鎘鉛脅迫對桑樹種子萌發和幼苗生長以及重金屬累積的影響

高鴻鵬　鄭直　劉超　張中羽　董小龍　蘇超　張敏娟

摘要 [目的]研究重金屬脅迫對桑樹種子萌發及幼苗生長的影響，分析桑樹幼苗對重金屬的吸收和累積規律。[方法]以冀桑3號和魯雜1號2個品種桑樹種子和幼苗為材料，采用濾紙萌發法分析重金屬鎘、鉛對2個品種桑樹種子萌發的影響，采用土培盆栽法分析鎘和鉛對2個品種桑樹幼苗生物量的影響及幼苗對鎘和鉛的吸收轉運規律。[結果]桑樹種子萌發受到鎘、鉛的抑制作用，并且鎘和鉛對胚根毒害作用更強。鎘和鉛元素對桑樹種子胚根生長有顯著抑制作用的濃度分別為114、331 mg/L;2個品種幼苗的生物量隨著鎘和鉛處理濃度的升高而降低，冀桑3號幼苗能耐受20 mg/kg的鎘脅迫和500 mg/kg的鉛脅迫而不降低其生物量。2個品種桑樹幼苗對鎘和鉛的吸收水平均隨著鎘、鉛處理濃度的升高而升高;幼苗對鎘的富集系數和轉移系數分別為0.53～3.58和0.41～0.84，對鉛的富集指數和轉移系數分別為0.02～0.58和0.11～0.78。從2個品種的富集系數和轉移系數的對比來看，冀桑3號幼苗與魯雜1號幼苗對鎘、鉛的耐受能力、富集能力存在一定程度的差異，且2個品種幼苗均不能有效地將鎘和鉛轉運至植株地上部分。[結論]該研究可為植物修復重金屬污染提供一定依據，為進一步利用桑樹進行土壤修復奠定一定的理論基礎。

關鍵詞 桑樹;鎘;鉛;累積;生物量

中圖分類號 Q945文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）11-0131-06

Abstract [Objective]To study the effects of heavy metal stress on seed germination，seedling growth and the heavy metals absorption and accumulation of mulberry trees.[Method]Seeds of two mulberry cultivars （Jisang No.3 and Luza No.1） were exposed to five cadmium （Cd） and lead （Pb） concentrations by using petridish method，the germination percentage and root lengths were measured.Seedlings of these two mulberry cultivars were used as materials，the heavy metal treatment was carried out by using potculture method，the biomass and heavy metal content of two mulberry cultivars were examined.[Result]The germination of mulberry seeds was inhibited by lead and cadmium treatment，cadmium and lead had stronger toxic effects on the root elongation of mulberry.The roos of mulberry seeds were significantly inhibited at concentration of 114 mg/L and 331 mg/L for cadmium and lead，respectively;at the cadmium concentration of 20 mg/kg and the lead concentration of 500 mg/kg，mulberry seedlings of Jisang No.3 grew well without reducing biomass.Both of the two mulberry cultivars absorbed more elements with increasing cadmium or lead dose.The bioconcentration factor and transfer factor for cadmium in the two mulberry seedlings ranged from 0.53 to 3.06 and from 0.41 to 0.84，respectively.The bioconcentration factor and transfer factor for lead ranged from 0.02 to 0.58 and 0.11 to 0.78，respectively.By comparing the bioconcentration factor and transfer factor of the two cultivars，we found that there was a certain degree of difference in tolerance and uptake capacity to cadmium and lead between seedlings of Jisang No.3 and Luza No.1，and the two cultivars could not effectively transport cadmium and lead from root to shoot.[Conclusion]These results provided a basis for phytoremediation of heavy metal pollution，and indicated that mulberry can be a candidate for repairing heavy metal contaminated soil.

