細菌纖維素合成菌納塔葡糖酸醋桿菌遺傳操作方法的建立

謝文平　鮑素敏　劉權　張鴻

摘要 [目的]建立納塔葡糖酸醋桿菌遺傳操作系統，為采用基因工程方法改造該類菌株，提高纖維素產量，提升纖維素品質提供參考依據。[方法]通過優化培養基確定菌株電轉化感受態制備條件，采用質?；蛘呔€性化片段在不同電壓下進行轉化，優化最佳轉化條件。[結果]采用添加了1%纖維素酶的C2培養基進行1次搖瓶轉接，可有效制備納塔葡糖酸醋桿菌電轉化感受態;采用攜帶同源臂及Kan抗性基因的環狀質?；蛘呔€性化片段均實現了對納塔葡糖酸醋桿菌葡萄糖脫氫酶基因（GDH）的同源雙交換基因敲除;GDH基因的敲除降低了工程菌株發酵產纖維素膜過程的葡萄糖酸產生，提高了細菌纖維素的最終產量及品質。[結論]成功建立了納塔葡糖酸醋桿菌遺傳轉化方法和基因敲除方法。

關鍵詞 細菌纖維素;納塔葡糖酸醋桿菌;電轉化;基因敲除

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）11-0001-06

Abstract [Objective]Establishing a genetic operating method for Gluconacetobacter nataicola can provide reference for modifing the strains by genetic engineering，improving the yield and the quality of bacterial cellulose.[Method]The conditions for the preparation of competent cells were determined by the growth ability of the strain in different media，and the optimal transformation conditions were determined by positive clone obtained by transforming the plasmid or the linearized fragment at different electrotransformation voltages.[Result]The C2 medium supplemented with 1% cellulase was used for one time bottom transferring，which can effectively prepare the electroporation of G.nataicola.The homologous doubleexchange knockout of the glucose dehydrogenase gene （GDH） was achieved by transferring the circle plasmid or the linearized fragment carrying homologous arm of GDH and Kan resistance gene.Knockout of GDH gene reduced the production of gluconic acid in the process of fermentation，and improved the final yield and quality of bacterial cellulose membrane.[Conclusion]The genetic transformation method and gene knockout method of G.nataicola were successfully established.

Key words Bacterial cellulose;Gluconacetobacter nataicola;Electroporation;Gene knockout

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是細菌利用葡萄糖合成的由β-1，4-糖苷鍵連接而成的纖維素。因其具有超高的純度、高結晶性、高楊氏模量、優良的生物可降解性、高持水量和良好的生物相容性等特點，已作為新型生物可降解材料用于食品、化學工業和醫學領域[1-2]。目前，細菌纖維素已經成功應用于燒傷敷料、退熱貼、高端面膜等產品的基材而在各國實現了規?；a[3-5]。

根據已有的報道，具有細菌纖維素合成功能的微生物包括葡糖酸醋桿菌屬（Gluconacetobacter）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、無色桿菌屬（Achromobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）等[3，6-7]。其中，葡糖醋酸菌屬的木醋桿菌（G.xylinum）、巴氏醋桿菌（G.pasteurianus）、漢式醋桿菌（G.hansenis）、納塔葡糖酸醋桿菌（G.nataicola）等種屬的微生物都具有相對較強的纖維素合成能力[6]。

目前，對產纖維素菌種的研究主要集中在發酵條件的優化上，以提高纖維素合成能力[8-11]。采用基因工程方法進行育種具有更好的目標性和有效性，也是目前微生物育種常用的方法。但是由于細菌纖維素生產菌株為非模式生物，有關其遺傳轉化的方法研究很少。2006年，Chien等[12]采用廣宿主質粒在木醋桿菌中表達了血紅素蛋白，增強菌株的攝氧能力，提高菌株的細菌纖維素合成能力。2015年Kuo等[13]在木醋桿菌中采用同源重組的方法敲除了其中的GDH基因，提高了纖維素產量。2016年，Florea等[14]在G.rhaeticus（又稱Komagataeibacter rhaeticus）中構建了一套遺傳操作工具，用于在該菌株中進行外源基因的表達。但目前對于葡糖酸醋桿菌屬的其他種屬，如納塔葡糖酸醋桿菌的遺傳操作鮮有報道。

