利用芥菜轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR標(biāo)記及用于種質(zhì)分析

李永平 張雙照 薛珠政 溫慶放

摘要：[目的]為開發(fā)高效的芥菜Brassicajuncea.分子標(biāo)記。[方法]本研究通過對(duì)芥菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的信息搜索SSR位點(diǎn)并分析其分布特點(diǎn)，應(yīng)用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)SSR引物，隨機(jī)選擇50對(duì)引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì)，檢測(cè)其多態(tài)性。[結(jié)果]芥菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得55636條tmigene，全部序列有48193376bp;有7834條unigene包含SSR的序列，從中鑒定出9526個(gè)SSR位點(diǎn)，其中有1371條序列包含1個(gè)以上SSR，復(fù)合SSR有572個(gè)，SSR發(fā)生頻率為14.08%。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)槿塑账岷投塑账幔謩e占總SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重復(fù)基元中以AG/CT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，占總位點(diǎn)的34.74%，三核苷酸重復(fù)基元以AAG/CTT為主，占總位點(diǎn)的18.30%。共設(shè)計(jì)出21282對(duì)SSR引物，隨機(jī)選擇50對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中41對(duì)擴(kuò)增出清晰可重復(fù)的預(yù)期條帶，17對(duì)（占34%）在44份芥菜種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性。應(yīng)用UPGMA得到將44份供試材料分為4大類聚類圖，可準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。[結(jié)論]根據(jù)芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)能開發(fā)出類型豐富、效率較高的SSR標(biāo)記，為芥菜親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建等提供更可靠的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：芥菜;轉(zhuǎn)錄組;SSR;多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S649文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2020）02-0169-09

（研究意義）芥菜（Brassicajuncea）十字花科蕓薹屬植物，原產(chǎn)中國(guó)，并在中國(guó)發(fā)生豐富的變異和分化，全國(guó)有1000多份不同的芥菜品種。收集的種質(zhì)資源混雜多樣，因此對(duì)芥菜的種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定及分類意義重大，有利于提高芥菜種質(zhì)的利用效率。（前人研究進(jìn)展）目前對(duì)芥菜的起源進(jìn)化、分類和遺傳多樣性已有研究。依據(jù)葉形態(tài)特征，如基生葉的裂刻、刺毛的有無、葉形的變化、莖與根的變異等，Vauzb8n等將芥菜劃分了4個(gè)類群。孟秋峰等對(duì)17個(gè)芥菜變種植物學(xué)性狀進(jìn)行聚類，結(jié)果分為葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜、薹用芥菜和籽用芥菜等5個(gè)類。（本研究切入點(diǎn)）微衛(wèi)星序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記，在生物基因組中普遍存在，是一種可信賴的、使用方便分子標(biāo)記之一，常用于作物遺傳信息分析、品種鑒別、建立遺傳圖譜等。EST-SSR標(biāo)記較基于基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記種間通用性更高，更經(jīng)濟(jì)方便。EST-SSR標(biāo)記在辣椒、菜薹、菠菜、大白菜、甘藍(lán)和洋蔥等一些主要蔬菜作物中都有開發(fā)與應(yīng)用，芥菜的EST-SSR標(biāo)記開發(fā)利用未見報(bào)道。（擬解決的關(guān)鍵問題）本研究中應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR標(biāo)記搜索，設(shè)計(jì)EST-SSR引物，評(píng)價(jià)引物的多態(tài)性效率，為芥菜種質(zhì)遺傳信息鑒定、遺傳信息利用等開發(fā)可靠、高效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

測(cè)序材料“龍芥2號(hào)”于9月15日播種，lo月5日定植于福建省龍巖市新羅區(qū)龍門鎮(zhèn)赤水村，11月5日，選取3株健康無病植株，每株選幼葉葉稍處取5g樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩V州基迪奧生物科技有限公司采用Illumina HiSeq TM 2500PEl25系統(tǒng)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（無參），經(jīng)過濾得到4.82G的有效RNA-seq數(shù)據(jù)。

1.2材料及其DNA提取

項(xiàng)目組收集的44份芥菜種質(zhì)材料（表1）用于SSR引物篩選和有效性評(píng)價(jià)。供試材料基因組DNA用CTAB法提取。

1.3 SSR位點(diǎn)搜索及SSR引物設(shè)計(jì)

用MISA程序（http：//pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）對(duì)轉(zhuǎn)錄組的所有Unigene進(jìn)行搜索，尋找Unigene中的SSR，搜索參數(shù)為二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)分別大等于6、5、5、4和4次且2個(gè)SSR序列的距離不短于100bp;用Primer 3.0軟件對(duì)每條SSR設(shè)計(jì)3對(duì)引物并評(píng)價(jià)。引物要求為：序列長(zhǎng)度18～25bp，GC含量40%～60%，上、下游引物的Tm值≤2℃，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物100～400bp，不產(chǎn)生二聚體。

