雞禽流感H5、H7和H9抗體水平合格率檢測

熊 鑫

（安徽省寧國市農業農村局，安徽 寧國 242300）

1 試驗方法

1.1 樣本制備

①于屠宰環節隨機選取某養殖場雞祖代（80周齡）及父母代（48周齡）各50只；

②通過翅靜脈采集血液，于37℃放置2h；

③取上清液在1800r/min條件下離心2～3min，用移液器吸取上層清液（即為血清）于新的離心管中；

④進行編號標記后于-20℃保存。

1.2 制備1%雞紅細胞懸液

①注射器吸取適量阿氏液，通過翅靜脈采集健康公雞血液；

②于1500r/min條件下離心8～10分鐘，用移液器盡可能吸凈上層清液棄去；

③加入生理鹽水通過稱量配平后，用移液器重復吹打使懸液充分混勻；

④重復②③步驟3～5次；

⑤離心后將上層清液棄掉，用生理鹽水配成1%紅細胞懸液，置于4℃保存備用。

1.3 HA試驗

①取1塊96孔V型微量反應板水平放置于實驗臺，進行標記；

②分別選取6排，其中每2排為重復操作，第1～12孔分別加入25μL生理鹽水；

③分別于相應標記的第1孔加入H5、H7和H9抗原25μL，倍比稀釋至第11孔，棄去槍頭內液體；

④6排的每孔加入25μL生理鹽水；

⑤6排的每孔加入配制好的25μL 1%紅細胞懸液，振蕩混勻后于37℃恒溫箱內反應15～20分鐘；

⑥觀察結果，獲得抗原血凝效價，制備抗原稀釋液。

1.4 HI試驗

①取96孔V型微量反應板進行標記；

②每塊板第1～11孔每孔內加入25μL生理鹽水，第12孔則加入50μL；

③于反應板每排的第1孔、第6孔加入對應血清樣本25μL，分別倍比稀釋至第5孔、第10孔，棄去槍頭內液體；

④于第1～11孔加入25μL配制好的H5抗原稀釋液，振蕩混勻，于37℃反應15～20分鐘；

⑤每孔加入25μL 1%紅細胞懸液，振蕩混勻后放置于37℃反應15～20分鐘；

⑥結果判定，獲得抗體水平；

⑦根據以上方法測得H7和H9抗體水平效價。

2 試驗結果

2.1 HA試驗

以完全血凝的病毒稀釋倍數往前推進2個滴度即為我們需要的四個血凝單位，如圖2-1結果顯示H5抗原的稀釋倍數為1：28。H7抗原的稀釋倍數為1：28。H9抗原的稀釋倍數為1：27。根據結果分別配制H5、H7和H9抗原稀釋液，標記后置于4℃備用。

2.2 HI試驗

根據試驗結果，讀取血清的紅細胞凝集抑制效價，分析結果發現，H5抗體合格率中祖代和父母代的均為100%；H9抗體合格率同樣為100%；H7合格水平率中祖代的為78%，父母代的為72%。本次試驗樣本的檢測結果發現H5、H7和H9抗體水平合格率均較高，并且符合農業部對禽流感抗體水平合格率的相關要求。

該樣本經過免疫H5、H7和H9疫苗，經結果分析發現各疫苗免疫之間互不干擾，均可達到其預期效果，產生較高的抗體水平。

1：HI試驗結果-H5；2：HI試驗結果-H7；3：HI試驗結果-H9

表2-2 HI試驗結果

3 結果分析

HI試驗結果顯示，祖代與父母代的免疫效果合格率無明顯差別，且經檢測發現H5和H9的抗體水平合格率均達到了100%，H7抗體水平合格率分別為78%和72%，也達到了70%以上，根據農業農村部相關公告，H7N9群體免疫合格率需要達到70%以上（家禽抗體滴度≥24），相關農業部門才可出具動物檢疫合格證明，可跨省調運。在抗體合格率上，H5和H9的抗體合格率高于H7的抗體合格率，這可能由不同病毒株之間的不同特性導致，因此，在利用HI試驗檢測進行免疫評估時不得不注意其中的差異。本次試驗結果該養殖場屠宰環節中采集的祖代及父母代樣本的禽流感H5、H7和H9抗體合格率均達到相關要求。