該研究以納塔葡糖酸醋桿菌為對象，通過摸索優化感受態制備條件和轉化條件，實現對該種菌的基因敲除操作，以期為優化納塔葡糖酸醋桿菌在工業上的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒。

納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004，是一株快速、高產細菌纖維素的工業化生產菌株，已保藏于中國普通微生物管理中心，保藏號：CGMCC No.11588。大腸桿菌DH5a，載體構建用菌株。pMD18-T載體購于寶生物工程（大連）有限公司，pET-28a質粒為Novagen公司產品。

1.1.2 試劑和設備。

PCR用的高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、普通DNA聚合酶EmeraldAmp PCR Master Mix （2× Premix）、連接酶Solution I、 QuickCut限制性內切酶、DNA marker、質粒提取及DNA凝膠回收試劑盒均購于寶生物工程（大連）有限公司。纖維素酶，硫酸卡那霉素（Kan）和氨芐青霉素（Amp）購于生工生物工程（上海）股份有限公司。其余化學試劑為國產分析級試劑。

主要設備：PCR儀（Biometric），凝膠成像系統（BioRad），電穿孔儀器（Bio-Rad，型號165-2100）。

1.1.3 培養基。

大腸桿菌所用LB培養基：酵母粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L。根據需要，在大腸桿菌質粒構建過程中加Kan 至終濃度50 mg/L或Amp至終濃度100 mg/L。納塔葡糖酸醋桿菌所用的培養基有3種（表1），其中固體培養基加入2%瓊脂。7#培養基用于菌種的基礎培養，C2培養基用于菌株發酵產纖維素膜。

1.2 方法

1.2.1 納塔葡糖酸醋桿菌對Kan和Amp抗生素的耐受性測試。

將納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004菌株接到7#液體培養基中，28 ??℃ 振蕩培養2 d后，取菌液稀釋100倍，取50 μL分別涂布到Kan濃度為 0、5、25、50、150、100 mg/L的7#培養基固體平板上;按照上述相同方法，取50 μL分別涂布到Amp濃度為 0、25、50、100、150、200 mg/L的7#培養基固體平板上。上述平板置于28 ?℃ 培養箱中培養，每天觀察平板上菌落生長狀況，連續觀察7 d。

1.2.2 GDH基因敲除載體及敲除片段的構建。

研究參照木醋桿菌基因敲除方案進行[13，16]。通過構建同源重組雙交換質粒，用于HEC-004菌株GDH基因的敲除。其中同源敲除盒的結構為GDH上同源臂-Kan表達盒-GDH下同源臂。其中基因組DNA提取、質粒提取、PCR擴增、DNA酶切、回收、連接均參照試劑盒的說明書進行操作。質?？寺〉乃拗鳛榘凑铡斗肿涌寺∈謨浴稢aCl2法制備的大腸桿菌DH5a化學感受態。

質粒的具體構建過程如下：按照表2所列的引物和DNA模板分別擴增4個片段并回收，各取0.5 μL作為混合模板，以GDHupF和GDHdownR為引物進行4片段的overlapping PCR擴增。將上述融合PCR產物割膠回收后，利用HindⅢ和EcoRI限制性內切酶進行雙酶切，并連接到同樣酶切的pMD18-T載體上，在含有50 mg/L Kan和100 mg/L Amp的LB雙抗平板上篩選，得到含有pBAC03-GDHKⅡ質粒的克隆。

研究同時也嘗試直接采用線性化片段進行基因敲除。將pBAC03-GDHKⅡ質粒進行HindⅢ和EcoRI雙酶切，獲取包含GDH上游同源臂、Kan抗性表達盒以及GDH下游同源臂的DNA作為線性基因敲除盒（命名GDHKⅡ）。

