體外構建工程化汗腺類器官的初步研究

陳潤開，付小兵，孫曉艷*

1天津醫科大學研究生院，天津 300070；2解放軍總醫院醫學創新研究部創傷修復與組織再生研究中心，北京 100853；3解放軍總醫院第四醫學中心組織修復與再生全軍重點研究實驗室，北京 100048

作為人體最重要的皮膚附屬器之一，汗腺在維持機體代謝平衡方面具有不可替代的作用。大面積燒傷、嚴重撕脫傷患者創面瘢痕愈合后汗腺的結構和功能缺失，致使機體無法通過汗液蒸發進行體溫調節，嚴重影響了患者的生存質量。研究表明，外胚層發育不全(ectodysplasin，EDA)基因是汗腺發育過程中的主要功能基因之一[1]。在胚胎發育時期，EDA通過激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)與EDA受體聯合調節汗腺的發育與成熟[2]，因此EDA可作為汗腺再生的治療性靶點進行干預。目前，第三代基因編輯技術CRISPR/Cas9系統已經成為細胞重編程最熱門的手段之一[3]，利用該技術可以跨譜系重編程成體細胞為另一類型的成體細胞，具有效率高、脫靶率低等優勢。在此基礎上，Kearns等[4]開發了一種受強力霉素(doxycycline，Dox)調控的dCas9-effector系統，該系統由dCas9與VP16四聚體激活結構域(VP64)融合而成，使目的基因的表達更加受控。類器官是一種高度還原原位組織生理結構及功能的新型微器官模型，由具有干性的細胞在三維條件下自我組裝形成[5]。類器官體系克服了細胞二維培養模式的局限性，盡可能地還原了器官發育過程[6-8]，具有傳統方式無法比擬的優勢。本研究擬利用CRISPR/dCas9系統靶向EDA啟動子序列，上調內源性EDA基因的表達水平，將人永生化表皮角質細胞重編程為汗腺樣細胞，在體外三維環境下培養誘導其發育為汗腺類器官，以促進體內汗腺的功能性再生。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人永生化表皮細胞系(human immortalized keratinocyte，HaCaT)、293T細胞購買于國家實驗細胞資源共享服務平臺；SPF級BALB/c雌性裸鼠(20只)購自斯貝福(北京)生物技術有限公司；Dulbecco's Modified Eagle's F12培養基、Epilife培養基、HKGS購自美國Gibco公司；Real Master Mix(SYBR Green)購自日本TOYOBO公司；角蛋白18(cytokeratin，CK18)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、EDA、水通道蛋白5(aquaporin 5，AQP5)、GAPDH一抗購自美國Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Matrigel購自美國康寧公司。dCas9質粒(含neo位點)、psPAX2、pMD2.G包裝質粒由本實驗室保存。EDA基因啟動子(正義：5'-ACCCGTTCCTGCGCGACAG-3'；反義：5'-CTGTCGCGCAGGAACGGGT-3')由本實驗室提供。單鏈向導RNA(sgRNA)質粒由蘇州吉瑪基因公司負責構建。

1.2病毒包裝與收集 293T細胞在DMEM完全培養基中培養。將dCas9質粒和構建完成的sgRNA質粒分別與慢病毒psPAX2、pMD2.G包裝質粒按3:1:4質量比混合，使用Lip 2000共轉染293T細胞，培養6 h后更換為完全培養基，培養48、72 h后分別收集細胞上清液，過濾，-80 ℃保存備用。

1.3細胞轉染與篩選 HaCaT細胞在含1% HKGS的Epilife培養基中培養。HaCaT細胞接種于10 cm培養皿，待細胞融合度達40%時更換為含10 μg/ml聚凝胺的新鮮培養基6 ml孵育0.5 h，隨后加入6 ml含有sgRNA質粒的病毒液繼續孵育，12 h后更換為新鮮培養基。48 h后觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達情況，并采用熒光激活細胞分選技術篩選出GFP陽性細胞。在此基礎上，重復上述步驟進行dCas9質粒包裝、轉染，400 μg/ml的G418培養7 d后篩選出雙陽性細胞，并命名為HaCaT-E細胞。

