葛根護(hù)肝片組方配伍及其輔助護(hù)肝功能研究

史保銀,劉新宇,邸 琳,史頂聰,秦海龍,趙宏宇,*,張鳳清,*

(1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012; 2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130012; 3.吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司,吉林通化 134200)

酒精性肝病(ALD)可以被廣泛地描述為在慢性和過(guò)量的乙醇消耗后具有不同程度的肝功能損傷的病癥,在西方國(guó)家酒精性肝病是最常見(jiàn)的肝病,在我國(guó)酒精性肝病的發(fā)病率也在日益增加[1-2]。因此,對(duì)酒精性肝損傷的預(yù)防及治療變得尤為重要。葛根是我國(guó)傳統(tǒng)的解酒中藥,其主要成分為黃酮類(lèi)化合物,含黃豆苷、黃豆苷原及葛根素等,具有保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用,能有效調(diào)節(jié) mTOR 信號(hào)通路的激活[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),在酒精性中毒患者治療過(guò)程中加入中藥葛根,可顯著改善臨床表現(xiàn),而且具有良好的經(jīng)濟(jì)性及可操作性[5]。葛根和水飛薊組合可改善酒精引起的肝脂肪變性,抑制肝炎[6]。甘草主要含有三萜類(lèi)、黃酮類(lèi)及甘草多糖類(lèi)化合物,甘草甜素或其衍生物[7]歸因于其抗炎活性和抗氧化防御能力[8],有助于減輕與酒精有關(guān)的負(fù)面變化[9]。甘草酸差向異構(gòu)體不同配比均具有不同程度的調(diào)節(jié)酒精性肝損傷脂質(zhì)代謝的作用[10]。目前白芍保肝作機(jī)制的研究主要集中在芍藥苷對(duì)抑制炎性因子、調(diào)節(jié)免疫、抗細(xì)胞凋亡以及抗氧化應(yīng)激[11]的調(diào)節(jié)作用方面,臨床前藥效學(xué)研究揭示了其對(duì)急性肝損傷、非酒精性脂肪肝等不同類(lèi)型的肝損傷[12]均有保護(hù)作用,但對(duì)酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究目前仍存在空缺[13]。

實(shí)驗(yàn)室擬研發(fā)一款對(duì)酒精性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健食品,命名為葛根護(hù)肝片,通過(guò)以往藥理活性篩選,結(jié)合中藥配伍理論,已確立了葛根、甘草和白芍的組方。本實(shí)驗(yàn)以葛根、甘草、白芍不同配伍對(duì)酒精致急性肝損傷小鼠的血清VLDL及肝臟中MDA、GSH含量的影響結(jié)果為指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)篩選其最優(yōu)配伍,用數(shù)學(xué)模型設(shè)計(jì)組方配伍能分析出組方中的哪一種藥物對(duì)酒精性肝損傷輔助保護(hù)作用的影響更明顯,以及每種藥物最佳的生藥量[14-15]?？紤]到按正交表安排的每一組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量都是在一定范圍內(nèi)變化的,所以進(jìn)一步研究了最佳配伍各劑量對(duì)亞急性酒精性肝損傷小鼠的影響來(lái)驗(yàn)證最優(yōu)配方的效果,以此優(yōu)化并確立配方中三種藥材的配伍,為葛根護(hù)肝片的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)KM雄性小鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(遼)2015-0001,120只,體質(zhì)量18～21 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):211002300035188;70只,體質(zhì)量18～21 g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):211002300040738) 遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司(試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(吉)2015-0009,由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò),符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定);小鼠顆粒飼料 長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司(飼料生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(吉)2010-0001);葛根、甘草、白芍藥材 河北百合中藥飲片有限公司(經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院鑒定,葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根,甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根,白芍為毛莨科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根;玉米淀粉 石家莊華辰淀粉糖生產(chǎn)有限公司;無(wú)水乙醇，乙酸(分析純) 北京化工廠;磷酸(色譜純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇、乙腈(色譜純) 默克股份兩合公司；MDA試劑盒、GSH試劑盒、TG試劑盒、TC試劑盒、TBIL試劑盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、LDL-c試劑盒 南京建成生物工程研究所;VLDL ELISA試劑盒 武漢華美生物工程有限公司;葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(以95.4%計(jì))、芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品(以95.7%計(jì))、甘草酸銨標(biāo)準(zhǔn)品(以97.7%計(jì)) 中國(guó)食品藥品檢定研究院。

