銅綠假單胞菌LAMP快速檢測方法建立及微滴數字PCR驗證

李羽翡,祖 新,李羽翠,張德榮

(1.甘肅省食品檢驗研究院,甘肅蘭州 730030;2.甘肅省中醫院,甘肅蘭州 730050;3.西北民族大學生物醫學研究中心,甘肅蘭州 730030)

銅綠假單胞菌,又稱綠膿桿菌,是一種人獸共患性常見致病菌,廣泛存在于土壤、水和空氣以及人的皮膚、腸道、呼吸道中,屬于機會性致病菌,其所產生的各種內毒素、致死性外毒素能廣泛侵襲機體各個臟器、組織,引起各種病變和炎癥。GB 19298-2014《食品安全國家標準 包裝飲用水》,首次將其納入了食品檢驗的范圍,明確指出銅綠假單胞菌不得檢出。GB 8538-2016《食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法》也將銅綠假單胞菌列為致病菌,近兩年甘肅省承擔的國家監督抽查和地方日常監督、風險監測任務結果顯示,瓶/桶裝飲用水銅綠假單胞菌檢出率高達30%。果汁飲品,尤其是未經過高溫滅菌的餐飲鮮榨果汁飲品,近年來消費量日益增高,其受到銅綠假單胞菌污染的機率也明顯增大。目前,微生物發酵法及PCR技術已廣泛應用于銅綠假單胞菌的篩查和檢測中,但傳統微生物發酵法檢測銅綠假單胞菌,檢驗周期長,且對場所、設備設施要求較高;PCR法需要電泳處理或實時熒光定量檢測設備,這些均不利于推廣及大批量篩查,也不能應用于餐飲環節及銷售現場。因此開發一種高效、便捷、靈敏的銅綠假單胞菌快速識別方法很有必要。

環介導等溫擴增技術(LAMP)是近年來發展迅速的一種新型基因擴增方法,其原理是利用特異識別靶序列上6個位點的4條(或6條)引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶,在等溫條件下進行核酸擴增[1]。與傳統核酸檢測技術相比,其操作簡便、只需要一種酶,擴增效率高,反應產物量大,適合簡易性檢測[2],近年來被廣泛應用于食源性致病菌檢測[3-5]、食品轉基因成分檢測[6-7]、食品過敏原成分檢測[8-9]、動物源性成分檢測[10-12]及微流控芯片領域[13]。

微滴式數字PCR是近年來發展起來的、優于實時熒光定量PCR的第三代PCR技術[14-16],在病源微生物的檢測及鑒定方面應用廣泛。其原理是在PCR擴增前將待測樣品核酸隨機分配至微反應器或微滴中,每個微反應器或微滴都是一個獨立的PCR反應器,理論上認為每個微反應器中含有一個待測的核酸靶分子,或不含核酸靶分子,有熒光信號響應的判定為“1”,沒有熒光信號響應的判定為“0”,最后根據泊松分布原理和陽性微滴比例,計算出樣品中靶序列的拷貝數或濃度,從而實現無需依賴標準曲線的絕對定量檢測[17-19]。該技術耗時短、靈敏度高、特異性強,近年來被廣泛應用于病毒、細菌、轉基因成分、動植物源性成分檢測等研究領域[20-22]。

本文基于環介導等溫擴增原理,建立一種銅綠假單胞菌等溫擴增PCR檢測方法,并利用微滴數字PCR技術,對建立的快速檢測方法進行方法驗證,考察了該快速檢驗方法的準確度與靈敏性,以期為銅綠假單胞菌的檢測提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

銅綠假單胞菌(ATCC15442) 廣東微生物菌種保藏中心;細菌基因組DNA快速提取試劑盒 卓誠惠生;數字PCR配套試劑盒(ddPCR Supermix for Probes) Bio-Rad;營養肉湯(成分:蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、葡萄糖) 北京陸橋;環介導等溫擴增用鈣黃綠素熒光染料、噬菌體DNA片斷重組質粒、噬菌體擴增引物等 榮研生物科技有限公司;沙門氏菌標準菌株(ATCC14028) 廣東微生物研究所;果汁飲品樣品 2018.7～2019.7間,采集蘭州地區市售飲料飲品共計128份,其中餐飲現制現賣鮮榨果汁飲品58份,超市商店預包裝果汁飲品70份。