1.4 SSR引物篩選

20uLPCR反應(yīng)體系：lommol·L^-1dNTPs0.4uL，5U Taq酶0.3uL，100ng DNA 1.0uL，10umol·L^-1的上、下游引物各0.8uL，10× Buffer（Mg²⁺）2.0uL，ddH₂O 14.7ul.PCR熱程序如下：94℃5m;94℃30s，58℃30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán);72℃5min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SSR發(fā)生頻率=SSR的unigene數(shù)量/總unigene數(shù);SSR出現(xiàn)頻率=SSR個(gè)數(shù)/總unigene數(shù)，SSR平均分布距離=unigene堿基數(shù)/SSR數(shù)。“1”：“0”法統(tǒng)計(jì)電泳數(shù)據(jù)，應(yīng)用NTsys2.10e聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1SSR的分布特征

芥菜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得55636條unigene（總長(zhǎng)約48193376bp），經(jīng)MISA軟件搜索發(fā)現(xiàn)9526個(gè)SSR位點(diǎn)發(fā)布于7834條unigene上。SSR發(fā)生頻率14.08%，出現(xiàn)頻率、17.12%，平均5.06kb有1個(gè)SSr.包含有二至六核苷酸重復(fù)類型，其中三核苷酸和二核苷酸重復(fù)是主要形式，分別占總SSR的51.12%與41.91%;其他3種苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少共占總數(shù)的6.97%（表2）。

芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)最低4次，最高位42次，共有9241個(gè)SSR重復(fù)次數(shù)為4～10次，占總數(shù)的97.01%;285個(gè)SSR重復(fù)次數(shù)在11～42次，占總數(shù)的2.99%。芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR的長(zhǎng)度為12～324bp，主要集中于12～18bp，此長(zhǎng)度間SSR達(dá)8230個(gè)，占總數(shù)的86.40%，長(zhǎng)度大于18bp的SSR有1296個(gè)，只占13.60%。

2.2 轉(zhuǎn)錄組中SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

芥菜轉(zhuǎn)錄組的重復(fù)基序較為豐富，共有172種重復(fù)基序，分布見表3.AG/CT重復(fù)基序發(fā)生頻率最高為34.74%，占二核苷酸重復(fù)的總數(shù)的82.89%;其次是AAG/CTT重復(fù)基序，發(fā)生頻率為18.30%，占三核苷酸總數(shù)的35.79%。四核苷酸有25種重復(fù)基序、五核苷酸41重復(fù)基序、六核苷酸重復(fù)基序達(dá)92種，分布較散，發(fā)生的頻率不高。

2.3 芥菜轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計(jì)與篩選

遵照引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)，7834條含SSR位點(diǎn)的unigene序列，共設(shè)計(jì)得引物21282對(duì)。從不同核苷酸重復(fù)單元的引物中隨機(jī)挑選50對(duì)，PCR擴(kuò)增龍芥2號(hào)DNa.結(jié)果為50對(duì)引物均能擴(kuò)增，其中4l對(duì)（82.00%）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100～400bp，9對(duì)（18%）擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度超400bp.

2.4多態(tài)性分析

用上述擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小相符的41對(duì)引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì)資源（圖1），有17對(duì)（41.46%）引物具有特異性（表4）。17對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增46個(gè)多態(tài)性片段，平均每對(duì)引物擴(kuò)增2.71個(gè)多態(tài)性片段。PIC值的大小代表多態(tài)性息的豐富程度，17對(duì)引物的PIC最高值達(dá)到0.82，平均值為0.60，僅BaSSR007、BaSSR043引物PIC值較低為0.43和0.47，表明這些17對(duì)芥菜SSR標(biāo)記含有豐富的多態(tài)信息。17對(duì)多態(tài)性引物中二核苷、三核苷酸、五核苷重復(fù)的各4、6、3對(duì)，四核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)的各2對(duì)。

對(duì)多態(tài)性SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果聚類分析，在遺傳距離0.82處，44份芥菜種質(zhì)材料被分成四大類（圖2）。

第Ⅰ大類包括36個(gè)莖用、葉用芥菜材料;第Ⅱ大類包括5個(gè)結(jié)球芥材料：17、35、22、4l、43;第Ⅲ大類包括2個(gè)紫葉芥材料：2、42;第Ⅳ大類：薹芥品種38單獨(dú)成類。第Ⅰ大類36個(gè)材料在遺傳距離0.67處聚為4個(gè)亞類：（1）此亞類包含1、4、9、15、44、30、36、40、39、37、11等11個(gè)莖用材料和21、16、7、24、19、23、29、20、18等9個(gè)葉用材料;（2）含葉面有刺毛4個(gè)材料25、26、27、28;（3）此亞類包含5個(gè)株型半直立的材料32、31、12、33、34;（4）此亞類包含7個(gè)葉面平滑材料3、14、5、13、8、6、10.