DHG-9134BS-III電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械儀器設(shè)備有限公司;RE-52C系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵 上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;DNM-9602型酶標(biāo)儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;723可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;HC-3618R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;SSW-600-2S型電熱恒溫水槽 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;JA2003B型千分之一電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;PerkinElmer液相色譜儀 美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司;Ultimate XB-C18(250×4.6 mm) 月旭科技(上海)股份有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根護(hù)肝片配伍正交設(shè)計(jì) 2015年版《中國(guó)藥典》中葛根飲片用量10～15 g,白芍飲片用量6～15 g,甘草飲片用量2～10 g,以葛根、甘草、白芍三個(gè)原料作為因素,各自生藥用量(每日推薦人體使用量)作為水平,結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果,設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn),進(jìn)行配方優(yōu)選,因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment design

1.2.2 不同配伍葛根護(hù)肝片的制備 根據(jù)表1進(jìn)行配比,每組配方的生藥總量為人一日用量(生藥量),按生藥總量的15倍放大提取。提取條件為:藥材加入10倍量的70%乙醇溶液浸泡30 min,微沸狀態(tài)回流提取3次,每次1.5 h,濾液合并,干燥粉碎,以玉米淀粉補(bǔ)足至63 g(擬定護(hù)肝片人每日推薦用量為4.2 g)。性狀:黃色粉狀,微溶于水(震蕩可懸浮)。灌胃液體:受試樣品均用 0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)水溶液配制。

1.2.3 葛根護(hù)肝片對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠影響實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后自由進(jìn)食、飲水適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。120只小鼠隨機(jī)分為10組,分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組12只。對(duì)照組每日上午灌胃0.5% CMC-Na水溶液。實(shí)驗(yàn)組小鼠每日灌胃正交樣品1～9號(hào),葛根保肝片推薦人每日食用量為4.2 g,小鼠灌胃劑量按人體同體重推薦量的20倍(人體重以60 kg計(jì)),既灌胃劑量為4.2/60×20=1.4 g/kg·BW,連續(xù)灌胃四周,每周稱(chēng)重2次,灌胃體積隨體重調(diào)整(10 mL/kg·BW)。

給予小鼠受試樣品27 d,第28 d禁食不禁水6 h后,所有小鼠灌胃50%乙醇,灌胃體積為12 mL/kg·BW。在給予酒精15 h后給予受試物,再1 h后摘除眼球取血,離心取血清,保存?zhèn)溆?。頸椎脫椎處死,摘取肝臟,截取合適大小肝塊稱(chēng)重,以肝葉重量10 倍體積的生理鹽水研磨肝葉,研磨液4 ℃放置過(guò)夜,離心,取上清液備用。