Key words Mulberry;Cadmium;Lead;Accumulation;Biomass

隨著工業化、城市化進程的加快，近年來土壤重金屬污染問題日益加劇，對人體健康和社會發展造成了一定威脅[1-4]。土壤中重金屬污染以鎘和鉛的污染面積最大、污染程度最甚[5-6]。重金屬污染具有隱蔽性、不可逆和殘留期長等特點，故環境中低濃度的重金屬有可能通過食物鏈的富集而在人體內蓄積，從而破壞人體正常代謝活動，損害人體健康[7]。因此，土壤重金屬污染的修復研究已迫在眉睫。

生物修復作為一種費用低、環境危害小、無二次污染的新興技術，在土壤重金屬污染治理方面具有廣闊前景[8]。其中，植物修復技術通過植物固定、植物轉移和植物分解來修復污染土壤和水體，已成為一種新興的高效生物修復技術，且植物修復具有良好的社會、生態綜合效益，因而易被大眾接受。生物修復綜合技術將是今后重金屬污染土壤修復技術的主要研究方向[9-10]。當前，尋找高效、經濟和適宜的修復植物已成為廣泛利用植物修復技術治理土壤重金屬污染的關鍵。目前已經發現的重金屬超累積植物超過500種，然而，這些超累積植物的不足之處在于其多為草本植物，生長緩慢且生物量小[8]，從而限制了其在重金屬污染土壤修復中的廣泛應用。除超累積植物外，將生物量大、生長迅速且具有一定經濟價值的灌木或喬木用于土壤污染修復將具有極大優勢[11]。

桑樹是一種在我國栽培歷史悠久、地域分布廣泛的經濟樹木，其生長速度快、耐剪伐并可適應多種不良環境，近年來已逐漸被用于生態治理[12]。該研究擬通過對重金屬脅迫下桑樹種子的發芽率、幼芽生長以及重金屬鎘、鉛脅迫對桑樹幼苗生物量的影響及幼苗吸收和轉運重金屬的規律進行分析，以期為進一步利用桑樹進行土壤修復奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以冀桑3號和魯雜1號種子和實生桑樹幼苗為材料。重金屬鎘和鉛的供源分別為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）和硝酸鉛[Pb（NO3）2]，購自天津市科密歐化學試劑有限公司。育苗基質購自山東壽光天豐園藝材料廠，基質中有機物含量≥30%，育苗基質的鎘、鉛含量本底值分別為1.05、15.00 mg/kg。

1.2 種子萌發

將種子清洗干凈，自來水浸泡過夜，選取飽滿種子以75%乙醇和次氯酸鈉溶液（有效氯含量為1%）對種子進行表面消毒。75%乙醇浸泡5 min，無菌水洗3次，以次氯酸鈉溶液浸泡30 min，無菌水沖洗3次，最后一次浸泡5 min，吹干，置于鋪有3層濾紙的培養皿中。對魯雜1號、冀桑3號種子分別進行鎘、鉛脅迫處理，設置鎘處理濃度為0、23、114、228、685、1 141 mg/L，設置鉛處理濃度為0、331、993、1 656、2 318、2 980 mg/L，對照組添加無菌水，每皿30粒種子，3次重復處理。25 ℃恒溫溫室無菌培養種子，光暗周期為14/12 h。以胚芽或胚根長度達到種子長度1/2時開始每天記錄種子發芽數，待發芽結束后，以數顯卡尺測量根長，計算發芽率，公式如下：

