基于代謝組學方法研究銀耳多糖對非酒精性脂肪肝大鼠的干預作用

張 艷,王 爽,李永哲,劉 奔,宋 爽

(1.吉林化工學院化學與制藥工程學院,吉林吉林 132022;2.吉林化工學院研究生院,吉林吉林 132022;3.吉林石化電石廠,吉林吉林 132022)

高血脂又稱脂質代謝異常,主要是指血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)或血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)水平過高和/或血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)水平過低,是常見的代謝性疾病[1]。研究發現,高脂飲食引起的脂質代謝異常伴有肝臟脂肪變性(被稱為非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD))的病變過程,嚴重的NAFLD很容易發展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等疾病[2-3],因此控制血脂可在一定程度上有效預防NAFLD?，F今,他汀類、貝特類等化學藥物是治療高血脂類疾病的常規藥物,雖然這些化學藥物療效顯著,但副作用明顯,易導致如肌痛、橫紋肌溶解癥和肝功能異常等問題[4]。因此,開發天然的降脂保肝功能性食品的需求日益增加。

銀耳(Tremella)屬于真菌類銀耳科銀耳屬,是門擔子菌門真菌銀耳的子實體,作為綠色食品的典型代表,具有較高的營養價值、巨大的經濟價值與開發潛力[5]。銀耳多糖是銀耳中重要的活性物質,現代研究表明,銀耳多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降糖及免疫調節等多種作用[6-8],然而銀耳多糖對NAFLD的干預作用和機制研究卻鮮有報道。

代謝組學是一種快速對生物體內所有低分子量代謝產物進行定性、定量分析,并尋找代謝物與生理變化相對關系的學科,是系統生物學的重要組成部分[9-10]。近年來,代謝組學在食品、營養科學和中醫藥領域的應用越來越廣泛,為以天然產物為基礎開發的功能性食品作用機制及其理論研究提供了強有力的現代化研究手段。本文借助于氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技術分析NAFLD模型大鼠肝組織小分子代謝物,并通過主成分分析(principal components analysis,PCA)和正交信號校正偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)模式結合代謝組網絡數據庫,尋找銀耳多糖干預NAFLD大鼠肝勻漿的生物標志物及作用的代謝通路,為開發銀耳多糖降脂保肝功能性食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar雄性大鼠30只 體質量(200±20) g,動物許可證號:SCXK(吉)2017-0001,購自吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心,實驗過程中遵循《實驗動物的護理和使用指南》(吉林化工學院45號文件),符合吉林省動物倫理委員會規定;銀耳多糖(純度>70%) 實驗室自制;N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、吡啶 上海麥克林公司;乙腈、二十二烷酸、正庚烷 北京化學試劑廠;l,2-丙二醇、吐溫-80、膽固醇 沈陽華東制劑廠;丙硫氧嘧啶 上海朝暉藥業有限公司;TC試劑盒、TG試劑盒、LDL-c試劑盒、HDL-c試劑盒、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、谷丙轉氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒 深圳雷杜生命科學股份有限公司;所有有機溶劑 均為國產色譜純。

GCMS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀(配有電噴霧離子源(ESI),AOC-20i自動進樣器) 日本島津公司;HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美國Agilent公司;H2050R型低溫高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司;Chemray240型全自動生化分析儀 深圳雷杜生命科學股份有限公司;FD-1A-50型冷凍干燥機 江蘇天翎儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 將大鼠按體重隨機分為空白組、模型組和銀耳多糖組,每組10只?？瞻捉M正常飼養,自由飲水進食。模型組和銀耳多糖組給予脂肪乳灌胃,10 mL/kg,連續20 d,制備大鼠NAFLD模型。參照文獻方法[11-12]制備脂肪乳劑:取豬油25 g,放入200 mL燒杯中,加熱至100 ℃,加入25 mL吐溫-80,制成油相。在100 mL燒杯中加入30 mL蒸餾水和20 mL 1,2-丙二醇加熱,制成水相。然后將水相加入油相,充分攪拌混勻,待溫度降低后加入膽固醇1.0 g,丙硫氧嘧啶1.0 g,即制成脂肪乳劑。造模成功后,模型組和銀耳多糖組繼續給予脂肪乳,10 mL/kg,同時,根據前期預實驗確定銀耳多糖組給予銀耳多糖200 mg/kg(相當于60 kg人的日用量2.2 g)灌胃,空白組和模型組給予水灌胃,連續灌胃28 d。