1.2.3 納塔葡糖酸醋桿菌感受態的制備及轉化。以往文獻關于木醋桿菌的轉化均用HS培養基（表1）進行感受態細胞制備，后采用電轉化的方式進行轉化[17-18]。由于研究所使用的菌株為非標準菌株，其感受態細胞的制備及遺傳轉化的方式需進行條件摸索。一般用處于對數生長期生長活力旺盛的細胞制備電轉化感受態細胞。為了篩選出最優的培養基及細胞生長狀態，對細胞在3種培養基中的生長狀況進行生長曲線考察。

生長曲線的制作方法：從7#平板上挑2個在28 ℃培養了5 d的單克隆，分別轉接到含25 mL HS、C2和7#培養基的三角瓶中，同時加入1%纖維素酶溶液防止細菌纖維素的形成，150 r/min，28 ℃培養36 h，然后分別轉接10%培養物到新的培養基中繼續培養，測定OD600至衰亡期。每種培養基進行3個平行試驗。

納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004菌株電轉化感受態的制備按照以下方法進行：①將細胞養至對數生長期，用于感受態細胞的制備。②將細胞培養液轉入50 mL滅菌離心管中，在預冷的離心機中4 000 r/min離心5 min收集細胞。

③去上清后，用預冷的1 mmol/L HEPES溶液（pH7.0）對細胞輕輕懸浮洗滌，4 ℃ 4 000 r/min離心5 min收集細胞。并將步驟③重復一遍。

④用預冷的15%甘油輕輕重懸細胞，4 ℃ 4 000 r/min離心5 min收集細胞。⑤往收集的細胞沉淀中加入1 mL預冷的15%甘油，置于冰上用于電轉化。

⑥在一個預冷的1.5 mL離心管中加入1 μg DNA量的待轉化pBAC03-GDHKⅡ質?；蛘逪ind Ⅲ和Eco RI雙酶切的線性化DNA片段，然后加入40 μL做好的感受態細胞，輕輕混勻，轉移到預冷的2 mm電轉杯中。⑦轉化使用Bio-Rad MicroPulser基因導入儀，嘗試使用電壓：1.5、2.0、2.5和3.0 kV。⑧電擊完畢后在電轉杯中迅速加入預冷的7#培養基1 mL，將轉化后的細胞轉移到 PA瓶中進行6 h的復蘇培養。⑨6 h后收集菌液，離心濃縮到100 μL，涂布到含有50 mg/L Kan的平板上。

1.2.4 轉化子的篩選鑒定。

根據細胞內同源重組的原理，由于pBAC03-GDHKⅡ載體上具有與GDH基因上下游相同的同源臂，因此轉化所得到的轉化子理論上會出現3種結局：①上游同源臂或者下游同源臂發生了單交換，整個質粒插入到GDH位置（圖1A），形成2個拷貝的GDH基因，同時具有Kan和Amp抗性;②按照預期進行雙交換;Kan基因替換原GDH基因（圖1B），克隆只具有Kan抗性，沒有Amp抗性;③發生了隨機整合，原GDH基因處未發生變化（圖1C），菌株可能同時具有Kan和Amp抗性。而GDHKⅡ線型片段轉化子只有2種可能：①按照預期進行了雙交換;②發生了隨機整合。

由于單交換菌株發生重組后存在正向重復，能發生同源重組，形成回復突變，因此從穩定性方面考慮，目的是篩選進行了雙交換的克隆。菌株在含有50 mg/L Kan的抗性平板上生長5 d后，進行克隆的篩選。