1.4RT-PCR、Western blotting檢測EDA表達水平 汗腺培養基的組成如前期研究所示[9]。將細胞分為4組：HaCaT組(HaCaT細胞使用汗腺培養基培養)、HaCaT+Dox組(HaCaT細胞使用含5 μg/ml Dox的汗腺培養基培養)、HaCaT-E組(HaCaT-E細胞使用汗腺培養基培養)、HaCaT-E+Dox組(HaCaT-E細胞使用含5 μg/ml Dox的汗腺培養基培養)。誘導培養7 d后收集各組細胞，Trizol裂解提取RNA，并反轉錄為cDNA。RT-PCR：按照Real Master Mix 10 μl、上下游引物各1 μl、cDNA模板2 μl、ddH2O補足20 μl配制反應體系。反應條件為：95 ℃ 2 min預變性；95 ℃ 30 s、60 ℃ 40 s，40個循環后進行熔鏈分析。引物序列如下(5'→3')；EDA：F-GGACGGCACCTA CTTCATCT，R-TGTAGTTGGTCTTGCCCGTC；GAPDH：F-CTGGAAGATGGTGATGGGATT，R-TGTGAAGGTCGGAGTCAACGGAT。Western blotting檢測EDA蛋白的表達：細胞經RAPI裂解提取總蛋白；熱變性后，行SDS-PAGE電泳；轉膜后浸沒于5%脫脂奶粉室溫封閉0.5 h，抗體孵育后進行檢測。一抗為EDA(兔抗，1:1000)、GAPDH(鼠抗，1:1000)。

1.5經誘導后HaCaT-E的細胞免疫熒光染色 由于汗腺培養基及Dox均不能誘導HaCaT細胞，因此后續實驗均使用HaCaT-E細胞進行。HaCaT-E細胞鋪板于24孔板，HaCaT-E組細胞使用不含Dox的汗腺培養基培養，HaCaT-E+Dox組細胞使用含Dox的汗腺培養基培養。培養7 d后，使用預冷的4%多聚甲醛固定0.5 h；PBS洗滌3次，每次5 min；0.2% TritonX-100室溫孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min；5%山羊血清室溫封閉30 min，一抗CK18(鼠抗，1:500)、α-SMA(兔抗，1:200)、AQP5(兔抗，1:200)4 ℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；二抗(1:100)室溫避光孵育2 h；PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI復染封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6汗腺類器官的體外構建與免疫熒光染色 Matrigel提前解凍，重懸HaCaT-E細胞并調整細胞濃度為5×106/ml，與Matrigel按1:9混合均勻后，置于預冷的24孔板中，37 ℃孵育30 min使其凝固。HaCaT-E+Dox組加入含Dox的汗腺培養基300 μl，HaCaT-E組加入同體積不含Dox的汗腺培養基，孵育培養7 d后，收集實驗組細胞團，4%多聚甲醛固定并進行免疫熒光染色，染色步驟、抗體同1.5。

1.7燙傷模型的建立及多細胞結構的移植 20只裸鼠隨機均分為治療組與對照組，每組10只。小鼠腳掌常規消毒，采用金屬燙傷儀85 ℃接觸5 s造成深Ⅱ度燙傷，迅速浸沒于冰水中，觀察見掌墊發白變性為建模成功[10]。收集誘導7 d的汗腺類器官，按5×105個/ml重懸于含Dox的汗腺培養基中，采取多點注射方式將類器官混懸液(50 μl)注射到治療組小鼠燙傷創面皮下。對照組按相同方式注射同體積的汗腺培養基。24 h后重復注射一次。治療組及對照組小鼠飼喂含Dox(2 μg/kg)的維持飼料，同時按100 g/kg體重的劑量腹腔注射10 mg/ml的Dox溶 液[11]，每5天重復注射一次。

1.8碘-淀粉發汗實驗及組織免疫熒光染色 移植實驗后4周，將碘酒均勻涂抹于小鼠燙傷掌面并充分干燥。將小鼠置于鋪滿淀粉的鼠籠中，使掌墊與淀粉充分接觸，于掌墊皮下注射100 μmol/L乙酰膽堿50 μl，5 min后觀察掌墊表面淀粉顏色變化，出現散在的藍黑色斑點為發汗實驗陽性。發汗實驗后取鼠掌組織固定、包埋后石蠟切片。脫蠟后切片進行抗原修復，5%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗CK18(1:500)、α-SMA(1:200)，4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，每次5 min；熒光二抗避光室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min。DAPI復染封片，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.9統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1質粒轉染及陽性細胞篩選 轉染sgRNA質粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察可見GFP陽性細胞散在表達，陽性率為51.0%±2.1%。GFP陽性細胞轉染dCas9質粒后，在添加G418抗生素(400 μg/ml)的培養基中繼續篩選7 d，挑取陽性克隆(47.1%±1.8%)進行擴增培養，獲得HaCaT-E細胞。