1.2.2 血液生化指標的測定 末次給藥后,麻醉大鼠,腹主動脈取血,分離血清,采用全自動生化分析儀對血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c、ALT、AST和ALP進行測定。并計算動脈硬化指數(Arteriosclerosis index,AI),AI=(TC-HDL-c)/HDL-c,LDL-c/HDL-c比值及TC/HDL-c比值。

1.2.3 肝臟組織病理學檢測 取部分肝臟,置4%甲醛溶液中固定,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色法觀察肝臟組織病理形態改變。

1.2.4 采用GC-MS方法對大鼠肝勻漿代謝組學數據的測定與分析

1.2.4.1 肝組織預處理 取肝臟0.5 g加2倍重生理鹽水研磨制成肝勻漿,放置于4 mL離心管中4 ℃下以10000 r/min離心15 min,移取上清液100 μL于1.5 mL離心管中,加入250 μL乙腈,混懸3 min混合均勻后冰浴超聲。冰浴超聲10 min后,4 ℃、12000 r/min下離心10 min,吸取上清液200 μL于1.5 mL離心管中于-55 ℃,真空度999 Pa冷凍干燥12 h。冷凍干燥后,加入50 μL衍生化試劑(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反應0.5 h,1 h后加含二十二烷(內標,0.10 g/L)的正庚烷150 μL,混勻后于12000 r/min離心15 min,移取上清液到1.5 mL離心管,用于GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS測試條件 進樣口溫度:280 ℃;分流比:10∶1;載氣:氦氣;流速:1.65 mL/min;柱箱溫度:60 ℃;柱溫程序:起始溫度60 ℃保持3 min后,以6 ℃/min升溫到290 ℃保持10 min;進樣量:0.2 μL,離子源和接口溫度分別為200和230 ℃;電子能量:0.85 eV;溶劑延遲:5.5 min;全掃描模式,掃描范圍m/z:35～600。

1.2.4.3 代謝組學數據處理及分析 cdf格式的代謝組學原始數據經XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu/index.php)對得到的數據進行峰提取、峰對齊、峰匹配、峰強度校正和消除噪音等操作,將結果轉化為包含化合物保留時間和質荷比信息的csv格式文件,導入SIMCA-P 13.0,通過PCA分析和OPLS-DA分析,進行非靶標代謝組學分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖對NAFLD大鼠血脂和肝功能指標的影響

根據《中國成人血脂異常防治指南》,TG≥1.70 mmol/L為高TG血癥,TC≥5.18 mmol/L為高TC血癥,LDL-c≥3.37 mmol/L為高LDL-c血癥,HDL-c≤1.04 mmol/L為低HDL-c血癥,符合其中任一項即為血脂異常[13-14]。此外,ALT和AST的含量是血清中提示肝損傷的重要指標[15]。由表1可知,與空白組比較,模型組血清TC、TG、LDL-c、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平極顯著升高(P<0.01),HDL-c水平顯著下降(P<0.05),與此同時,ALT、AST和ALP水平極顯著升高(P<0.01),表明大鼠NAFLD模型建立。與模型組比較,銀耳多糖組血清TC、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平極顯著降低(P<0.01),TG和LDL-c水平顯著降低(P<0.05),HDL-c水平顯著升高(P<0.05),ALT、AST和ALP水平顯著降低(P<0.05),表明銀耳多糖具有明顯的降脂保肝作用,可以改善NAFLD大鼠的血脂異常和肝功能異常。

表1 銀耳多糖對NAFLD大鼠血脂和肝功能的影響(n=10)Table 1 Effect of Tremella polysaccharides on plasma lipid and liver function of NAFLD rats(n=10)

2.2 組織病理學檢查

病理結果(圖1)表明,空白組大鼠的肝組織結構正常,肝小葉結構清晰,肝組織細胞清晰可見,無脂肪組織增生;模型組肝細胞脂肪變性明顯,伴有炎性細胞浸潤和脂肪結締組織增生;銀耳多糖組的肝組織細胞情況有明顯改善,肝組織細胞相對清晰、部分肝細胞表現為彌漫脂肪變性及胞漿疏松化,但大部分肝細胞結構正常。由此可見,銀耳多糖可降低大鼠肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。

