0.5 g微膠囊加入到模擬胃液(4.5 mL)中,充分混勻15 s,在37 ℃條件下,以200 r/min在搖床中振蕩處理30、60、90、120 min,分別離心并取樣,計算活菌數。并取保加利亞乳桿菌菌液做對照試驗。

1.2.8 微膠囊在模擬腸液中的釋放性 模擬人工腸液[22]:磷酸二氫鉀6.8 g,加500 mL蒸餾水溶解,用0.4%的氫氧化鈉調節pH至6.8;120 ℃滅菌20 min;胰蛋白酶10 g,加無菌水適量使溶解,將兩液混合后,加水定容至1000 mL。

取0.5 g微膠囊加入到模擬腸液(4.5 mL)中,充分混勻15 s,在37 ℃條件下,以200 r/min在搖床中振蕩處理30、60、90、120、150 min,分別離心并取樣,計算活菌數。并取保加利亞乳桿菌菌液做對照試驗。

1.2.9 微膠囊在食品中的儲藏穩定性 將制備好的經過包埋的保加利亞乳桿菌加入到純奶中,在4 ℃條件下進行保藏。每隔3～7 d對活菌數進行測定,檢測產品的儲藏穩定性。

1.3 數據處理

所有數據均為3次獨立重復試驗的結果,均采用平均數±標準差表示,利用Excel和SPSS對試驗數據進行分析,以P<0.05有顯著統計學意義。

2 結果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌微膠囊外觀形態特征

微膠囊形態為肉眼可見的白色圓形小球,大小較為均勻,差異不大,基本達到預期效果。當菌體和海藻酸鈉的復合物滴入到氯化鈣溶液后,再用殼聚糖溶液洗滌,形成一個個分散的小球,氯化鈣中的鈣離子和海藻酸鈉中的鈉離子不斷相互取代,形成海藻酸鈣凝膠,再與殼聚糖形成聚電解質膜,從而將菌液包埋起來,形成保加利亞乳桿菌微膠囊。

圖1 保加利亞乳桿菌微膠囊外觀圖Fig.1 The appearance of Lactobacillus bulgaricus microcapsule

圖2 微膠囊掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of microcapsules

2.2 單因素實驗

2.2.1 海藻酸鈉濃度對保加利亞乳桿菌微膠囊的影響 如圖3所示,海藻酸鈉濃度在1%～3%濃度范圍內,包埋率隨海藻酸鈉濃度的加大而增大,包埋率顯著提高(P<0.05)。當海藻酸鈉濃度達到3%時,包埋率達到最大,與其它試驗組有明顯差異性。當海藻酸鈉繼續增大時,包埋率降低。這是由于海藻酸鈉濃度高時,溶液粘度增大,益生菌不易分散[23];當海藻酸鈉濃度低時,形成的凝膠顆粒小,機械強度低,不能有效包埋菌體,影響包埋效果。選擇試驗最優結果,最終以3%的海藻酸鈉濃度為后續試驗條件。

圖3 海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of sodium alginate concentrationon microcapsule embedding rate注:不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖4～圖6同。

圖6 時間對微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effect of time on embedding rate of microcapsules

2.2.2 殼聚糖濃度對保加利亞乳桿菌微膠囊的影響 如圖4所示,當殼聚糖的濃度為1.5%時,微膠囊包埋率最高,與其它試驗組相比差異顯著(P<0.05)。隨著殼聚糖濃度的增加,包埋率也增高,當殼聚糖濃度大于1.5%時,包埋率顯著降低(P<0.05)?？赡苡捎?隨著殼聚糖濃度的增大,殼聚糖與海藻酸鈉結合越來越緊密,對包埋物質擴散的抑制作用增強[24],包埋率增加。繼續增大殼聚糖濃度,殼聚糖與海藻酸鈉所形成的結構致密程度較高,在微膠囊中的保加利亞乳桿菌活菌不易泄露出來,包埋產率呈下降的趨勢。因此殼聚糖濃度為1.5%較適宜。

圖4 殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of chitosan concentrationon the embedding rate of microcapsules