采用pBAC03-GDHKⅡ質粒轉化得到的轉化子，挑取分別接種到含有200 mg/L Amp抗性的C2瓊脂平板和50 mg/L Kan抗性的C2瓊脂平板進行抗性測試;將只能在Kan平板上生長的轉化子用于進一步的PCR基因型驗證。線性化片段轉化得到的轉化子直接采用PCR的方法進行驗證。在GDH被替換區域兩側設計引物GDH-F1（5′-cggactgtatcacggtaatcagg-3′）和GDH-R2（5′-caggcggtcctgccacagcac-3′）用于進行整合菌株雙交換轉化子的鑒定。

1.2.5 GDH基因敲除菌株與出發菌株的產纖維素比較。將篩選到的GDH基因敲除菌株與野生HEC-004菌株進行產纖維素比較試驗。在三角瓶中考察纖維素膜的產量，并測定發酵過程的pH，以確定GDH的敲除是否能降低發酵過程葡萄糖酸的產生而改善菌株的產膜能力。

為進一步確定GDH敲除對葡萄糖消耗及葡萄糖酸生成產生的影響，取發酵液200 μL與-20 ℃預冷的丙酮800 μL混勻，-20 ℃冷凍4 h后，12 000 r/min離心10 min進行HPLC檢測，分析殘液中葡萄糖酸及葡萄糖含量。分析條件：流動相為85%乙腈，色譜柱為Agilent Glycan （4.6×150 mm），柱溫為45 ℃，流速為0.5 mL/min， RID檢測器溫度為35 ℃。

2 結果與分析

2.1 納塔葡糖酸醋桿菌HEC-004對Kan和Amp的耐受性測定 通過比較發現其在不同抗性濃度下的生長有所不同（表3）。該菌在較高濃度的Amp抗生素培養基中仍然可以生長，在150 mg/L的Amp抗性培養基中培養7 d可以在平板上觀察到微菌落。而在Kan抗性條件下，25 mg/L的濃度即可完全抑制菌體生長。綜合菌株在2種抗生素平板上的生長情況，在轉化子篩選過程中，Kan抗生素的濃度采用25 mg/L，Amp抗生素的濃度采用200 mg/L。

2.2 感受態制備培養基的優化 將HEC-004菌株在HS培養基、7#培養基和C2培養基中進行培養，發現該菌株在7#培養基和C2培養基中可以生長，但在HS培養基中不能生長。為了選擇最佳培養基并在合適時間收集細胞制備感受態，繪制了HEC-004在7#和C2培養基的生長曲線（圖2）。

從生長曲線上看，7#培養基和C2培養基的最大比生長速率均在μ=0.05。7#培養基的生長曲線顯示在35 h后不再生長。綜合考慮生長速率和細胞生長狀態以及制作感受態細胞所需要的細胞密度，選擇C2培養基作為感受態細胞培養用的培養基，當菌體濃度生長到OD600=1.0左右時用于電轉化感受態細胞的制備。

2.3 電轉化結果

pBAC03-GDHKⅡ質粒圖譜見圖3。轉化產物在含Kan抗生素的7#平板培養5 d后，能看到針尖大小的轉化子出現。不同條件下的轉化結果如表4所示。pBAC03-GDHKⅡ質粒及其線性化敲除盒在2.0、2.5、3.0 kV電壓條件下均獲得轉化子，其中采用2.5 kV條件下得到的轉化子最多。

2.4 陽性克隆的篩選鑒定

通過抗性平板對pBAC03-GDHKⅡ載體轉化得到的轉化子進行抗性表型篩選。挑選50個克隆在Amp平板上進行點菌，其中有46個具有Amp抗性，剩余的4個采用引物GDH-F1和GDH-R2進行PCR驗證，只有3個發生了預期的雙交換，雙交換概率6%。

GDHKⅡ線型片段所得到的轉化子，挑選了40個采用引物GDH-F1和GDH-R2進行PCR驗證，結果只有7個克隆具有預期基因型，陽性率為17.5%。

選取其中一個具有正確基因型的陽性克隆HEC-33進行基因組的抽提，采用3組引物進行再鑒定，結果表明HEC-33在3對引物的擴增下均具有預期大小的片段（圖4），進一步證明了所挑選克隆為雙交換的轉化子。該克隆用于下一步的產膜試驗驗證。