圖1 銀耳多糖對大鼠肝臟組織病理形態的影響(400×)Fig.1 Effect of Tremella polysaccharideson the pathological morphology of rats’ liver(400×)注:A:空白組;B:模型組;C:銀耳多糖組。

2.3 代謝組學分析

2.3.1 各組肝勻漿代謝輪廓分析 如總離子流(TIC)圖(圖2)所示,3組大鼠肝勻漿中代謝物均得到良好的分離,色譜峰保留時間主要集中在6～45 min,且有明顯的不同,表現在代謝物的保留時間及峰面積上的差異。為了進一步檢測空白組、模型組和銀耳多糖組大鼠代謝輪廓的變化情況,對3組大鼠肝勻漿代謝譜的數據進行PCA分析(圖3)。由PCA圖可以看出空白組、模型組和銀耳多糖組能夠分開并且呈明顯的聚類特征。模型組的樣本遠離空白組的樣本,而銀耳多糖組樣本更接近于空白組,說明銀耳多糖對NAFLD大鼠的異常代謝輪廓有調節作用,更趨近于空白組。

圖3 三組大鼠肝勻漿代謝組學的PCA圖Fig.3 PCA of metabolomics in three groups of rats’ liver注:▲:空白組;■:模型組;●:銀耳多糖組。

圖2 空白組、模型組及銀耳多糖組的TIC圖Fig.2 Total ion chromatography ofcontrol group,model group and TP group注:A:空白組;B:模型組;C:銀耳多糖組。

2.3.2 標志物的鑒定 在OPLS-DA(圖4A、4C)圖中,空白組和模型組可以明顯分為兩部分,模型組和銀耳多糖組也可以明顯分為兩部分,表明組間差異遠遠大于組內差異。在S-plot(圖4B、4D)中,S型兩端的點為潛在的生物標志物,同時以VIP>1.0和P<0.05作為生物標志物的判斷標準。通過匹配NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/),METLIN(https://metlin.scripps.edu/),HMDB(http://www. hmdb. ca/)和KEGG(http://www. genome. jp/kegg/)數據庫和查閱相關文獻,最終確定12個銀耳多糖治療酒精性脂肪肝的內源性代謝物為潛在的生物標志物(表2)。其中,與空白組比較,模型組蘋果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸水平顯著升高(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平降低(P<0.05)。與模型組比較,銀耳多糖組蘋果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸水平降低(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平升高(P<0.05)。上述結果表明,銀耳多糖對12個生物標志物的異常水平均具有顯著的逆轉作用,能夠使得它們的表達趨于正常水平。

圖4 三組大鼠肝勻漿代謝組學的OPLS-DA圖和S-plot圖Fig.4 OPLS-DA and S-plot of metabolomics in three groups of rats’ liver注:A:空白組與模型組OPLS-DA圖(▲為空白組,◆為模型組);B:空白組與模型組S-plot圖;C:模型組與銀耳多糖組OPLS-DA圖(▲為銀耳多糖組,◆為模型組);D:模型組與銀耳多糖組S-plot圖。其中OPLS-DA的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小,縱坐標代表每個物質在第二主成分上的載荷大小;S-plot的橫坐標代表每個物質在第一主成分上的載荷大小,縱坐標代表每個物質和第一主成分相關系數(可靠性)的大小。

表2 銀耳多糖干預NAFLD大鼠的生物標志物Table 2 Biomarkers of Tremella polysaccharides interfered with NAFLD rats

2.3.3 代謝通路分析 通過MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)的代謝通路分析篩選影響因素大于0.1的代謝通路為主要影響的代謝通路。如圖5所示,這12種標志性代謝物主要涉及酮體的合成和代謝,乙醛和二羧酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,TCA循環和丁酸代謝6種代謝途徑。