對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量進(jìn)行測(cè)定,并進(jìn)行酒精性肝損傷保護(hù)作用綜合評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:以每組小鼠指標(biāo)的均值作為統(tǒng)計(jì)值,評(píng)分時(shí),每項(xiàng)指標(biāo)以對(duì)照組均值作為0分,以實(shí)驗(yàn)組中最優(yōu)組的均值作為100分;MDA、GSH、VLDL含量評(píng)分各占綜合評(píng)分的1/3。以保肝綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的方差分析及極差分析,考察最優(yōu)配伍組合。為驗(yàn)證最優(yōu)配伍對(duì)酒精性肝損傷的作用,同時(shí)進(jìn)一步研究該配伍對(duì)乙醇所致小鼠亞急性酒精肝損傷的影響,進(jìn)行了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 亞急性酒精性肝損傷小鼠實(shí)驗(yàn) 灌胃藥品為正交試驗(yàn)最優(yōu)葛根護(hù)肝片配伍。灌胃樣品制備:以最優(yōu)配伍組合生藥總量的15倍放大提取(生藥總量為人一日用量),配方工藝條件同1.2.2,以玉米淀粉補(bǔ)足至45 g(擬定護(hù)肝片人每日推薦用量為3.0 g)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)入后自由進(jìn)食、飲水適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。70只小鼠隨機(jī)分為5組,分別為對(duì)照組、模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組,每組14只。對(duì)照組和模型組每日上午灌胃0.5% CMC-Na水溶液,高、中、低劑量組灌胃樣品的劑量分別為人每公斤體重的20、10、5倍(人體重以60 kg計(jì)),即(3.0/60×20=1.00、3.0/60×10=0.50、3.0/60×5=0.25)1.00、0.50、0.25 g/kg·BW,所有小鼠灌胃體積均為10 mL/kg·BW。給予28 d,從第15 d開(kāi)始,每日下午除對(duì)照組外,另4組灌胃給予30%乙醇10 mL/kg,末次給藥后采血,分離血清,取肝臟稱(chēng)量重量,摘取最大葉分成2份,研磨肝臟,另取一葉4%甲醛固定,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,計(jì)算肝臟系數(shù),測(cè)定血清中TG、TC、TBIL、VLDL、LDL-c含量、GOT、GPT活性,測(cè)定肝臟中GSH含量。

1.2.5 血清及肝臟中各指標(biāo)含量及活性檢測(cè) 血清中TG含量采用甘油磷酸氧化酶法(GPO-PVP)檢測(cè)、TC含量采用葡萄糖氧化酶法(GOD-PAP)檢測(cè)、TBIL含量采用釩酸氧化法檢測(cè)、VLDL含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)、LDL-c含量采用直接法檢測(cè)、GOT及GPT活性采用賴(lài)氏法進(jìn)行檢測(cè);肝臟中MDA含量采用硫代巴比妥酸比色(TRA)法檢測(cè)、GSH-Px含量采用比色法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 葛根護(hù)肝片最優(yōu)配伍提取物中葛根素、芍藥苷、甘草酸含量測(cè)定 功效成分含量檢測(cè)及方法學(xué)研究參考2015版《中國(guó)藥典》、GB/T 22251-2008、《保健食品功效成分檢測(cè)方法》(白鴻 主編)、《保健食品功效成分檢測(cè)技術(shù)與方法》(馬雙成 等主編),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了適應(yīng)性改進(jìn)。

1.2.6.1 葛根素測(cè)定 對(duì)照品溶液的配制:精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含葛根素0.08 mg的溶液。

供試品溶液的制備:取約0.9 g,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,精密加入30%甲醇25 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)40 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過(guò),取續(xù)濾液。

測(cè)定條件:進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:甲醇-(36%乙酸∶水=3∶27,V/V)(78∶22,V/V);檢測(cè)波長(zhǎng):247 nm;柱溫:25 ℃;流速:0.8 mL/min。

1.2.6.2 芍藥苷測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品適量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成芍藥苷質(zhì)量濃度為0.32 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液,置于4 ℃的冰箱中備用。使用前取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液,以甲醇為稀釋液稀釋至芍藥苷濃度為60 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液的制備:取約1.3 g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%乙醇25 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)40 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

測(cè)定條件:進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:以0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相A,以80%乙腈為流動(dòng)相B,按下表進(jìn)行梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。