Nano Drop one超微量分光光度計 Thermo;QX200 Droplet Generator微滴生成儀 Bio-Rad;PX1 PCR PlateSealer快速封膜儀 Bio-Rad;88880028振蕩恒溫金屬浴、LP Vortex Mixer渦旋混合器、MEGAFUGE 8臺式冷凍離心機、900series超低溫保存箱 Thermo;mini-10k微型迷你離心機 廣州迪奧;SIM-F140ADL制冰機 Panasonic;移液槍1～1000 μL Eppendorf;LabcultureB2生物安全柜 ESCO;醫用冷藏冷凍箱HYCD-282 Haier;Simplicity uv超純水儀 默克密理博。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板制備 菌種DNA模板制備:將-80 ℃保存的甘油菌株凍存管復蘇,并接種于營養瓊脂平皿,36 ℃過夜培養,挑單顆菌落36 ℃繼續純培養,使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取病原菌DNA,凍存于-20 ℃備用。果汁飲品DNA模板制備:將果汁飲品分別無菌取樣25 mL,加入225 mL營養肉湯培養基,36 ℃培養24 h,取增菌液1 mL提取DNA,使用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取病原菌DNA,凍存于-20 ℃備用。

1.2.2 引物探針設計合成 從GenBank數據庫中查找銅綠假單胞菌的基因組序列,以銅綠假單胞菌rpod基因為模板,利用PrimerExplorer軟件設計LAMP引物,確保引物探針之間不能形成局部配對的可能,并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本實驗分別設計訂購了3種引物,經驗證,引物3沒有引物二聚體及假陽性現象且反應時間短,最終確定引物3為實驗引物,引物1和2不滿足需要,舍棄不用。引物3序列見表1。

表1 銅綠假單胞菌LAMP設計引物Table 1 Primer sequence for Pseudomonas aeruginosa LAMP

1.2.3 恒溫PCR反應 查閱相關文獻[23-27],調整試劑濃度、比例,得到最終反應體系見表2。在60 ℃條件下恒溫反應40 min,每隔10 min記錄反應結果。以噬菌體DNA片斷重組質粒作為反應體系的陽性對照、陰性對照,以樣品提取細菌DNA為模板,按實驗步驟進行恒溫PCR實驗操作,并以無菌去離子水為作為空白對照。實驗整個反應體系總體積為25 μL,各組分含量設置如下:

表2 環介導等溫擴增反應體系Table 2 Amplification reaction system of LAMP

1.2.4 微滴式數字PCR驗證實驗 利用數字PCR對核酸DNA進行定性和定量驗證。將濃度為1.5×106CFU/mL的銅綠假單胞標準菌菌懸液用生理鹽水逐級10倍稀釋,得到濃度為1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×10 CFU/mL的菌懸液;提取菌體DNA作為對照標品,使用超微量分光光度計測定模板DNA濃度,分別為100、10、1 ng/μL,100、10 pg/μL;以果汁飲品樣品提取核酸DNA為檢測樣品(包括2個具有顯色變化的可疑陽性樣品),以沙門氏菌標準菌提取DNA為樣品對照,超純水為空白對照,分別進行ddPCR。20 μL反應體系:2×ddPCR Supermix for Probe(no dUTP)10 μL,上下游引物各0.4 μL,探針0.4 μL,DNA模板4 μL,剩余用ddH2O補足[28-30]。

采用微滴生成儀對配制好的PCR反應體系進行微滴生成,每次可同時進行8個樣品,耗時約2 min。將微滴生成儀器中生成好的微滴轉移至96孔板中,鋁箔蓋住放入Bio-Rad PX1 PCR PlateSealer進行快速封膜。封膜溫度180 ℃,5 s。將密封好的96孔板置于PCR儀上進行PCR擴增。反應程序為:95 ℃,30 s,預變性,然后進行循環反應:94 ℃,30 s(變性);60 ℃,60 s(退火、延伸、數據采集);共40個循環[31-33]。

PCR擴增完成后,將96孔板轉入一起配套的plate hoder中組裝好,平穩地放入微滴讀取儀,打開QX200 Droplet Reader進行PCR定量。數字PCR檢測的陽性、陰性微滴采用泊松分布原理,檢測結果用Quanta Soft軟件分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

LAMP技術本身的引物設計比較復雜,要針對特定靶序列上的6～8個片段設計4～6條引物,由于這6條引物均要規避突變點區域,因此對靶序列的要求高,引物設計比較復雜。但是只要設計好引物、在酶作用下就可以進行恒溫擴增,對溫度控制儀器沒有過高要求。本研究在反應體系中加入鈣黃綠素熒光染料,通過顏色變化來判定LAMP技術檢測銅綠假單胞菌rpod基因。