圖5 代謝路徑分析Fig.5 Metabolic pathway analysis

NAFLD是可影響多個器官的代謝綜合征,肝臟是第一個被積累的器官,最初表現為肝脂肪,繼而引起包括線粒體功能障礙的繼發效應,如氧化損傷和脂肪細胞因子失衡等[16-17]。肝細胞內脂肪的大量沉積導致的氧化損傷是在NAFLD的病理過程起關鍵作用[18]。氧化損傷可導致肝臟線粒體功能障礙并直接導致ATP的生成障礙[19]。TCA循環是碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝的重要樞紐,也是能量代謝產生ATP的重要途徑[20]。蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸和順-烏頭酸是TCA循環的主要產物。丙酸是丙酮酸代謝的中間體,通過參與丙酮酸代謝間接影響體內ATP的生成。D-核糖是ATP的結構組成部分,其水平間接反映體內能量代謝產生ATP情況。D-葡萄糖是機體直接利用的能量來源。山梨醇參與乳酸代謝途徑也影響能量代謝。如表2所示,與空白組比較,模型組上述生物標志物水平均明顯升高,表明模型組大鼠能量代謝異常。此外,蘋果酸、檸檬酸和順-烏頭酸也參與乙醛酸和二羧酸代謝。模型組蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、順-烏頭酸、丙酸、D-核糖和D-葡萄糖水平升高,山梨醇水平降低,表明模型組能量代謝異常的同時乙醛酸和二羧酸代謝也出現了異常。經銀耳多糖治療后,這些生物標志物水平有所恢復,表明銀耳多糖可以調節能量代謝和乙醛酸和二羧酸代謝異常。

長期高脂肪飲食可增加脂肪含量,從而增加血液中的游離脂肪酸水平,進而導致肝臟游離脂肪酸的大量涌入造成過高的肝臟TG濃度和高TG血癥[21-22]。酮體是脂肪酸在肝臟進行正常分解代謝所生成的特殊中間產物,乙酰乙酸是其代謝產物。正常生理情況下,酮體及其代謝產物在體內的含量很低[23]。NAFLD病理狀態下,蓄積的脂肪導致脂動員增強,脂肪酸分解,肝臟中酮體及代謝產物的水平也會增加,甚至還會引起酸中毒[24]。乙酰乙酸也參與丁酸代謝。丁酸代謝上的許多物質最終用于生產酮體。此外,辛二酸也是脂肪酸的代謝產物。模型組肝臟乙酰乙酸和辛二酸水平明顯升高,表明模型組肝臟脂肪酸分解代謝加強,酮體的合成和代謝明顯增加。經銀耳多糖治療后,乙酰乙酸和辛二酸水平有所降低,表明銀耳多糖可以通過調節異常的酮體的合成和代謝,抑制脂肪酸分解,減少肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在NAFLD發展和惡化中起關鍵作用[25]。ROS可以過氧化膜磷脂和蛋白質產生嚴重的細胞氧化損傷[26-27]。正常生理條件下,機體ROS和抗氧化劑的水平保持動態平衡,然而,NAFLD患者體內則出現ROS水平升高或抗氧化劑水平降低的情況[28]。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是體內清除ROS的重要物質之一[29]。甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸是合成GSH的原料。甘氨酸是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝上的重要產物,其水平的降低間接影響GSH的合成和機體的抗氧化能力。D-葡萄糖醛酸是抗壞血酸和醛酸代謝途徑上的物質?？箟难岷腿┧岽x也是和保肝作用有關的代謝[30]。模型組甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平降低表明NAFLD大鼠抗氧化能量降低。給予銀耳多糖后,甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平上調,表明銀耳多糖還可以通過調節甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝水平改善機體的氧化損傷,增加抗氧化能力,發揮保肝作用。

3 結論

銀耳多糖可降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-c、ALT、AST和ALP水平,增加HDL-c水平,并可降低NAFLD大鼠肝脂肪蓄積,減輕肝臟的脂肪變性程度。其作用機制與調節12種生物標志物(蘋果酸、山梨醇、甘氨酸、D-葡萄糖醛酸、延胡索酸、D-葡萄糖、檸檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、順-烏頭酸和乙酰乙酸)所對應的6條主要代謝通路(酮體的合成和代謝,乙醛和二羧酸代謝,抗壞血酸和醛酸代謝,甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,TCA循環和丁酸代謝),使其向正常狀態轉變有關,從而緩解NAFLD大鼠代謝紊亂的癥狀,發揮降脂保肝功效。