表2 流動(dòng)相梯度Table 2 Gradient of mobile phase

1.2.6.3 甘草酸測(cè)定 對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取甘草酸銨對(duì)照品適量,置于20 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成甘草酸銨質(zhì)量濃度為 0.32 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液,置于4 ℃的冰箱中備用。使用前取一定量的對(duì)照品儲(chǔ)備液,以甲醇為稀釋液稀釋至甘草酸銨濃度為80 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液的制備:取約1.9 g,精密稱(chēng)定,置于具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇25 mL,密塞,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率200 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,取10 mL稀釋10倍，濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

測(cè)定條件:進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:以0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相A,以80%乙腈為流動(dòng)相B,按下表3進(jìn)行梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng):237 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。

表3 流動(dòng)相梯度Table 3 Gradient of mobile phase

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及最優(yōu)配伍分析

急性酒精性肝損傷小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量測(cè)定及評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH的含量及各指標(biāo)評(píng)分Table 4 Scores of serum VLDL and MDA,GSH in liver of mice in each group

以保肝綜合評(píng)分為指標(biāo),考察最優(yōu)配伍組合,正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表5、表6。由表 5 知,各因素水平 kA2>kA3>kA1,kC1>kC3>kC2,kD1>kD2>kD3,所以最優(yōu)配伍組合為 A2C1D1,既葛根4 g,甘草 2 g,白芍2 g。表6可知,對(duì)考察指標(biāo)影響的主要因素是配伍中葛根,其次是甘草,影響最小的是白芍。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及極差分析Table 5 Orthogonal experimental design and range analysis

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.2 對(duì)小鼠亞急性酒精性肝損傷的影響

2.2.1 對(duì)小鼠血清中TC、TG、LDL-c和VLDL含量的影響 由表7可知,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-c及VLDL含量均顯著升高(P<0.05),結(jié)合表8模型組小鼠血清中TBIL含量顯著升高(P<0.05)情況可判定亞急性酒精性肝損傷模型成立。

表7 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TC、TG、LDL-c和VLDL含量Table 7 Contents of TC,TG,LDL-c and VLDL in serum of mice in each experimental group

表8 各實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TBIL含量及GOT、GPT活性Table 8 Content of TBIL and activity of GOT,GPT in serum of mice in each experimental group

從表7的數(shù)據(jù)中可以看出,各劑量對(duì)小鼠亞急性酒精性肝損傷均有一定的改善作用。中劑量效果最佳,組內(nèi)小鼠血液中各項(xiàng)指標(biāo)含量均有降低(P<0.05)。其次為低劑量,可有效降低小鼠體內(nèi)TG及LDL-c含量(P<0.05)。高劑量組各指標(biāo)含量均有降低,但與模型組相比無(wú)顯著差異。說(shuō)明葛根、甘草、白芍最優(yōu)配伍可改善乙醇誘導(dǎo)小鼠肝臟損傷造成的脂代謝異常。同時(shí)表明該配伍與其改善小鼠酒精性肝損傷作用的量效關(guān)系不成正比,預(yù)防及改善酒精性肝損傷不能簡(jiǎn)單的增加其劑量,需要進(jìn)一步研究。

2.2.2 對(duì)小鼠血清中TBIL、GOT及GPT水平的影響 由表8可知,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中TBIL含量顯著升高(P<0.05),GPT和GOT活性無(wú)明顯變化。肝細(xì)胞具有攝取、結(jié)合、運(yùn)輸TBIL的功能[16-17]。乙醇致小鼠肝細(xì)胞受損后,其攝取、結(jié)合、排泄TBIL的功能下降,使得血液中的TBIL積累,模型組小鼠血清中的TBIL含量顯著升高(P<0.05),而最優(yōu)配伍各劑量均能顯著降低小鼠血清中TBIL的含量(P<0.05),證明肝細(xì)胞受損情況得以改善,功能趨于正常,其中中劑量效果最佳。GPT、GOT活性是評(píng)價(jià)肝細(xì)胞損害程度的指標(biāo)[18]。GPT存在于胞漿中,GOT存在于線粒體中,肝細(xì)胞被破壞時(shí),血清中GPT、GOT的濃度升高[19]。當(dāng)肝細(xì)胞無(wú)明顯壞死,而僅有肝細(xì)胞膜的通透性增加時(shí),血中GOT的濃度亦可明顯增高,是酒精性肝損傷的敏感指標(biāo)之一。模型組小鼠血清中的GPT、GOT活性與對(duì)照組無(wú)明顯差異,而各劑量組小鼠血清中GPT、GOT活性與模型組相比雖無(wú)顯著差異,但確有所下降,表明長(zhǎng)期給小鼠灌胃濃度為30%的乙醇,小鼠的肝臟會(huì)逐漸適應(yīng)代償,肝細(xì)胞膜或線粒體不會(huì)破裂[20],與趙敏等[21]的研究結(jié)果一致,而葛根護(hù)肝片能在改善脂代謝的同時(shí)保護(hù)小鼠肝細(xì)胞不受損。