發芽率=供試種子的發芽數/供試種子數×100%

1.3 幼苗種植和脅迫處理

采用基質培養方法對2個品種桑樹幼苗進行重金屬鎘和鉛脅迫耐受性試驗。在育苗盆中挑選1月齡長勢一致、無病蟲害、生長良好的實生桑樹幼苗（平均株高5 cm，平均基部莖直徑1.96 mm），將其轉移到盛有等質量育苗基質的37 cm×24 cm×11 cm塑料方盆中進行培養，隔天澆水1次，待幼苗穩定生長至株高約15 cm，基部莖直徑約2.30 mm時，進行重金屬脅迫試驗。鉛脅迫處理設置4個濃度梯度，使基質中鉛的終濃度分別為CK，500、1 000、2 000 mg/kg，鎘脅迫處理設置4個濃度梯度，使基質中鎘的終濃度分別為CK，20、50、100 mg/kg，對2個品種幼苗進行4水平5重復處理。控制每盆裝有相等干重的基質，計算每組重金屬處理所需的重金屬的量，每個處理按照不同重金屬濃度配成溶液一次性澆灌基質，待水分蒸發之后攪拌均勻，再澆透水，移栽幼苗。將幼苗置于溫室之中進行恒溫光照培養（25～28 ?℃，光暗周期為10/14 h），正常澆水及護理。重金屬脅迫處理30 d后，將重金屬脅迫處理的桑樹幼苗從基質中取出，自來水反復沖洗后蒸餾水沖洗干凈用濾紙吸干。用剪刀將根和地上部分分開，分別測量地下部分和地上部分鮮重，再將地上部分與地下部分分別裝入無紡布袋中，在80 ℃烘箱中烘干直至恒重，取出樣品測量干重。之后將樣品取出，用研缽磨成粉末保存。

1.4 植物樣品的消化及鎘鉛含量的測定

干粉樣品采用濕法消化，稱取0.200 0 g的樣品于消解管中，加10 mL混合酸（硝酸∶高氯酸=4∶1），將消解管放入消解爐中，設置溫度為100 ℃，緩慢加熱，使樣品充分消解，保持100 ℃ 40 ?min，升溫到230 ℃，此時消解管中充滿紅棕色濃煙，保持60 ?min，待消解至溶液透明，呈無色或淡黃色。取下冷卻至常溫，45 μm微孔濾膜過濾，用超純水定容到25 ?mL。采用石墨爐火焰原子法（火焰石墨爐原子吸收光譜儀，日本日立，Z-2000型）測定植物各部分的鎘、鉛含量[13]。

1.5 轉移系數和富集系數的計算 植物將重金屬從地下部分轉移至地上部分的能力即為轉移系數（TF）：

TF=地上部分（莖葉）平均重金屬濃度/地下部分重金屬濃度

植物不同部位積累重金屬的能力即為生物富集系數（BCF）：

BCF=根或地上部分（莖葉）平均重金屬濃度/土壤重金屬終濃度

1.6 數據處理 數據處理及方差分析采用Excel 2003和SPSS16.0軟件進行，柱形圖用Excel 2003制作，箱式圖用OriginV8.0制作。

2 結果與分析

2.1 鎘和鉛對桑樹種子萌發和胚根伸長的影響

鎘、鉛對桑樹種子萌發的抑制作用隨著其濃度的提高而增強，高濃度重金屬脅迫下，桑樹種子的發芽率顯著下降。與對照組相比，23 mg/L 鎘處理后桑樹種子的發芽率沒有顯著下降，隨著鎘濃度從114 ?mg/L升高到228 ?mg/L，魯雜1號種子發芽率從88%降低到62%，而冀桑3號種子發芽率從88%降低到31%（圖1a）。魯雜1號和冀桑3號發芽抑制率超過50%的鎘濃度分別為685、228 ?mg/L，說明冀桑3號種子對高濃度鎘毒害的耐受性較魯雜1號差。鉛濃度低于1 656 ?mg/L，對魯雜1號和冀桑3號種子的發芽率沒有影響（圖1b）;當鉛濃度分別為2 318、2 980 ?mg/L時，魯雜1號種子的發芽率分別降了5、9百分點，冀桑3號種子的發芽率分別降低了7、11百分點，說明高濃度的鉛處理對桑樹種子萌發的影響不顯著。

隨著重金屬脅迫濃度的升高，桑樹種子胚根長度逐漸減小，說明重金屬處理對桑樹胚根的伸長產生抑制作用，重金屬元素對桑樹種子胚根伸長的抑制作用較胚芽強，因此胚根長度更適合作為衡量桑樹種子重金屬傷害的指標。與對照組相比，23 ?mg/L 鎘處理后冀桑3號和魯雜1號種子的胚根長度分別下降至對照的49.62%和65.62%，114 ?mg/L鎘處理后冀桑3號和魯雜1號種子的胚根長度分別下降至對照的0.41%和1.14%（圖2a和2b）。當鉛處理濃度為331 mg/L時，冀桑3號和魯雜1號種子的胚根長度分別下降至對照的51.73%和36.40%，隨著鉛濃度從993 mg/L升高至1 656 mg/L，冀桑3號和魯雜1號種子胚根長度的降幅從37.74%和25.65%下降至10.31%和8.36%，當鉛處理濃度為2 980 ?mg/L時，冀桑3號和魯雜1號種子的胚根基本停止生長（圖2c和2d）。

