烏飯果花色苷復合酶法提取工藝優化及其抗氧化活性

康彬彬,劉龍燕,王 祥,丁力杰,林河通,陳團偉,*

(1.福建生物工程職業技術學院,福建福州 350007;2.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

花色苷(anthocyanin)是花青素與糖基通過糖苷鍵結合而成的具有2-苯基苯并吡喃陽離子結構的多酚類化合物,廣泛存在于植物細胞內,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抑菌等多種生理功能[1-4],已成為功能性食品、化妝品以及藥品等開發利用中的一類重要功能因子。烏飯果為越橘屬(Vaccinium)野生植物烏飯樹(VacciniumbracteatumThunb.)的紫黑色球狀漿果,10～11月成熟,富含氨基酸、礦物質、花色苷、黃酮等營養功能成分[5],在民間,特別是我國畬族地區對烏飯果的利用較早,除直接食用外,主要利用烏飯果和烏飯葉的汁液對大米進行染色和烹調制作“烏米飯”[6],而對烏飯果花色苷功能成分的提取和生理活性研究較為缺乏。

當前,溶劑法以其簡單、易操作、成本低等特點被廣泛應用于花色苷的提取,但由于花色苷存在于纖維素、果膠構成的細胞壁內,導致提取時間長、花色苷得率低[7]。為了提高花色苷的得率,國內外學者多采用超聲波[8]、微波[9]、超高壓[10]、酶[11]等輔助提取花色苷,能有效縮短提取時間,提高提取效率,其中,酶法輔助提取以其高效、環保、高得率等優點已成為植物花色苷提取的有效手段,李穎暢等[11-15]先后開展了纖維素酶或果膠酶提取藍莓果、紫薯、紫山藥、紫皮豇豆、黑米中花色苷的工藝研究,結果表明酶輔助提取能顯著提高花色苷得率,但有關復合酶法提取烏飯果花色苷方面的研究目前暫未見報道。因此,本文以乙醇為提取溶劑,通過響應曲面法優化烏飯果花色苷的復合酶法提取工藝,并分析評價烏飯果花色苷的體外抗氧化活性,旨在為烏飯果花色苷活性成分的高效提取及其進一步開發利用提供科學依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生烏飯果 采自福建省福鼎市貫嶺鄉,采收當天運至福州實驗室,經清洗、真空干燥(60 ℃、0.1 Mpa)至含水率<10%后粉碎過40目篩,粉體置于棕色瓶中密封備用;纖維素酶 15000 U·g-1,國藥集團化學試劑有限公司;果膠酶 1000 U·g-1,瑞士Fluka公司;大豆卵磷脂(98%) 上海研謹生物科技有限公司;抗壞血酸 阿拉丁試劑(上海)有限公司;過氧化氫、乙醇、鹽酸、鄰苯三酚等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DS-1型高速組織搗碎機 上海精密儀器儀表有限公司;D2F-6050型真空干燥設備、PB-10 pH計、DK-S26型數顯電熱恒溫水浴鍋 上海精宏試驗設備有限公司;BS-124S電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;UV-2000紫外可見分光光度儀 尤尼柯(上海)儀器有限公司;SK-1快速混勻器 常州國華電器有限公司;H2050R冷凍離心機 長沙湘儀離心機設備有限公司;FDU-1200 冷凍干燥機 日本東京 EYELA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗 準確稱取烏飯果粉末1.000 g加入錐形瓶中,以50%乙醇為提取溶劑,選取加酶量、復配比、酶解溫度、酶解時間、初始pH、料液比等進行復合酶法提取單因素實驗,酶解液經90 ℃滅酶10 min,1000 r/min離心10 min,收集上清液,定容至15 mL,535 nm下紫外-可見分光光度測定其吸光值,考察不同提取條件對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.1 加酶量對烏飯果花色苷含量的影響 在酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5,纖維素酶:果膠酶1∶1下,研究加酶量(30、50、100、150、200、250、300 U·g-1原料)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.2 酶配比對烏飯果花色苷含量的影響 在酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5,加酶量100 U·g-1原料下,研究纖維素酶:果膠酶酶配比(5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.3 酶解溫度對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5下,研究酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.4 酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,料液比1∶10 g·mL-1,初始pH4.5下,研究酶解時間(60、90、120、150、180、210、240、270 min)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.5 酶解pH對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,料液比1∶10 g·mL-1下,加入磷酸鹽緩沖液調節pH,研究不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.1.6 料液比對烏飯果花色苷含量的影響 在纖維素酶∶果膠酶2∶1,加酶量100 U·g-1原料,酶解溫度50 ℃,酶解時間120 min,初始pH4.5下,研究不同料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40 g·mL-1)對烏飯果花色苷含量的影響。