本文使用合成的3種引物進行環介導等溫擴增,觀察實驗反應結果。如圖1所示,1、2、3號引物擴增銅綠假單胞菌DNA模板全部顯色。4、5、6號孔空白擴增未添加DNA,不應該顯色,但4號孔卻顯色了,推測在引物1后續實驗中出現了引物二聚體,造成假陽性結果。7～8號孔用來檢測PCR反應體系是否正確,PCR體系是否被污染,陽性孔在30 min時出現顏色變化,陰性孔整個反應過程均未出現顏色變化,反應體系正常。反應過程中引物1與引物3(1孔、3孔)顯色變化需要20 min,反應中引物2(2孔)沒有LoopF序列,所以反應時間較長,顯色變化需要38 min。相關研究顯示[23-25],LAMP的關鍵在于多引物之間無交叉反應且能成環,添加環引物能提高擴增效率,縮短三分之二的擴增時間。綜合考慮,引物3出現顏色變化僅需要20 min,且顯色反應靈敏,最終選用引物3為方法用引物。

圖1 3組設計引物銅綠假單胞菌LAMP擴增顯色結果Fig.1 LAMP amplification color results ofPseudomonas aeruginosa by 3 groups of primer注:1、2、3號孔分別為引物1、2、3擴增樣品,模板為實驗室自己提取的銅綠假單胞標準菌株DNA;4、5、6號孔分別為空白擴增,模板為去離子水;7號孔為陽性擴增,模板為噬菌體DNA片斷重組質粒;8號孔為陰性擴增,不添加噬菌體DNA片斷重組質粒。

2.2 樣品顯色結果

以引物3為實驗引物,測試果汁飲品共計128份樣品,發現1號樣品、10號樣品顯色,其余126個樣品均未顯色,圖2僅展示包含2個顯色樣品的同批次處理的13個樣品。

圖2 樣品銅綠假單胞菌LAMP擴增顯色結果示例Fig.2 LAMP amplification color results ofPseudomonas aeruginosa in samples注:1～13分別為1～13號鮮榨果汁飲品。

2.3 樣品數字PCR定量驗證

將銅綠假單胞標準菌、沙門氏菌標準菌對照以及空白分別做數字PCR擴增,如圖3所示,通過微滴生成,每個樣品至少生成了11000個微滴(前列陽性微滴數與后列陰性微滴數的總和),符合數字PCR反應體系生成微滴數大于10000,才可用于正常定量的要求[34-35]。本實驗方法對銅綠假單胞菌有明顯陰性微滴峰和陽性微滴峰。對沙門氏菌及空白對照只有陰性微滴的單峰,陽性微滴數均為0。說明本次數字PCR反應體系對銅綠假單胞菌具有特異性選擇,對沙門氏菌及空白無熒光信號響應。

圖3 數字PCR方法特異性驗證Fig.3 Specific verification results diagram of ddPCR注:橫坐標P.aeruginosa列均為銅綠假單胞標準菌,每兩列為一個樣品(前列為陽性微滴數,后列為陰性微滴數),每個樣品做兩個平行,樣品標準菌濃度分別是1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103 CFU/mL,Salmonella列為沙門氏菌1.5×106 CFU/mL,blank列為空白,縱坐標為數字PCR響應微滴數。

圖4為銅綠假單胞標準菌株不同濃度梯度的微滴信號響應圖,閾值線上方為陽性微滴,閾值線下方為陰性微滴。初濃度1.5×106CFU/mL的銅綠假單胞標準菌以10倍比稀釋,進行數字PCR擴增。如圖所示,10倍梯度稀釋的菌株陽性微滴信號響應值也呈梯度下降,當標準菌株濃度低于1.5×103CFU/mL時,按樣品提取步驟提取的細菌模板DNA數字PCR檢測不到。表明所建立的ddPCR方法對銅綠假單胞菌具有好的選擇敏感性[36-37]。

圖4 ddPCR檢測敏感性驗證Fig.4 Sensitivity test of droplet digitalPCR detecting Pseudomonas aeruginosa注:圖中不同縱列代表不同濃度銅綠假單胞標準菌,G04、H04濃度是1.5×106 CFU/mL,B05、C05濃度是1.5×105 CFU/mL,G05、F05濃度是1.5×104CFU/mL,C06、D06濃度是1.5×103 CFU/mL,縱坐標為陽性、陰性微滴信號值。

圖5為不同樣品的數字PCR檢測結果,如圖所示,濃度1.5×106CFU/mL的銅綠假單胞菌數字PCR檢測結果為2258、2237 copies/μL,平均值為2248 copies/μL,由于標準菌與樣品DNA處理流程一致,即25 mL定容至250 mL,故稀釋了10倍,所以實際應該是濃度1.5×105CFU/mL,對應copy數2248 copies/μL,以此類推,則濃度1.5×102CFU/mL銅綠假單胞菌數字PCR檢測平行結果為2.1和2.9 copies/μL。