2.2 鎘和鉛對桑樹幼苗生物量的影響

由表1可知，20 mg/kg鎘處理使得冀桑3號幼苗地上部分和地下部分干重比對

照分別增加了63.06%和47.15%;魯雜1號幼苗地上部分干重比對照增加了12.64%，但差

異不顯著（P>0.05），而地下部分干重下降了26.96%;魯雜1號幼苗整株生物量下降了3.91%，冀桑3號幼苗整株生物量增加了57.55%。隨著鎘濃度的增加，魯雜1號幼苗與冀桑3號幼苗的生物量均有降低。當鎘濃度為50 mg/kg時，魯雜1號幼苗、冀桑3號幼苗的地上部分和地下部分干重較對照分別下降了31.50%、65.88%和21.02%、41.85%，整株生物量分別下降了46.75%和28.37% （表 1）。當鎘濃度為100 mg/kg時，魯雜1號和冀桑3號幼苗的地上和地下部分干重較對照分別下降了64.88%、69.37%和34.72%、52.31%，整株生物量分別下降了66.87%和40.87%。上述結果表明，冀桑3號幼苗對鎘處理的響應呈現“低促高抑”現象，與對照生物量相比，20 mg/kg鎘處理下冀桑3號幼苗生物量顯著增加（P<0.05），而魯雜1號幼苗生物量則有所下降，但無顯著差異（P>0.05）;隨著鎘處理濃度的升高，魯雜1號幼苗生物量的下降幅度較冀桑3號幼苗更大，表明鎘脅迫對魯雜1號幼苗的傷害更為嚴重，并首先對其根部造成傷害。

由表2可知，鉛處理下桑樹幼苗的生物量隨著鉛濃度的升高而下降，500 mg/kg 鉛處理使魯雜1號幼苗的地上部分干重增加了2.29%，但無顯著性差異（P>0.05），而地下部分干重下降了48.17%，且達到顯著水平（P<0.05）;冀桑3號幼苗在500 mg/kg鉛脅迫下，其地上部分和地下部分干重分別下降了26.80%和10.05%;魯雜1號和冀桑3號幼苗的整株生物量分別下降了20.09%和20.80%。 當鉛處理濃度從1 000 mg/kg增加到2 000 mg/kg 時，冀桑3號幼苗的地上部分干重和地下部分干重的下降比例分別從40.71% 和31.11% 增加到70.84% 和50.14%，整株生物量從37.33%下降到63.54%;魯雜1號幼苗的地上部分和地下部分干重的下降比例分別從24.76% 和62.37%增加到54.31% 和87.53%，整株生物量從41.44%下降到69.04%。以上結果表明，500 mg/kg鉛處理對桑樹幼苗的生長造成了一定程度的傷害，1 000 mg/kg鉛處理嚴重影響了桑樹幼苗生長。與冀桑3號幼苗相比，魯雜1號幼苗的根對鉛處理更為敏感，隨著處理濃度的升高，魯雜1號幼苗的根受到更為嚴重的傷害，而在幼苗根部受到嚴重傷害的時候，根對水分和養分的吸收功能受到限制，進而使幼苗地上部分生長受到影響。

2.3 桑樹幼苗對鎘和鉛的吸收和富集

隨著土壤中鎘濃度的升高，2個品種桑樹幼苗地上部分和地下部分鎘含量呈增長趨勢，且存在劑量效應（表3）。當鎘濃度達50 mg/kg時，冀桑3號幼苗地上、地下部分的鎘含量較對照顯著增加（P<0.05），而魯雜1號幼苗地上部分鎘含量顯著升高（P<0.05）;當鎘濃度達100 mg/kg時，魯雜1號與冀桑3號幼苗中鎘含量均有顯著差異（P<0.05），且魯雜1號的地上部分和地下部分重金屬鎘含量高于冀桑3號。