2.2.3 對(duì)小鼠肝臟指數(shù)及GSH水平的影響 由表9可知,與對(duì)照組比較,模型組小鼠體肝臟指數(shù)明顯增大,肝臟中GSH含量明顯升高,差異均顯著(P<0.05)。與模型組相比,各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)與GSH含量無(wú)明顯差異。

表9 各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝指數(shù)及肝組織中GSH的含量Table 9 Liver index and the content ofGSH in the liver of each experimental group

GSH作為抗氧化酶的輔助因子,在維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[22]。在實(shí)驗(yàn)中后期給小鼠灌胃 30% 乙醇,主要目的是給予肝臟代謝壓力[23-24]。由表9可知,模型組小鼠的肝臟有顯著性的增重(P<0.05),并且小鼠肝臟中儲(chǔ)藏的還原型物質(zhì) GSH 較高,結(jié)合肝臟指數(shù)及GSH含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)來(lái)看,這可能是由于小鼠為適應(yīng)乙醇的攝入,嘗試增加肝臟中的功能組織細(xì)胞,提高了合成GSH的能力,機(jī)體的抗氧化能力也隨之升高。與模型組相比,各劑量組小鼠的肝臟指數(shù)均略有上升,推測(cè)葛根護(hù)肝片最優(yōu)配伍可能有輔助小鼠增加肝臟中功能組織細(xì)胞的作用,加快了GSH的合成,對(duì)抗自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),阻止肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化,維持細(xì)胞質(zhì)膜的正常結(jié)構(gòu),保護(hù)肝細(xì)胞免受損傷。雖然給小鼠灌胃的是葛根、甘草、白芍三種藥材提取的混合物,存在除有效成分外的其他物質(zhì)增加肝臟代償負(fù)擔(dān)的可能性,考慮到其篩選出的最優(yōu)配伍中劑量能有效的降低小鼠血清中TC、TG、LDL-c及TBIL各指標(biāo)的含量,該可能性不高。

2.2.4 對(duì)小鼠肝臟組織病理變化影響 如圖1a所示,正常對(duì)照組小鼠的肝內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)肝小葉,肝索及肝竇排列整齊,匯管區(qū)三種管道結(jié)構(gòu)清楚可見(jiàn),無(wú)明顯異常,呈正常肝組織結(jié)構(gòu)。模型組小鼠的肝細(xì)胞以氣球樣變性為主,同時(shí)可見(jiàn)肝細(xì)胞胞漿疏松。比較正常對(duì)照組,模型組肝細(xì)胞損傷明顯(圖1b);證明肝損傷的模型復(fù)制是成功的。圖1c中高劑量組小鼠的肝細(xì)胞變性程度明顯減輕,未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);比較模型組,高劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。如圖1d,中劑量組小鼠的肝細(xì)胞變性的程度得到有效減輕,肝細(xì)胞以疏松變性為主,未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);比較模型組,中劑量組可以有效減輕肝損傷的程度。圖1e中低劑量組小鼠的肝細(xì)胞氣球樣變的程度得到得到有效的減輕,可見(jiàn)肝細(xì)胞以疏松變性,未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);比較模型組,低劑量組可以在一定程度上減輕肝損傷的程度。由此可知,葛根護(hù)肝片高劑量對(duì)小鼠酒精性肝損傷的輔助保護(hù)作用較好,中劑量組效果較好,低劑量可以在一定程度上減輕肝損傷。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織形態(tài)的比較(400×)Fig.1 Comparison of liver histology in mice from each experimental group(400×)

