增殖期糖尿病視網膜病變的血清代謝組學研究

朱曉蓉 楊芳遠 盧 晶 曹 曦 楊光燃 謝榮榮 馮建萍 楊金奎*

(1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科,北京 100730； 2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京 100730； 3.北京市糖尿病研究所，北京 100730)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最具特征性的微血管合并癥，是我國成年人致盲的常見原因和首要原因，嚴重影響患者的生活質量[1]。研究[2]顯示，糖尿病病史15～20年，幾乎所有的1型糖尿病和60%以上的2型糖尿病患者有視網膜病變。威斯康星糖尿病視網膜病變流行病學研究(Wisconsin Epidemiological Study of Diabetic Retinopathy，WESDR)表明，3.6%的1型糖尿病患者在年輕時和1.6%的2型糖尿病患者在晚期時被診斷為法定盲。我國糖尿病人群居世界第一，目前成年糖尿病患者超過1億[3]，據此推算，我國因糖尿病視網膜病變所致的法定盲患者將超過160萬人。因此，早期發現和干預具有重要的臨床意義。

糖尿病視網膜病變是由基因與環境因素綜合作用的代謝性疾病。而且越來越多的證據[4]表明，糖尿病視網膜病變的發生與“代謝記憶”有關。早期高血糖暴露引起的表觀遺傳修飾，即使血糖控制良好后也會發生糖尿病合并癥[5]。近年來，代謝組學技術的發展也為探索糖尿病視網膜病變生物標志物研究提供了新的思路。曾有代謝組學研究[4,6]用于探索早期糖尿病視網膜病變的血液“代謝圖譜”。而本研究擬在發生威脅視力的糖尿病視網膜病變——增殖期糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)的2型糖尿病患者中，采用代謝組學檢測，探索增殖期糖尿病視網膜病變的“代謝圖譜”，探討與其發生發展可能相關的機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

以2016-2017年間在首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科及眼科門診就診的1 024名2型糖尿病患者為研究對象，選擇其中增殖期糖尿病視網膜病變者為病例組(PDR組)，根據性別、年齡組間匹配的原則，選擇糖尿病病程10年以上且眼底完全正常(non-diabetic retinopathy, NDR)者為對照組(NDR組)，每組各21例。納入標準：2型糖尿病患者；年齡40～75歲；糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)≥7.5%。排除標準：1型糖尿病和分型不明確的糖尿病患者；合并其他眼部疾病或伴有眼部合并癥的全身系統疾病的患者；嚴重肝腎功能、心臟功能受損的患者；惡性腫瘤及有器官移植病史的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床信息采集

對所有受試者登記臨床信息并完善體格檢查，包括身高、體質量、年齡、性別、糖尿病病程、吸煙史、血壓、體質量指數(body mass index，BMI)等。同時采集血液和尿液進行實驗室檢測，包括空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇、血清肌酐、肝功能、糖化血紅蛋白及尿微量白蛋白等。

1.2.2 血清樣本制備

過夜禁食至少8 h，采用K2EDTA抗凝管抽取4 mL外周血，冰上靜置30 min后，4° 1 000g離心機離心10 min，提取血清。所有血清標本-80 ℃冰箱凍存直到研究使用。

1.2.3 眼底檢查

采用拓普康TRC-NW7SF (Topcon Co., Tokyo公司,日本)眼底照相儀，所有受試者均接受眼底照相檢查，眼底照相結果均由兩名首都醫科大學附屬北京同仁醫院眼科醫師按2002年國際糖尿病視網膜病變臨床分級標準[7]進行分級評估。(i)無明顯視網膜病變(NDR)：無異常改變；(ii) 輕度非增殖期糖尿病視網膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)：僅有微動脈瘤；(iii)中度NPDR：介于輕度及重度NPDR的表現；(iv)重度NPDR：出現下列任何1個改變，但無PDR表現：任一象限內多于20處視網膜內出血；兩個以上象限有靜脈串珠樣改變；1個象限有顯著的微血管內微血管異常；(v)增殖期糖尿病視網膜病變：出現1種或多種改變，包括新生血管形成、玻璃體積血或視網膜前出血。

1.2.4 液相色譜-質譜技術(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)代謝組檢測

取血清100 μL，加入3倍體積乙腈，渦旋震蕩混合1～3 min，4 ℃靜置10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清，真空干燥即可。100 μL乙腈復溶，待檢。采用電噴霧電離源，正離子電離模式。離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度 500 ℃, 脫溶劑氮氣流600 L/h，錐孔反吹氮氣 50 L/h。正離子模式毛細管電離電壓分別為3.0 kV，取樣錐孔電壓為27 eV，萃取錐孔 4 eV，四極桿掃描范圍50～1 500 m/z。