與對照相比，魯雜1號和冀桑3號幼苗地上、地下部分的鉛含量隨著鉛處理濃度的升高而增加（表4）。重金屬鉛處理后，2個品種桑樹幼苗地下部分對于重金屬的富集量要高于地上部分，表明植物的地下部分積累了大量的重金屬鉛，但是很難向地上部分轉運。植物通過自身的防御機制限制重金屬離子的跨膜運輸和轉移，阻止重金屬往地上部分轉移，從而在整體上減少植物體內重金屬含量，可以有效地減輕重金屬對于植物的毒害作用。

2.4 桑樹幼苗對鎘和鉛的轉移系數及富集系數

由表3可知，2個品種桑樹對重金屬鎘的富集指數均高于0.5，并隨著鎘處理濃度的升高呈增加趨勢，且地下部分富集指數高于地上部分。魯雜1號對鎘的富集指數為0.53～3.06，冀桑3號對鎘的富集指數為0.66～1.85，說明魯雜1號和冀桑3號富集重金屬鎘的能力相近。在20 mg/kg鎘脅迫下，冀桑3號對鎘的富集指數大于魯雜1號;而鎘濃度為100 mg/kg時，魯雜1號對鎘的富集指數大于冀桑3號，說明不同植物品種、不同部位都影響著植物對重金屬的富集作用。冀桑3號對重金屬鎘的轉移系數隨著鎘處理濃度的升高而降低，在鎘濃度為20 mg/kg時轉移系數為0.74，鎘濃度為100 mg/kg時轉移系數降為0.41。以上結果表明，隨著鎘濃度的升高，鎘對桑樹的毒害作用加強，而植株上部鎘含量遠低于地下部分，可能是植物利用自身的保護機制阻止了鎘向植株地上部分的擴散。

由表4可知，魯雜1號和冀桑3號對鉛的富集系數分別為0.06～0.58、0.02～0.30。魯雜1號和冀桑3號對鉛的富集系數隨著鉛處理濃度的升高而降低，且地下部分富集系數高于地上部分;地上部分的富集指數平均值分別為0.11和0.10，地下部分的富集指數平均值分別為0.36和0.21。當土壤中鉛濃度為500 mg/kg時2個品種對鉛的富集系數達到了最大值，表明鉛濃度過高對植物的毒害作用加劇，植物體內的各種轉運和解毒機制被破壞，無法正常生長，這與桑樹在高濃度鉛脅迫下生物量的顯著降低（P<0.05）相一致。

3 討論

重金屬元素對植物的傷害體現在低濃度時抑制植物生長發育，高濃度致使植物死亡，并且重金屬對植物胚根的毒害作用較胚芽強。研究表明，不同種類的植物種子能夠耐受的同種重金屬濃度差異較大，同一類植物的重金屬耐受性存在品種間差異[14-15]。4 mg/L鎘脅迫下堿蓬的發芽率下降54%，而0.5 mg/L鎘處理就能使其根長抑制率高于50%[16]。10 μmol/L 鎘處理后甘藍型油菜的發芽率降低3.5%，根長抑制率為15.4%;90 μmol/L 鎘處理后甘藍型油菜的發芽率降低20.7%，根長抑制率為28.0%[17]。50 mg/L鎘處理后，云南松、榿木、紅椿、五小葉槭種子的發芽率分別為77.3%、48.0%、29.3%、8.7%[18]。鄧恩桉和直桿藍桉在0.5 mg/kg 鎘脅迫下，發芽率分別為94.1%和85.0%，根長抑制率分別為18.6%和18.7%，而本沁桉、巨桉的發芽率分別為105%和95%，根長抑制率分別為5.9%和33.3%，4個品種桉樹之間有顯著差異[19]。陳露等[20]分析了10個桑樹品種對鎘脅迫的耐受性，結果表明50 mg/L鎘處理下，鎘耐受型品種桂桑6號的發芽率為74.5%，耐受性居中的品種桂桑特優12號和69851的發芽率分別為44.0%和48.5%，而鎘敏感品種沙2×倫109的發芽率僅為4.0%。與龍葵和桉樹相比，相同根長抑制率下，桑樹種子能夠耐受的鎘濃度較高，鎘對甘藍型油菜發芽率的抑制作用較桑樹強，對胚根伸長的抑制作用較桑樹弱。文獻報道，能夠使種子根長抑制率高于50%的鉛濃度分別為500 mg/L （麻瘋樹、玉米）[21-22]、300 mg/L（毛竹）[23]、260 mg/L （小白菜）[24]、1.5 mmol/L（小麥）[25]。桑樹種子對鉛的耐受性較麻瘋樹、小麥和玉米弱，與毛竹相當，較小白菜強。與已報道的植物相比，桑樹種子對2種重金屬元素的耐受性較強，具有作為重金屬污染修復植物的潛力。