2.5 GDH敲除菌株產纖維素發酵 選取成功進行了雙交換的一株菌株HEC-33進行產膜發酵試驗。三角瓶中細菌纖維素膜的結果表明，與野生菌株HEC-004相比，HEC-33菌株產膜速度變慢，但最終的纖維素膜產量提升，該結果與Kuo等[13]敲除G.xylinus菌株中的結果類似。經過7 d的培養，與野生菌株相比，HEC-33菌株的產膜濕重提高了18.3%。通過肉眼觀察，工程菌株所產膜質地更均勻，柔韌性更好。對HEC-004和HEC-33菌株在三角瓶中培養的纖維素膜發酵殘液進行pH測定，也證明敲除了GDH基因的菌株，其發酵殘液中沒有葡萄糖酸的產生（表5）。

3 討論

該研究通過培養基篩選確定了高產細菌纖維素的G.nataicola 菌株HEC-004的感受態制備方法。由于目前暫未查詢到有文獻研究G.nataicola的遺傳轉化方法，試驗首先借鑒了文獻報道常用于培養Gluconacetobacter屬的HS培養基[12-13]對HEC-004菌株進行培養，結果表明HEC-004菌株在HS培養基中難以生長，說明HEC-004菌株與目前文獻報道的Gluconacetobacter屬其他菌株在代謝生理上存在區別。

不少研究中從自然界中分離產纖維素微生物時采用的均為HS培養基[19]，而該研究中的高產纖維素菌株在該類型中不能生長，這可能導致高產菌株的漏篩，因此該研究結果可為后續菌株篩選提供借鑒。

以往的研究文獻中，產細菌纖維素菌株的基因敲除都是采用帶同源臂的質粒進行轉化[13，16]。該研究嘗試線性化片段進行直接電轉化，也可以得到陽性轉化子，證明了可以通過直接轉線性化片段對G.nataicola進行基因敲除或者敲入。由于線性化片段不會出現單交換克隆子，因此在該研究中，轉化子中采用線性片段進行轉化的雙交換概率大于質粒轉化試驗組（17% vs 6%）。該結果也說明，G.nataicola菌的同源重組概率較低，相對而言，大多數轉化子均發生了非同源重組插入到了基因組的未知位置。在后期研究中，可借助目前廣泛使用的基因編輯方法，在該類菌株中建立基因編輯系統，提高對菌株定向操作的能力。

GDH基因負責編碼G.nataicola菌株中的葡萄糖脫氫酶，使發酵培養基中的葡萄糖變為葡萄糖酸。試驗中敲除GDH后所得到的HEC-33菌株生長速度變慢，產膜速度也變慢，這可能與GDH基因編碼的葡萄糖脫氫酶在葡萄糖脫氫過程中產生還原型PQQ輔酶能促進細胞生長有關[20]，敲除該基因后影響了還原型PQQ的生成，因此菌體生長速度變慢。但是發酵結束時，工程菌株的膜產量比野生型高，推測野生型菌株中葡萄糖酸的產生影響了發酵體系的pH，使得體系過酸，導致后期菌體活力下降，產膜能力受影響。

4 結論

以一株工業化高產細菌纖維素的納塔葡糖酸醋桿菌為對象，研究了其遺傳轉化條件，并敲除了其中與葡萄糖酸生成相關的葡萄糖脫氫酶基因GDH，構建了一株在長周期發酵過程中具有更高產膜能力的工程菌株。

參考文獻

[1] ROSS P，MAYER R，BENZIMAN M.Cellulose biosynthesis and function in bacteria[J].Microbiol reviews，1991，55（1）：35-58.

[2] CZAJA W，KRYSTYNOWICZ A，BIELECKI S，et al.Microbial cellulose-the natural power to heal wounds[J].Biomaterials，2006，27（2）：145-151.