1.2.2 響應面優化試驗 在單因素實驗基礎上,選取纖維素酶∶果膠酶配比2∶1,pH4.0,料液比1∶30 g·mL-1條件下,以加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)為響應變量,花色苷含量(mg·100 g-1)為響應值,通過響應曲面法優化烏飯果花色苷的復合酶法提取工藝條件。因素編碼及各響應變量水平見表1。

表1 二次回歸正交旋轉組合設計因素水平表Table 1 Factors and levels of quadricregression orthogonal rotary tests

1.2.3 花色苷含量的測定 基于花色苷在波長535 nm處有最大吸收峰[15-17],參照Wu等[17]的Fuleki法測定烏飯果花色苷提取液在535 nm處的吸光值A535,并按照式(1)計算烏飯果花色苷含量。

式(1)

式中,C-烏飯果花色苷含量,mg·100 g-1;A535-535 nm處吸光值;V-定容后體積,mL;N-稀釋倍數;98.2-1%花色苷在535 nm處的平均消光系數;m-烏飯果粉末質量,g。

1.2.4 烏飯果花色苷體外抗氧化活性的測定

1.2.4.1 烏飯果花色苷的制備 將上述最佳工藝條件下制備的烏飯果花色苷酶解液,經1000 r/min離心15 min,收集上清液于40 ℃下減壓蒸發去除乙醇后冷凍干燥,制得凍干粉。準確稱取一定量烏飯果花色苷凍干粉,用1.5 mol/L鹽酸-95%乙醇(v/v,15/85)配制成不同質量濃度的烏飯果花色苷樣品溶液。

1.2.4.2 羥自由基(·OH)清除能力的測定 參考李穎暢等[18]的水楊酸-Fe2+氧化法測定花色苷提取液在510 nm處的吸光值,并按照式(2)計算·OH清除率。同時以同質量濃度抗壞血酸(10、20、40、60、80、100、120、140、160 μg·mL-1)為陽性對照。

·OH清除率/%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

式(2)

式中,A0-1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液的吸光值;A1-1.0 mL樣品溶液的吸光值;A2-1.0 mL蒸餾水代替H2O2溶液的吸光值。

式(3)

式中,A0-蒸餾水代替樣品溶液的吸光值;A1-樣品溶液的吸光值。

1.2.4.4 抗脂質過氧化能力的測定 根據李穎暢等[18]的方法,并略作修改。分別于試管中依次加入1.0 mL大豆卵磷脂溶液,1.0 mL 0.4 mmol/L FeSO4和1.0 mL不同濃度的樣品溶液(100、200、400、600、800、1000 μg·mL-1),混勻,于37 ℃水浴下避光保存60 min,再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl混合液,90～100 ℃水浴15 min后迅速冷卻,3000 r/min離心10 min,取上清液在535 nm處測定吸光值As。空白管以蒸餾水代替樣品,測定其吸光值Ac。參比管以1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL卵磷脂,并按照式(4)計算脂質過氧化抑制率。同時以同質量濃度抗壞血酸為陽性對照。

脂質過氧化抑制率(%)=(Ac-As)/Ac×100

式(4)

式中,Ac-空白液的吸光值;As-樣品溶液的吸光值。

1.3 數據處理

以上指標均重復取樣測定3次,采用DPS V12.01軟件對實驗數據進行統計分析,P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。采用Excel 2007和Origin 8.5軟件進行數據處理分析及圖形制作。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 加酶量對烏飯果花色苷含量的影響 從圖1A可以看出,烏飯果花色苷含量隨加酶量的增加呈現先升高后下降的趨勢(P<0.05),這可能是由于加酶量較低時酶解破壁不完全,細胞內花色苷未能完全釋放,導致花色苷含量較低,而加酶量過大,酶可能發生相互附著,從而降低酶與底物的傳質效率,影響酶解速率,導致花色苷含量下降[13]。因此,確定復合酶的最佳加酶量為100 U·g-1。