土壤重金屬污染是亟待解決的環境問題，土壤的鎘、鉛污染問題尤為嚴峻，因此，分析植物重金屬吸收特性，篩選適宜的植物對重金屬污染土壤進行修復是最佳的選擇[26]。植物生物量可以作為生長在重金屬污染土壤里植物健康的一個標志，高生物量、強耐受性和積累能力強的作物在植物修復中具有廣闊的前景[11，27-29]。在現有高生物量植物中，不降低其生物量而提高重金屬的積累是最為可行的策略，成為研究的熱點。飼料桑品種桂桑優系列和粵桑優系列的一年生樹苗，其地上部分干重可達18 900 kg/hm2;四年生強桑1號樹苗地上部分鮮重可達34 425 kg/hm2[30-31]。因此，桑樹作為一種生長快速的經濟樹木，完全滿足高生物量植物的條件。

轉移系數大于1被認為是重金屬超累積植物的標志，而富集系數和轉移系數均大于1的植物，即地上部分重金屬含量高于地下部分重金屬含量且高于土壤重金屬含量的植物才具有修復重金屬污染的價值[32]。2個品種桑樹幼苗地上部分和地下部分對鎘和鉛的富集系數隨著鎘、鉛處理濃度的升高而降低，2個品種桑樹幼苗地下部分比地上部分富集系數更高，說明桑樹幼苗對重金屬鎘、鉛有一定的吸收能力，且根部富集能力更強。魯雜1號和冀桑3號對重金屬鎘的轉移系數為0.23～0.84，對重金屬鉛的轉移系數為0.11～0.78，這說明桑樹幼苗將鎘、鉛轉移至地上部分的能力較弱。綜上所述，2個桑樹品種幼苗對鎘、鉛具有較強的耐受性和吸收能力，且2種重金屬元素均不能被有效轉運至植株地上部分，魯雜1號和冀桑3號幼苗在不同濃度的重金屬鎘和鉛處理下，其吸收和轉運重金屬的能力有不同程度的差異。

4 結論

大型木本植物生物量大，壽命長，易護理，且一般的喬木綠化樹種不會進入食物鏈，也避免了重金屬污染，尤其是樹干部位，可長期穩固并儲存大量重金屬元素，因此成為較為理想的重金屬修復樹種[26]。根據中華人民共和國國家標準土壤環境質量標準（GB15618—1995）三級限值，保障農林生產和植物正常生長的土壤鎘、鉛含量臨界值分別為1.0、500 mg/kg。而桑樹2月齡幼苗對重金屬鎘的吸收能力達到土壤三級污染限值的20倍，對鉛的吸收水平也能達到土壤三級污染限值，作為一個大生物量植物，桑樹在重金屬鎘、鉛污染土壤的治理方面有一定的應用潛力。幾千年來，桑樹主要作為家蠶飼料而存在，隨著桑產業的振興，桑樹的生態價值受到廣泛關注，除此之外，桑樹的食用和藥用價值也不容忽視，因此，桑樹作為重金屬污染治理樹種時，要謹慎處理并避免食用、藥用方向的產品開發，以免其進入食物鏈，損害人體健康。