1.3 統計學方法

1.3.1 臨床資料統計

1.3.2 代謝組結果統計

使用MarkerView進行峰識別、峰過濾、峰對齊工作。利用MetaboAnalyst 4.0 (http://www.metaboanalyst. ca/MetaboAnalyst/)將樣本進行標準化處理；進行偏最小二乘法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)多元分析發現組間的差異代謝物；采用倍數變化和t檢驗相結合的方法計算火山圖。再用組間差異具有統計學意義的峰進行多元模式識別確定上調或下調峰。再用這些數據進行箱形圖分析、聚類分析和代謝途徑分析。

差異代謝產物應用Metaboanalyst (http://www.metaboanalyst.ca/)進行路徑和可視化分析。差異代謝物篩選根據差異倍數(fold change,FC)、P值和變量重要性投影值(variable important in the projection, VIP)設定標準。篩選的差異代謝物與人類代謝組數據庫(Human Metabolism Database,HMDB)數據庫進行比較，確定具體物質[8]。

利用KEGG數據庫對差異化合物進行Pathway分析，并且用統計檢驗的方法計算每個Pathway條目中差異化合物富集的顯著性。計算的結果會返回一個富集顯著性的P值，小的P值表示差異化合物在該Pathway 中出現了富集。

圖1 PLS-DA散點得分圖Fig.1 Score plots of PLS-DA models The two groups were well separated in the PLS-DA score plot, indicating that they had markedly different metabolic characteristics;PLS-DA：partial least squares discriminant analysis.

2 結果

2.1 兩組患者臨床特征比較

PDR組與NDR組患者臨床特征詳見表1。兩組間年齡、性別、BMI、低密度脂蛋白膽固醇濃度差異均無統計學意義(P>0.05)。NDR組糖化血紅蛋白濃度高于PDR組，PDR組合并蛋白尿的患者數高于NDR組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組患者臨床特征表

ItemNDR(n=21)PDR(n=21)tPGender (male/female)9/129/12 0.00?1.000Age/a53.8±6.851.6±7.70.850.404Duration/a15(11.5,20)11(8,15.5)2.690.014BMI/(kg·m-2)26.98±3.4026.22±2.591.440.164LDL-C/(mmol·L-1)2.83±0.952.82±0.960.380.709FBG/(mmol·L-1)8.15±2.748.95±2.86-0.140.892HbA1c/%9.38±1.208.14±0.642.800.011Albuminuria515-3.55?0.002Microalbuminuria 20-200 ng/min48 >200 ng/min17

*χ2value;NDR: non-diabetic retinopathy;PDR:proliferative diabetic retinopathy;BMI: body mass index;LDL-C:low density lipoprotein cholesterol;FBG: fasting blood glucose;HbA1c: hemoglobin A1c.

2.2 差異代謝物分析

對獲得代謝物質進行正交PLS-DA模型分析顯示兩組的代謝差異，得分圖見圖1。建立的PLS-DA模型能夠很好地區分PDR組和NDR組。進一步將差異代謝物繪制火山圖及熱圖(圖2)，結果均表明PDR與NDR組相比存在明顯不同的代謝特征。按照FC>2或FC<0.5，P<0.05且VIP>1，篩選出的差異化合物與HMDB數據庫進行比較，共鑒定出136個差異代謝物質，其中包括有機酸(78%)，有機氮化合物(4%)，脂類及類脂分子(3%)及其他代謝物(圖3)。表2展示10個變化顯著的代謝物。

圖2 差異代謝物繪制火山圖(A)和熱圖(B)Fig.2 The volcanic map (A) and heat map (B) of the different metabolites were plottedThere were significantly different metabolic characteristics in the PDR group compared with the NDR group;NDR: non-diabetic retinopathy; PDR:proliferative diabetic retinopathy.

圖3 差異代謝物分類 Fig.3 Metabolite classification analysisPie chart of differentially metabolomic showed that the 136 metabolites mainly involved organic compounds (78%), organoheterocyclic compounds (4%), lipids and lipid-like molecules (3%) and others.

表2 與增殖期糖尿病視網膜病變相關的差異代謝物

HMDB:Human Metabolism Database.

2.3 代謝通路分析

代謝差異物在30條KEGG通路中富集(圖4A)，其中3條通路顯著富集(P<0.05)。這3條通路分別為硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝(圖4B～D)。

圖4 代謝通路分析Fig.4 Non-targeted metabolomics pathway analysisA:Pathway enrichment analysis. The size and color of each circle was based on pathway impact value and P-value, respectively; B-D: Three pathways differ between the NDR and PDR group, particularly, in Sulfur metabolism (B), Sphingolipid metabolism (C) and Cysteine and methionine metabolism(D); NDR: non-diabetic retinopathy; PDR:proliferative diabetic retinopathy.