2.3 葛根護(hù)肝片最優(yōu)配伍提取物中葛根素、芍藥苷、甘草酸含量測(cè)定結(jié)果

葛根藥材中葛根素含量為6.0%、白芍藥材中芍藥苷含量為2.3%、甘草藥材中甘草酸含量為2.1%;經(jīng)計(jì)算該樣品(制備見(jiàn)1.2.4)中含有葛根素6.57%、芍藥苷1.01%、甘草酸1.01%(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207)。

3 討論與結(jié)論

中藥配伍不同,其作用效果也有差異[25]。本研究以急性酒精性肝損傷小鼠其血清中VLDL及肝臟中MDA、GSH含量的綜合評(píng)分為指標(biāo),采用L9(34)正交試驗(yàn)來(lái)分析葛根護(hù)肝片中三種藥材的最優(yōu)配伍,該配伍為葛根4 g、白芍2 g、甘草2 g,提取物中含有葛根素196.98 mg、芍藥苷30.45 mg、甘草酸30.44 mg。在亞急性酒精性肝損傷小鼠模型成立的前提下,中劑量組小鼠血清TC、LDL-c和TBIL含量與模型對(duì)照組比較降低,差異有顯著性(P<0.05),判定該指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性,即可判定該葛根護(hù)肝片最優(yōu)配伍對(duì)亞急性酒精性肝損傷有輔助保護(hù)功能。綜合二實(shí)驗(yàn)可判定該葛根護(hù)肝片配伍具有有助于降低酒精性肝損傷危害功能。

ALD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前研究認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要為機(jī)體反復(fù)多次過(guò)量攝入酒精,乙醇可通過(guò)誘導(dǎo)CYP4502E1,引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、代謝、營(yíng)養(yǎng)紊亂等一系列復(fù)雜反應(yīng),導(dǎo)致肝細(xì)胞的功能損傷,進(jìn)而引起肝組織中甘油三酯含量聚積,膽固醇合成加強(qiáng),并引起相應(yīng)載脂蛋白含量的改變。降低肝臟運(yùn)出脂肪的功能后,乙醇還可增加脂肪組織的脂肪動(dòng)員,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血癥。血脂代謝異常表現(xiàn)為血清中TC、TG[26]和載體蛋白(LDL-c、VLDL)含量升高等的變化[27-28]。

與亞急性酒精性肝損傷模型組比較,最優(yōu)配伍的中劑量(0.50 g/kg·BW)可使小鼠血清中GPT和GOT的活性有所降低,對(duì)肝指數(shù)和GSH含量無(wú)明顯影響,可使小鼠血清中TC、TG、LDL-c及TBIL含量顯著降低(P<0.05),VLDL含量極顯著降低(P<0.01),低劑量可使小鼠血清中TG、LDL-c及TBIL含量顯著降低(P<0.05),高劑量可使小鼠血清中TBIL含量顯著降低(P<0.05),即中劑量組顯示出明顯的護(hù)肝效果,且效果優(yōu)于低、高劑量組,小鼠酒精性肝損傷情況有明顯的改善,其作用機(jī)制可能與增加抗機(jī)體抗氧化能力及改善肝臟脂質(zhì)代謝有關(guān)。本研究結(jié)果為葛根、甘草、白芍開(kāi)發(fā)為對(duì)酒精性肝損傷有輔助保護(hù)功能的保健食品或藥品提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),但本實(shí)驗(yàn)所用藥材提取物為粗提物,其解酒護(hù)肝的有效成分和作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究。