2.2.3 氯化鈣濃度對保加利亞乳桿菌微膠囊的影響 如圖5所示,在CaCl2濃度為3%、5%和8%微膠囊粒徑無顯著差異(P>0.05),但當CaCl2濃度小于2%時,隨著CaCl2濃度的升高,包埋率也增大,當CaCl2濃度為2%時,包埋率達到最大值。但隨著CaCl2濃度繼續升高,包埋率反而降低。分析原因可能是Ca2+含量增加時,體系中與壁材發生交聯反應的鈣離子相對越來越少,交聯反應有限[15],無法包埋更多的保加利亞乳桿菌,導致包埋率降低。因此將2%氯化鈣作為保加利亞乳桿菌微膠囊的最佳制備條件。

2.2.4 固化時間對保加利亞乳桿菌微膠囊的影響 由圖6中看出,微膠囊的包埋率隨固化時間的增加而逐漸增加,在固化時間為30～90 min時,包埋率顯著提高(P<0.05),到120 min包埋率達到最大,而后略降低。分析原因可能是固化時間為120 min時,已能夠使包埋壁材和菌液充分結合,延長時間氯化鈣使微膠囊的脆性增加,菌體釋放數減少,包埋率降低。因此,微膠囊呈先增加后減少的整體趨勢[1]。在固化時間為120 min時,微膠囊的包埋率最高,包埋率為78%,過長的固化時間會破壞復合壁材形成的網絡結構,微膠囊密度發生變化,保加利亞乳桿菌重新泄露到溶液中。在固化時間為90 min時,微膠囊的包埋率為72%,綜合試驗成本及節能等因素,將90 min作為保加利亞乳桿菌微膠囊的最佳固化時間。

2.3 正交試驗結果

以單因素實驗中獲得的最適條件為基礎,進行正交實驗,考察海藻酸鈉、殼聚糖、氯化鈣濃度和固化時間等參數對益生菌微膠囊包埋效果的影響,所得結果如表2所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

經正交試驗得出,A2B2C1D3組合的包埋率較高,達到78%,經檢驗A2B2C1D3的包埋率顯著高于其他組。因此,選擇A2B2C1D3組合的微膠囊做后續試驗。以包埋率為指標,則海藻酸鈉濃度為3%,殼聚糖濃度為1.5%,氯化鈣濃度為2%,固化時間為120 min,為制備微膠囊的最佳配方。

2.4 方差分析

由于實驗所設計的正交表各列均飽和,且因素固化時間的極差和偏差平方和明顯偏小,所以選用固化時間的偏差平方和作為誤差平方和,固化時間的偏差平方和對應的自由度作為誤差平方和的自由度。微膠囊方差分析如表3所示。方差分析結果顯示,殼聚糖濃度和海藻酸鈉濃度對保加利亞乳桿菌微膠囊包埋率的影響高度顯著,氯化鈣濃度和固化時間對微膠囊包埋率的影響不顯著。

表3 方差分析表 Table 3 Analysis of variance table

2.5 重復性試驗

為驗證工藝條件的可靠性,進行三次平行實驗。三次實驗保加利亞乳桿菌的存活率分別為78.9%、79.3%、78.7%,平均值為78.96%,與預測值較為接近,說明試驗能較好地反映微膠囊制備過程中的4個因素對于包埋率的影響,從而證明此實驗優化后的工藝條件是可靠的。

表4 微膠囊在模擬胃液中的存活情況Table 4 Survival of microcapsules in simulated gastric juice

2.6 微膠囊在模擬胃液中的存活率

未經包埋的保加利亞乳桿菌經模擬胃液處理后,活菌數從108CFU/g下降到0 CFU/g,120 min基本全部死亡,這是因為保加利亞乳桿菌對外界環境敏感,耐酸性能很差,胃液中的低酸環境使得未經處理的保加利亞乳桿菌難以存活。相比于未經包埋的保加利亞乳桿菌,復合包埋能夠顯著地提高益生菌在模擬胃液中的存活率(P<0.05)。經海藻酸鈉和殼聚糖包埋的保加利亞乳桿菌在經60 min的人工胃液處理后,活菌數能達到7.7×107CFU/mL,存活率達到78.6%,經過120 min的人工胃液處理后,活菌數能達到1.1×107CFU/mL,存活率達到11.2%。李寧[22]利用海藻酸鈉為壁材,對制備的益生菌微膠囊進行人工胃液處理,處理2 h后發現存活率達到12.5%,與本實驗結果基本一致。實驗表明,保加利亞乳桿菌經包埋后,對低pH的胃液的侵害有一定的抵抗力,耐胃酸效果較好。

