CYP19 和CYP1B1 基因多態性與妊娠期肝內膽汁淤積癥易感性的關聯分析

周俐 姚藹娉 袁琳 沈蓮娜

妊娠期肝內膽汁淤積癥是妊娠期婦女特有的一種并發癥,常發生在妊娠的中晚期,主要臨床癥狀為皮膚瘙癢以及膽汁酸升高,對于胎兒的生命健康造成了嚴重影響［1］。妊娠期肝內膽汁淤積癥會引起圍生兒發生突發性死亡,這種危害主要與病情發展具有一定的關聯性。目前對于妊娠期肝內膽汁淤積癥的病因研究尚未明確,可能與女性妊娠期激素水平變化、遺傳、環境以及藥物等因素相關［2］。而在雌激素合成過程中關鍵酶為細胞色素P450 中的CYP19,在雌激素代謝過程中關鍵酶為細胞色素P450 中的CYP1B1,機體疾病易感性的影響因素之一為機體酶活性的差異,而酶活性與基因多態性具有一定的關聯性［3］。本文將研究細胞色素P450 中CYP19 和CYP1B1 基因多態性與感染妊娠期肝內膽汁淤積癥之間的關系,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院于2018年5月～2019年10月收治的50例妊娠期肝內膽汁淤積癥患者作為研究組,另選同期50例正常妊娠期孕婦作為對照組。研究組患者均已經相關檢查確診為妊娠期肝內膽汁淤積癥,對照組女性均不具有妊娠期并發癥。所有研究對象及其家屬均知情并且同意本次研究。

1.2 方法 使用等位基因特異性聚合酶鏈式反應技術與聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術分析兩組研究對象的CYP19 基因以及CYP1B1 基因多態性。檢測CYP19 基因多態性：采取患者靜脈血并進行DNA 提取,使用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術,參照相關文獻進行設計：上游引物為5'-AGTAACACAGAACAGTTGCA-3',下游引物為5'-TCCAGACTCGCATGAATTCTCCGTA-3'。聚合酶鏈式反應總體積為25 μl；反應條件：預變性(95℃)時間為5 min,變性(95℃)時間為30 s,延伸(56℃)時間為30 s,退火(72℃)時間為30 s,重復35 次后孵育(72℃)7 min；鑒定過程應用3%瓊脂糖凝膠電泳進行；在Rsal 限制性內切酶(5U)中加入擴增產物10 μl,反應體系為15 μl,孵育(37℃)5 h 后將酶切后產物(5 μl)取出,再進行4%瓊脂糖凝膠電泳實驗,結合相關結果進行基因型的判斷工作［4］。

檢測CYP1B1 基因多態性：應用等位基因特異性聚合酶鏈式反應技術,將5'-ATGCGCTTCTCCAGG TTTGT-3' 作為公用引物,5'-TCCGGGTTAGGCCACT TCAG-3'為亮氨酸引物,5'-TCCGGGTTAGGCCACTTC AC-3'為纈氨酸引物；亮氨酸引物以及纈氨酸引物分別與公用引物進行組合,形成兩隊引物；分別在兩個反應體系中擴增同一模板；聚合酶鏈式反應總體積為50 μl；反應條件為：預變性(95℃)時間為5 min,變性(94 ℃)時間為1 min,延伸(60 ℃)時間為1 min,退 火(72 ℃) 時間為1 min,重復35 次后孵育(72℃)8 min；應用2%瓊脂糖凝膠電泳進行聚合酶鏈式反應擴增產物的鑒定工作。

1.3 觀察指標 分析兩組研究對象CYP19 和CYP1B1基因型,并比較兩組研究對象CYP19 和CYP1B1 的基因型頻率、等位基因頻率。

1.4 統計學方法 采用SPSS23.0 統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象CYP19 和CYP1B1 基因型分析 CYP19 基因型：經電泳實驗結果可知,Rsal 酶切后分出AA 型、AG 型以及GG 型。CYP1B1 基因型：經電泳實驗結果可知有CC 型與CG 型,未發現有GG 型。

2.2 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較 研究組患者CYP19 的AA、AG 以及GG 基因型頻率與對照組孕婦比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；研究組患者CYP19 的A、G 等位基因頻率與對照組孕婦比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較［n(%)］

2.3 兩組研究對象CYP1B1 的基因型頻率、等位基因頻率比較 研究組患者CYP1B1 的CC、CG 基因型頻率與對照組孕婦比較,差異無統計學意義(P＞0.05)；研究組患者CYP1B1 的C、G 等位基因頻率與對照組孕婦比較,差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象CYP19 的基因型頻率、等位基因頻率比較［n(%)］

3 討論

妊娠期肝內膽汁淤積癥會在分娩結束后快速消失,但是疾病會在服用含有雌激素類的避孕藥情況下復發,再次妊娠也會引起復發情況。其主要臨床表現有瘙癢以及瘙癢引起的失眠、惡心、嘔吐、食欲差以及疲勞等癥狀。臨床治療主要是針對患者瘙癢癥狀來進行,促進患者肝功能的恢復,一般囑患者取左側臥位,有助于胎盤血流量的增加,同時給予吸氧以及營養支持。妊娠期肝內膽汁淤積癥具有地域性以及種族性,同時也具有復發性以及家族聚集傾向性,這也就說明在疾病發展過程中與遺傳因素具有一定的關聯性。在雌激素代謝過程中,關鍵酶基因的遺傳多態性會對酶的含量以及活性造成影響,從而對雌激素代謝過程產生影響,也就是說可以將妊娠期肝內膽汁淤積癥的致病基因看作為雌激素代謝過程中酶相關基因［5］。

CYP19 基因能夠促進雄烯二酮與睪酮向雌酮與雌二醇轉化的過程,具有催化作用,在產生雌激素的過程中發揮著重要作用。CYP19 基因共有10 個外顯子,全長＞75 kb。CYP19 基因屬于雌激素生物合成過程中的一種編碼限速酶基因,一旦CYP19 基因發生變異,會導致機體出現雌激素相關疾病,臨床研究中常誤認為CYP19 基因是導致激素依賴性疾病的致病基因。有調查研究結果顯示,CYP19 基因外顯子3 的沉默多態性與絕經后女性的骨密度以及雌二醇水平具有相關性,AA 基因型血清雌二醇水平要高于GA 以及GG 基因型,GG 以及GA 基因型的老年女性骨質疏松以及骨折發生率更高［6］。本次研究結果顯示,CYP19 基因多態性與妊娠期肝內膽汁淤積癥患者發病不具有明顯作用,基因變異也沒有增加疾病發病風險,當然由于本次研究數據有限,不能就此表明二者之間不具有關聯性。CYPIB1 基因中共有3 個外顯子與2 個內含子,全長約為12 kb。目前有調查研究結果發現CYPIB1 基因型中包含6 個多態位點,其中4 個多態位點會對氨基酸造成一定的影響,引起其發生變化。在細胞色素P450 中,CYPIB1 是一種重要的酶系,在雌二醇C-4 羥化過程中發揮重要作用,可能會對酶活性產生影響,從而影響雌激素的代謝,繼而引發相關疾病。本次研究結果顯示在妊娠期肝內膽汁淤積癥患者發病過程中,CYPIB1 不具有明顯作用,同樣本文不能證明二者之間不具有關聯性。

綜上所述,妊娠期肝內膽汁淤積癥的發生與CYP19 基因第3 外顯子Rsal 酶切以及CYP1B1 基因外顯子3 密碼432 多態性不具有明顯的關聯性,妊娠期肝內膽汁淤積癥的易感性基因還需進一步加大樣本進行調查研究。