2.1.2 不同配比對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1B可知,纖維素酶∶果膠酶為2∶1時,烏飯果花色苷的提取量達到最大,含量為126.56 mg·100 g-1,而在纖維素酶或果膠酶含量過大時,花色苷含量有所下降。因此,確定纖維素酶和果膠酶的配比為2∶1。

2.1.3 酶解溫度對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1C可知,酶解溫度對烏飯果花色苷含量影響顯著(P<0.05),隨著酶解溫度的升高,由于底物分子適度展開且動能增加,加快了酶解反應速度,花色苷含量增加,但當溫度超過50 ℃后,酶可能因為部分失活變性導致酶解反應受到抑制,花色苷含量反而下降[11]。因此,選取40 ℃為較佳酶解溫度,此時花色苷含量為127.08 mg·100 g-1。

2.1.4 酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響 在60～120 min酶解時間內,隨著酶解時間的延長,酶解反應較充分(P<0.05),有利于細胞內花色苷的溶出,但酶解時間過長可能引起酶活力降低,同時花色苷由于長時間酶解發生部分降解,導致花色苷含量下降(圖1D)。因此,確定該復合酶體系的最適酶解時間為120 min。

2.1.5 pH對烏飯果花色苷含量的影響 酶活力高低及花色苷穩定性與酶解體系的pH密切相關,由圖1E可以看出,烏飯果花色苷含量隨pH上升呈先上升后下降的趨勢(P<0.05),這可能與纖維素酶和果膠酶活性發揮的最適pH有關[20],且相關研究表明花色苷在酸性條件下較為穩定[14]。因此,選擇pH4.0作為本試驗復合酶解的最適pH,此pH下烏飯果花色苷含量最高,達130.33 mg·100 g-1。

2.1.6 料液比對烏飯果花色苷含量的影響 由圖1F可以看出,烏飯果花色苷含量隨料液比的增大而增加(P<0.05),而后趨于平穩。當料液比為1∶30 g·mL-1時,花色苷含量為133.76 mg·100 g-1,而繼續增加到1∶40 g·mL-1時,花色苷含量僅提高1.14%與1∶30 g·mL-1時相比,差異不顯著(P>0.05)。這可能是因為在一定的加酶量下,提取溶劑的增加有利于烏飯果細胞內花色苷的擴散和釋放[12]。因此,從效率和經濟因素考慮,料液比以1∶30 g·mL-1為宜。

圖1 各單因素對烏飯果花色苷含量的影響Fig.1 Effects of different extraction parameters on the contents of anthocyanin from Vaccinium bracteatum Thunb. fruits注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 烏飯果花色苷復合酶法提取工藝的優化

2.2.1 響應曲面試驗結果 在單因素試驗的基礎上,以花色苷含量為指標,采用二次回歸正交旋轉組合設計對烏飯果花色苷復合酶解工藝進行優化,試驗結果見表2。

為了更明確各因素加酶量X1、酶解溫度X2和酶解時間X3對花色苷含量的影響,采用DPS V12.01數據處理軟件對表2中數據進行多元回歸分析和擬合,得到如下回歸數學模型:

表2 二次回歸正交旋轉組合設計試驗及結果Table 2 Results of quadric regression orthogonal rotary tests

方差分析結果表明(表3),加酶量、酶解溫度和酶解時間對烏飯果花色苷含量的影響達極顯著水平(P<0.01),各因素的主次順序為:加酶量>酶解時間>酶解溫度。此外,加酶量、酶解溫度和酶解時間等因素的二次項對花色苷含量的影響也達極顯著(P<0.01)。