2.2RT-PCR、Western blotting檢測EDA的表達 RT-PCR檢測結果顯示，汗腺培養基誘導7 d后，與HaCaT組比較，HaCaT-E+Dox組細胞中EDA mRNA的表達水平上調(4.62±0.19)倍，差異有統計學意義(P<0.05)，而HaCaT+Dox組及HaCaT-E組的EDA表達水平未見明顯上調(P>0.05，圖1A)。Western blotting檢測結果顯示，HaCaT組、HaCaT+Dox組、HaCaT-E組及HaCaT-E+Dox組的EDA蛋白表達趨勢與RT-PCR檢測結果基本一致(圖1B)。

2.3H a C aT-E 細胞的形態特征及表型鑒定 HaCaT-E細胞在不含DOX的汗腺培養體系中形態變化不明顯。加入5 μg/ml Dox孵育培養7 d后，其胞體呈長梭形改變，并出現網絡樣生長趨勢(圖2)。免疫熒光染色結果顯示，誘導培養后HaCaT-E細胞表達汗腺表面標記物CK18、AQP5、α-SMA為陽性(圖3)。

圖1 經誘導培養后4組細胞中EDA mRNA(A)及蛋白(B)表達水平比較Fig.1 Expression levels of EDA mRNA(A) and protein (B) in HaCaT-E cells after induction culture

圖2 HaCaT-E組(A)及HaCaT-E+Dox組(B)細胞誘導培養7 d后的形態對比(倒置顯微鏡)Fig.2 Comparison of morphological changes between the HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) after 7 days induction culture (Inverted microscope)

2.4汗腺類器官的結構特征及表型鑒定 將HaCaT-E與Matrigel混合，采用含Dox的汗腺培養基誘導培養7 d后，細胞增殖、發育形成多細胞團狀球體結構，鏡下可見其體積增大，具有中空囊腔樣結構。而HaCaT-E組由于培養體系中不含Dox，無法啟動內源性EDA基因的表達，因此誘導培養至第4天時，細胞團表現出增殖遲滯，形態崩解，不能長期維持多細胞的球體結構(圖4)。免疫熒光染色結果顯示，HaCaT-E+Dox組中多細胞球體結構表達汗腺標記物CK18、α-SMA、AQP5(圖5)。

2.5汗腺類器官促進體內汗腺的功能性修復 給予乙酰膽堿刺激后，治療組與對照組小鼠腳掌的發汗情況有明顯差異。大體觀察可見治療組小鼠掌墊表面有少量散在分布的藍黑色斑點，為發汗實驗陽性表現；對照組掌墊均為陰性表現(圖6)。發汗實驗陽性掌墊組織切片免疫熒光染色結果顯示，其表皮增厚，層數增多，基底層及亞基底層分布著大量表達GFP的工程化細胞，真皮深層及皮下組織內散在分布著管腺樣結構，同時表達GFP及汗腺標志性蛋白CK18及α-SMA；對照組則無上述改變， 且表皮基底層光滑，呈現典型的燙傷后愈合形態(圖7)。

圖3 HaCaT-E組(A)與HaCaT-E+Dox組(B)誘導培養7 d后汗腺表面標志物對比Fig.3 Comparison of sweat gland-associated proteins in HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) after 7 days induction culture

圖4 HaCaT-E組(A)及 HaCaT-E+Dox組(B)汗腺類器官形態特點(倒置顯微鏡)Fig.4 Morphological characteristics of sweat gland organoids in HaCaT-E (A) and HaCaT-E+Dox group (B) (Inverted microscope)

圖5 CK18(A)、α-SMA(B)、AQP5(C)在汗腺類器官中的表達Fig.5 Expressions of CK18 (A), α-SMA (B), AQP5 (C) in sweat gland organoids

圖6 對照組(A)及治療組(B)裸鼠掌墊移植汗腺類器官4周后碘-淀粉發汗實驗大體觀察結果Fig.6 General observation of sweating test 4 weeks after transplantation with sweat gland organoids in nude mice of control group (A) and treatment group (B)