[3] RAJWADE J M，PAKNIKAR K M，KUMBHAR J V.Applications of bacterial cellulose and its composites in biomedicine[J].Applied microbiology and biotechnology，2015，99（6）：2491-2511.

[4] KUCIN'SKALIPKA J，GUBANSKA I，JANIK H.Bacterial cellulose in the field of wound healing and regenerative medicine of skin：Recent trends and future prospectives[J].Polymer bulletin，2015，72（9）：2399-2419.

[5] FU L N，ZHANG Y，LI C，et al.Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method[J].Journal of materials chemistry，2012，22（24）：12349-12357.

[6] CLEENWERCK I，DE VOS P，DE VUYST L.Phylogeny and differentiation of species of the genus Gluconacetobacter and related taxa based on multilocus sequence analyses of housekeeping genes and reclassification of Acetobacter xylinus subsp.sucrofermentans as Gluconacetobacter sucrofermentans （Toyosaki et al.1996） sp.nov.，comb.nov.[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2009，60：2277-2283.

[7] KWAK M H，KIM J E，GO J，et al.Bacterial cellulose membrane produced by Acetobacter sp.A10 for burn wound dressing applications[J].Carbohydrate polymers，2015，122：387-398.

[8] 向東，王錫彬，鐘春燕.不同供氧方式對木醋桿菌培養中生物量的影響[J].現代食品科技，2011，27（8）：873-876.

[9] 吳敏.水溶性多糖對生物合成細菌纖維素的影響[D].海口：海南大學，2011.

[10] 牛成，吳周新，王錫彬，等.木醋桿菌菌株的特性研究[J].海南師范大學學報（自然科學版），2009，22（1）：55-59.

[11] 王志國，韋燕來，韋茂山，等.有機酸在合成培養基中對木醋桿菌合成纖維素的影響[J].食品科學，2008，29（5）：295-297.

[12] CHIEN L J，CHEN H T，YANG P F，et al.Enhancement of cellulose pellicle production by constitutively expressing Vitreoscilla hemoglobin in Acetobacter xylinum[J].Biotechnology progress，2006，22（6）：1598-1603.

[13] KUO C H，TENG H Y，LEE C K.Knockout of glucose dehydrogenase gene in Gluconacetobacter xylinus for bacterial cellulose production enhancement[J].Biotechnology and bioprocess engineering，2015，20（1）：18-25.

[14] FLOREA M，HAGEMANN H，SANTOSA G，et al.Engineering control of bacterial cellulose production using a genetic toolkit and a new celluloseproducing strain[J].Proceedings of the national academy of sciences，2016，113（24）：3431-3440.

[15] SCHRAMM M，HESTRIN S.Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum[J].Journal of general microbiology，1954，11（1）：123-129.

[16] SHIGEMATSU T，TAKAMINE K，KITAZATO M，et al.Cellulose production from glucose using a glucose dehydrogenase gene （gdh）deficient mutant of Gluconacetobacter xylinus and its use for bioconversion of sweet potato pulp[J].Journal of bioscience and bioengineering，2005，99（4）：415-422.

[17] CASTRO C，CLEENWERCK I，TRCEK J，et al.Gluconacetobacter medellinensis sp nov.，cellulose and noncelluloseproducing acetic acid bacteria isolated from vinegar[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2013，63（Pt 3）：1119-1125.

[18] SUNAGAWA N，FUJIWARA T，YODA T，et al.Cellulose complementing factor （Ccp） is a new member of the cellulose synthase complex （terminal complex） in Acetobacter xylinum[J].Journal of bioscience and bioengineering，2013，115（6）：607-612.

[19] AYDIN Y A，AKSOY N D.Utilization of vinegar for isolation of cellulose producing acetic acid bacteria[J].AIP Conference Proceedings，2010，1247（1）：340-348.

[20] DUINE J A，VAN DER MEER R A，GROEN B W.The cofactor pyrroloquinoline quinone[J].Annual review of nutrition，1990，10：297-318.