表3 方差分析 Table 3 Variance analysis

2.2.2 響應面分析與工藝優化 加酶量(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)對花色苷含量(Y)的響應面分析結果如圖2所示。由圖2A可知,響應曲面較為陡峭,表明花色苷含量對酶解溫度和加酶量的改變較為敏感。當加酶量一定時,花色苷含量隨酶解溫度的增加,先增大后快速下降,保持酶解溫度一定時,花色苷含量隨加酶量增加也呈先增大后減小,且酶解溫度較加酶量對花色苷含量的影響顯著,等高線成橢圓形,表明酶解溫度與加酶量具有較強的交互作用;從圖2B可以看出,響應曲面較為平緩,表明花色苷含量受酶解時間和加酶量的交互作用。當加酶量一定時,花色苷含量隨酶解時間的延長,先增大后下降,保持酶解時間一定時,花色苷含量隨加酶量的增大也呈先增大后減小的趨勢,等高線呈扁圓形,表明酶解時間和加酶量具有一定的交互作用,但不顯著;由圖2C可知,響應曲面陡峭,表明花色苷含量對酶解溫度和酶解時間的改變較為敏感。當酶解溫度一定時,花色苷含量隨酶解時間的延長,先增大后下降,保持酶解時間一定時,花色苷含量隨酶解溫度增大呈先增大后減小,說明酶解溫度過高和酶解時間過長均不利于花色苷的提取,等高線呈橢圓形,表明酶解時間和酶解溫度具有較強的交互作用。因此,綜合表3及圖2,通過DPS12.01數據處理軟件分析,確定出烏飯果花色苷的復合酶法提取最佳工藝條件為:加酶量234 U·g-1,纖維素酶∶果膠酶2∶1,pH4.0,料液比1∶30 g·mL-1,酶解溫度50 ℃,酶解時間180 min,該條件下烏飯果花色苷含量為137.61 mg·100 g-1。進一步的驗證試驗得花色苷含量(136.08±4.49) mg·100 g-1,與預測值接近(RSD為1.12%),這一結果表明響應面法優化烏飯果花色苷的復合酶法提取工藝是可靠的。

圖2 雙因素效應分析圖Fig.2 Analysis of double factor effect

2.3 烏飯果花色苷的體外抗氧化活性

2.3.1 烏飯果花色苷對·OH的清除能力 羥自由基(·OH)是引起生物體內蛋白質、核酸、脂質等生命大分子物質發生氧化和損傷的一類重要活性氧自由基[21]。由圖3可知,烏飯果花色苷具有較強的·OH清除能力,且隨質量濃度增加而增大,但清除率顯著低于抗壞血酸組(P<0.01)。通過計算半抑制濃度IC50(清除率或抑制率達到50%時所需樣品的質量濃度)發現,烏飯果花色苷與抗壞血酸的IC50分別為92.23和73.98 μg·mL-1,表明烏飯果花色苷清除·OH的能力弱于抗壞血酸。

圖3 烏飯果花色苷與抗壞血酸對·OH清除能力的比較Fig.3 Comparision of scavenging effect ofhydroxyl radicals between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid注:*和**分別表示同濃度下烏飯果花色苷與抗壞血酸抗氧化活性差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01);圖4～圖5同。

圖4 烏飯果花色苷與抗壞血酸對清除能力的比較Fig.4 Comparision of scavenging effectsuperoxidefree radicals between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid

2.3.3 烏飯果花色苷對脂質過氧化的抑制能力 細胞膜磷脂是活性自由基進攻的主要靶物質,其被氧化造成細胞膜系統破壞,從而引起細胞損傷和壞死,危害人機體組織[18]。烏飯果花色苷對大豆卵磷脂過氧化抑制能力的影響如圖5所示。由圖可見,烏飯果花色苷對由Fe2+引發的卵磷脂脂質體具有明顯的抑制作用,其抑制率隨樣品濃度的增加而增大,當濃度為400 μg·mL-1時,其對脂質體過氧化的抑制率為61.15%,而抗壞血酸為52.83%。烏飯果花色苷抑制脂質體過氧化的IC50為303.1 μg·mL-1,抗壞血酸為366.2 μg·mL-1,說明烏飯果花色苷對脂質體過氧化的抑制能力強于抗壞血酸(P<0.05)。

圖5 烏飯果花色苷與抗壞血酸對脂質體過氧化抑制能力的比較Fig.5 Comparision of inhibition effect of lipidper-oxidation between anthocyanin fromVaccinium bracteatum Thunb. fruits and ascorbic acid

3 結論