圖7 對照組(A)及治療組(B)碘-淀粉發汗實驗陽性腳掌組織的免疫熒光染色結果Fig.7 IF staining of sweat gland-related markers in nude mice of control group (A) and treatment group (B) engrafted with sweat gland organoids

3 討 論

大面積燒傷及嚴重創傷患者由于創面瘢痕愈合導致汗腺結構損毀或導管堵塞，從而喪失了泌汗功能，嚴重影響了患者的生存質量，給患者的生理和心理帶來了巨大的創傷。目前，汗腺的功能性修復是再生醫學研究的熱點及難點。在前期工作中，本課題組將骨髓間充質干細胞與汗腺細胞共培養，成功誘導其定向分化為汗腺樣細胞[9]。人體移植實驗表明，這些誘導而來的汗腺樣細胞不但可以促進創面內汗腺的結構修復，再生的汗腺還具備排汗功能。此外，Sun等[12]采用CRISPR/dCas9技術上調EDA在骨髓間充質干細胞內的表達，在體外重編程其為汗腺樣細胞，重編程而來的汗腺細胞在獲得汗腺表型的同時，還能在體內促進小鼠創面的功能性修復。

汗腺再生是一個復雜的生物學過程，由多種細胞、多種因子及細胞外基質組分共同參與。然而種子細胞獲取困難，且缺乏允許汗腺生存的微環境是研究者面臨的重要挑戰。為解決這一難題，研究者開始探索新的治療策略，如采用生長因子、基因治療、干細胞移植及智能生物材料等。類器官是當前生物醫藥及組織工程研究的前沿領域。相較于采用干細胞移植促進皮膚附屬器再生的傳統方法，類器官技術在構建汗腺原基初級形態及基本功能的基礎上，更加準確地模擬了胚胎時期汗腺的起始、延伸、發育及成熟過程。如Klaka等[13]采用懸滴培養法在體外構建類汗腺三維立體模型，高度模擬了汗液分泌的生理學過程；Liu等[14]借助3D打印仿生技術構建具有自組裝功能的類汗腺組織，模擬汗腺的自然發育進程；Diao等[15]將分離獲得的汗腺細胞與Matrigel進行混合培養，構建汗腺類器官，并成功實現了體內汗腺的修復與再生。但是此類方法均為采用汗腺組織細胞來構筑類器官，而大面積燒創傷患者的汗腺細胞獲取困難，移植后不易存活，不利于開展大規模的臨床應用。相比之下，表皮細胞來源廣泛，容易獲得，且與汗腺同屬外胚層來源。因此，利用表皮細胞再生汗腺大大降低了跨譜系的難度，同時解決了種子細胞獲取困難的問題。本研究以HaCaT細胞作為種子修復細胞，采用CRISPR/dCas9技術上調內源性EDA的表達，誘導其跨譜系重編程為汗腺樣細胞，隨后采用Matrigel作為主體支架與重編程而來的汗腺樣細胞進行混合培養，在體外構建汗腺類器官。該汗腺類器官構建技術克服了傳統二維平面培養的局限性，最大程度模擬了體內三維空間環境中細胞-細胞間、細胞-細胞外基質間的相互作用，為在三維立體空間內模擬汗腺的生理微環境，研究汗腺的發育、再生、疾病建模提供了基礎。

此外，本研究在移植實驗中發現，GFP陽性細胞在表皮層及其下方的真皮、皮下組織內均有分布。真皮及皮下組織內分布的GFP陽性細胞形成管腺狀結構，并且表達汗腺相關蛋白(如CK18、α-SMA等)，表明汗腺類器官不但參與了創面的再上皮化，還能促進汗腺組織學結構的修復與再生。同時碘-淀粉實驗結果進一步提示，汗腺類器官移植能夠促進創面的功能性修復，再生的汗腺具有發汗功能。因此，利用譜系重編程結合類器官三維培養技術構建工程化的汗腺類器官具有可行性，為實現汗腺再生、解決皮膚的功能性修復問題提供了新的思路。

本研究雖然實現了裸鼠體內汗腺再生，但該體系能否穩定地保持遺傳學特性，汗腺功能能否長期高標準的維持仍需進一步研究。此外，進一步優化體外培養環境，使用組織工程皮膚等仿生程度更高的生物材料替代Matrigel進行汗腺類器官培養，是今后值得探討的問題。