圖5 樣品ddPCR檢測結果Fig.5 The concentration quantitative ofsample by droplet digital PCR注:該圖顯示樣品數字PCR定量拷貝數,P.aeruginosa列均為銅綠假單胞標準菌樣品,每個樣品做兩個平行,標準菌樣品濃度分別是1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103 CFU/mL,Salmonella列為沙門氏菌1.5×106 CFU/mL,blank列為空白,sample列分別是1號果汁樣品和10號果汁樣品。

表3是數字PCR靈敏度、特異性測試,標準差分別為0.57、0.71、4.24、14.8,相應的RSD值在0.66%～22.8%之間,符合均小于25%的要求[38-40]。

表3 數字PCR特異性、敏感性數據Table 3 The specificity and sensitivity of ddPCR

圖6顯示,以銅綠假單胞菌菌懸液濃度為橫坐標,以檢測濃度copy數為縱坐標作圖,由于數字PCR反應體系為20 μL,模板添加量為4 μL,故不同濃度菌懸液對應的平均copy值應該為分別為12.5、115、1080、11240 copies/μL,生成標準曲線y=0.07497x-9.3516,線性關系良好,R2=0.9999。

圖6 ddPCR拷貝數與菌懸液濃度的線性關系Fig.6 Standard curve for copies of ddPCR and suspensionconcentration of Pseudomonas aeruginosa

表4顯示LAMP快速檢測方法顯色的兩個陽性樣品,數字PCR檢測值分別為1219、7.8 copies/μL,通過計算知兩個樣品銅綠假單胞菌的檢測濃度分別為1.64×104、2.29×102CFU/mL。

表4 樣品數字PCR定量結果Table 4 Quantitative verification of sample by ddPCR

3 討論與結論

本實驗建立了一種快速識別檢測銅綠假單胞菌的LAMP檢測方法,該方法操作快捷,從細菌核酸提取到檢測判定只需100 min,設備要求僅為60 ℃恒溫鍋,與GB 8538-2016傳統發酵法相比時間大大縮減,傳統發酵法從過濾、增菌培養、生化鑒定等完成需要48 h以上[41];與熒光定量PCR相比,儀器設備要求低,成本更低,具有實際應用價值,可有效地在餐飲制備現場、產品銷售場所進行銅綠假單胞菌的污染監測及推廣應用。使用該LAMP快速檢測方法共檢測果汁飲品128份,126份未顯色,2份顯色。

由于LAMP快速檢測方法通過肉眼識別進行判斷,不能直觀地對方法的特異性、靈敏度、檢出限進行評價。因此采用數字PCR定量手段,完成了方法定量評價工作。數字PCR定量檢測以銅綠假單胞菌懸液濃度為橫坐標,以copy數為縱坐標,生成標準曲線y=0.07497x-9.3516,線性關系良好,R2=0.9999,銅綠假單胞菌檢測范圍1.5×102～1.5×105CFU/mL;方法靈敏度高、特異性強,標準差分別為0.57、0.71、4.24、14.8,RSD值在0.66%～22.8%之間。

對LAMP檢測方法檢測的58份鮮榨果汁飲品樣品(包含2個呈現綠色熒光的顯色樣品)進行數字PCR定量驗證,陽性結果與LAMP顯色一致,并且沙門氏菌及空白均未成功擴增。說明該LAMP方法具有銅綠假單胞菌特異識別性。LAMP方法肉眼可見的顯色樣品,數字PCR定量結果下限為7.8 copies/μL,對應菌體濃度為2.29×102CFU/mL。

近年來關于LAMP方法研究食品中銅綠假單胞菌分析的文獻并不多,且都是直接提取銅綠假單胞菌標準菌DNA來定最低檢出限,特異性和靈敏度測試均以凝膠電泳為檢測手段。李軻等[26]建立了紡織品中銅綠假單胞菌快速檢測方法,銅綠假單胞菌靈敏度為4.5 CFU/mL,但模板提取使用了商品化免疫磁珠進行富集。文霞等[27]檢測化妝品中銅綠假單胞菌靈敏度為62.5 pg/L,陽性樣品檢出限為1×102CFU/mL。劉偉等[23]檢測36株銅綠假單胞菌標準菌株,靈敏度達到2.2～3.5 CFU/100 g。姜麗麗等[25]檢測醫院臨床樣品水貂綠膿桿菌,標準菌株靈敏度為1 ng/μL,陽性樣品檢出限為1.67×102CFU/mL。本方法檢測食品中銅綠假單胞菌靈敏度為1 ng/μL,陽性樣品檢出限為1.5×102CFU/mL。且食品較其他樣品,基質復雜,干擾性強,因此綜合判定,本方法成本低、耗時短、靈敏度高,檢出限低,益于推廣應用。