3 討論

高通量測(cè)序快速發(fā)展，EST數(shù)量得到迅速增加，為EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用提供了條件，許多植物的EST-SSR標(biāo)記已被開發(fā)應(yīng)用。芥菜EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)利用國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。本研究從芥菜的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的55636條unigene搜索獲得7834條unigene序列共9526個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR發(fā)生頻率為14.08%，出現(xiàn)頻率為17.12%。此結(jié)果較菠菜、洋蔥、黨參等4.33%～16，10%的頻率范圍略高，但低于菜薹19.26%和蘿卜23.79%和的SSR位點(diǎn)頻率。SSR發(fā)生頻率與物種基因組差異、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的時(shí)期選擇、獲得數(shù)據(jù)量大小與質(zhì)量、SSR搜索工具的選擇及篩選的參數(shù)設(shè)置等因素密切相關(guān)。芥菜SSR含二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)5種類型，以三核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主要形式，分別占總SSR的51.12%與41.91%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的3.70%、1.40%和1.87%，與菜薹、芝麻、蘿卜等作物的研究結(jié)果有所不同，這與SSR搜索參數(shù)設(shè)置有關(guān)。二、四和五核苷酸重復(fù)多在非翻譯區(qū)（UTR），三、六核苷酸重復(fù)與編碼序列（CDS）密切相關(guān)，芥菜三核苷酸重復(fù)SSR占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，說明芥菜轉(zhuǎn)錄組unigene中的CDS信息更豐富。AAG/CTT和AG/CT重復(fù)基序在眾多基序占優(yōu)勢(shì)，與在大白菜、黃秋葵的結(jié)果一致。選取的50對(duì)SSR引物擴(kuò)增‘龍芥2號(hào)DNA，9對(duì)（18%）引物擴(kuò)增產(chǎn)物超預(yù)期，擴(kuò)增不成功的因素可能是引物內(nèi)含子在啟動(dòng)位點(diǎn)引起SNPS/InDel變異，或是組裝錯(cuò)誤。多態(tài)性引物占有效引物的41.46%，低于洋蔥（45.00%），高于辣椒（36.84%）、菠菜（17.43.00%），說明所設(shè)計(jì)的芥菜SSR標(biāo)記引物多態(tài)性較好。有研究認(rèn)為，SSR標(biāo)記的多態(tài)性可能與重復(fù)序列長(zhǎng)度呈正相關(guān)，重復(fù)序列長(zhǎng)于20bp的SSR，表現(xiàn)多態(tài)性的概率高;重復(fù)序列長(zhǎng)度小于20bp的SSR呈多態(tài)性的可能性明顯較低。本研究中17對(duì)多態(tài)性引物僅有2對(duì)來自于長(zhǎng)度小于20bp重復(fù)序列。PIC值可用于衡量標(biāo)記的多態(tài)信息，本研究中17對(duì)多態(tài)引物的平均PIC值為0.60，最低值0.43發(fā)生在重復(fù)序列最短序列的引物BaSSR007上，15對(duì)引物PIC值均大于0.5，結(jié)果說明本研究開發(fā)的芥菜EST-SSR有較高的多態(tài)性。

李寧等用SRAP標(biāo)記將111份芥菜歸為薹芥、葉用芥和莖用芥、紫葉芥和長(zhǎng)柄芥5類，遺傳相似系數(shù)為0.38～0.89，表明芥菜在分子水平上遺傳多樣性較豐富。本研究應(yīng)用EST-SSR標(biāo)記分類44份芥菜種質(zhì)材料的結(jié)果與其相似，但與運(yùn)用AFLP、RAPD、ISSRL等標(biāo)記研究的結(jié)果不盡相同，這可能與不同分子標(biāo)記所揭示的基因組片段的變異方式不同有關(guān)。

RAPD、ISSR、SRAP等標(biāo)記技術(shù)均開發(fā)于無基因組（或轉(zhuǎn)錄組）序列信息，隨機(jī)性強(qiáng)、穩(wěn)定性差。EST-SSR來自基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)并與功能基因緊密連鎖，具有豐富多態(tài)性，較高靈敏度，可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。本研究利用基于芥菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得17對(duì)SSR引物，對(duì)44份芥菜種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，以遺傳距離0.82為閾值，44份芥菜種質(zhì)材料分為四大類，SRAP標(biāo)記等無法將結(jié)球和不結(jié)球芥菜完全分開，而SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確分開，較ISSR、SRAP等標(biāo)記的分析結(jié)果，SSR標(biāo)記更準(zhǔn)確地體現(xiàn)了芥菜種質(zhì)材料的關(guān)系。