3 討論

糖尿病視網膜病變是糖尿病最具特征性的微血管合并癥，是成人發生失明的常見原因，也是不可逆性盲的首要原因[1]。糖尿病視網膜病變分為非增殖期視網膜病變和增殖期視網膜病變。其中增殖期糖尿病視網膜病變也被定義為威脅視力的糖尿病視網膜病變，極易導致視力喪失，降低患者生存質量。早期發現和干預具有極其重要的意義。糖尿病視網膜病變的發生機制與高血糖所致持續性代謝性紊亂、炎性反應、氧化應激或其他未知致病因子有關[9]。一個不爭的事實是，一些血糖控制達標的患者也出現了增殖期糖尿病視網膜病變。因此，有研究者[10]認為盡管血糖是視網膜病變進展的主要的系統性風險因素，但它的整體貢獻只有11%，也就是說，風險的89%必須由其他未知因素來解釋。本研究采用液相色譜-質譜技術探索增殖期糖尿病視網膜病變患者血清中代謝失調的特征。本研究目的包括：(1)檢測威脅視力的糖尿病視網膜病變-增殖期糖尿病視網膜病變的“代謝圖譜”; (2)探索可能與增殖期糖尿病視網膜病變發生發展相關的代謝通路。

迄今為止，僅有4項關于糖尿病視網膜病變的代謝組學研究，而根據研究標本類型可以分為玻璃體和血漿。但是玻璃體標本取樣具有侵襲性、取樣受限，而血漿/血清易于獲得，依然是目前開展臨床篩查常用的生物樣品。因此，2016年Chen等[4]首次采用氣相色譜技術對40例非增殖期糖尿病視網膜病變患者的血漿進行代謝組學檢測，共檢測14個差異代謝物，而葡糖酸水平顯著升高可能作為潛在的診斷標志物。與氣相色譜-質譜技術相比，本研究采用液相色譜-質譜技術提高了檢測靈敏度，共檢測出146個差異代謝物。其中差異代謝物-犬尿酸(kynurenic acid)在既往研究[6]中也被報道與糖尿病視網膜病變相關，可能與氧化應激有關，但具體機制尚未明確。

早期2項玻璃體標本的代謝組學研究[11-12]報道增殖期糖尿病患者的玻璃體液的精氨酸代謝[11]、多元醇途徑和抗壞血酸代謝紊亂[12]。Chen等[4]進行的血清代謝組學研究結果則顯示非增殖期糖尿病視網膜病變患者血清中磷酸戊糖代謝途徑顯著富集，磷酸戊糖代謝途徑紊亂可能與非增殖期糖尿病視網膜病變相關。本研究通過增殖期糖尿病視網膜病變患者血清代謝組檢測，發現差異代謝物硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路顯著富集，推測上述代謝途徑紊亂可能與增殖期糖尿病視網膜病變發生、發展有關。蛋氨酸是重要的必需氨基酸，參與機體重要的代謝過程。有研究者[13]認為蛋氨酸代謝紊亂可以通過氧化應激途徑引起腎臟功能損傷。發生機制與影響蛋氨酸代謝通路中的甲硫氨酸亞砜還原酶A(MsrA)和B(MsrB)活性有關[14]。而正常人視網膜中也已被證實存在MsrA[15]，因此筆者首次提出蛋氨酸代謝途徑紊亂可能也是通過影響MsrA功能參與增殖期糖尿病視網膜病變的進程。總而言之，不同眼底分期的血清“代謝圖譜”存在差異，提示增殖期糖尿病視網膜病變可能存在獨特的代謝過程。因此，需要更多的研究來驗證這些結論并探討與糖尿病視網膜病變之間的關聯。

采用代謝組學研究糖尿病視網膜病變的發病機制具有很大的優勢，目前處于起始階段，相關報道很少，結果重復性差，需要更多的研究來驗證這些結論并探討與糖尿病視網膜病變之間的關聯。本研究為探索性研究，存在一定局限性，小的樣本量不足以做出糖尿病視網膜病變患者代謝狀態的結論性陳述，需要增加樣本量和開展隊列研究來證實筆者的發現，并進一步探討可能的機制。

總之，本研究通過伴有增殖期糖尿病視網膜病變的2型糖尿病患者的血清代謝組學研究，發現PDR組與NDR組患者相比具有獨特的代謝特征。提出硫代謝、鞘脂代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝紊亂可能與增殖期糖尿病視網膜病變的發病機制有關。但是本研究結果仍需要更多的研究來驗證這些結論并深入探討與糖尿病視網膜病變之間的關聯。