2.7 微膠囊在模擬腸液中的釋放性

無論是經包埋的益生菌微膠囊還是未包埋的菌懸液,在30～150 min時,差異較顯著(P<0.05)。隨著微膠囊在人工腸液處理的時間延長,保加利亞乳桿菌微膠囊會連續的釋放,其在人工腸液處理中處理60 min之后,活菌數達到9 log CFU/g左右,與Meng等[25]的研究結果相一致,微膠囊在腸液中,由于陰離子的作用,微膠囊明顯膨脹,最終導致體系破裂,表明本研究的微膠囊腸液溶性較好;60 min之后,保加利亞乳桿菌就會被連續的釋放出來,它為微膠囊的益生作用奠定了基礎。

圖7 微膠囊在模擬腸液中的釋放情況Fig.7 Release of microcapsules in simulated intestinal fluid

2.8 微膠囊在食品中的儲藏穩定性

將保加利亞乳桿菌微膠囊與純牛奶按照1∶9的比例混合均勻,并將未包埋的保加利亞乳桿菌菌懸液作為對照,置于4 ℃條件下進行貯存,在相應的時間段對其進行活菌數測定,結果如圖8所示。隨著貯存時間的延長,無論是經包埋的益生菌微膠囊還是未包埋的菌懸液,活菌數都隨著貯存天數的延長而呈現下降的趨勢,而未包埋的菌懸液下降更快,存活率降低;而經包埋的益生菌菌體存活率較高,存活率下降不明顯,這是因為微膠囊在低溫條件下,包埋后菌體外有一層聚合物壁材作為物理屏障[26],益生菌環境會相對隔離外部不良環境,加強菌體的抵抗能力,儲藏21 d后活菌數依然可達到6.5 log CFU/g,說明益生菌微膠囊的貯存穩定性較好。

圖8 4 ℃條件下在純牛奶中的活菌數變化Fig.8 Changes of living bacteria in pure milk at 4 ℃

3 結論與討論

本研究通過包埋保加利亞乳桿菌,確定制備保加利亞乳桿菌微膠囊最佳條件為:海藻酸鈉濃度為3%,殼聚糖濃度為1.5%,氯化鈣濃度為2%,固化時間120 min,該微膠囊的包埋率最大為78.96%。微膠囊在pH2.0胃液酸性條件下60 min后活菌數為7.7×107CFU/mL,存活率達到78.6%,120 min后仍有菌體存活,相比于未經包埋的保加利亞乳桿菌,微膠囊技術顯著的提高了保加利亞乳桿菌在模擬胃液中的存活率(P<0.05)。經包埋的益生菌要起到較好的有益健康功能,就必須使益生菌微膠囊在腸道部位得到充分的破裂,使大量的益生菌被釋放進而定殖在腸道粘膜上[27]。因此所制備的益生菌微膠囊要有很好的腸溶性[28]。在模擬腸液中60 min可完全釋放,壁材具良好腸溶性。在4 ℃冷藏條件下儲存21 d后,微膠囊活菌數由8.5 log CFU/g下降到6.5 log CFU/g,僅下降2個數量級,儲藏期穩定性較好。本研究只探討了保加利亞乳桿菌微膠囊在4 ℃條件下的儲藏穩定性,可以在以后的研究中將其加入到不同食品中,考察它們在不同食品中的儲藏穩定性。本研究制備的保加利亞乳桿菌微膠囊能夠有效地保護菌體抵御外界不利因素,提高實際菌體存活率,同時也提供了一種新型有效的補充腸道益生菌的形式,提升了保加利亞乳桿菌的應用價值。國內在對微膠囊制備工藝進行研究的過程中,并沒有將固化時間作為一個重要因素進行專門考察,而本實驗則考察了不同固化時間對于微膠囊中保加利亞乳桿菌活菌數的影響,發現固化時間為120 min,可使包埋的活菌數達到最大值。

可以利用誘變或基因工程方法篩選出高抗性的菌株,在熱、有氧等環境中去提高保加利亞乳桿菌的活性,本研究制備的保加利亞乳桿菌復合微膠囊形態和產率較好,但僅限體外,進一步拓展益生菌微膠囊的應用范圍,如進行動物試驗,藥理學及毒理學試驗等,為益生菌微膠囊在食品工業中的應用奠定基礎。