滋脾通絡方對糖尿病腎病大鼠的療效及作用機制

程亞偉，邱曉堂，丁一，吳小翠，張永杰

海南省中醫院治未病中心，?？?570203

在我國，糖尿病(diabetes mellitus，DM)是僅次于高血壓的第二大慢性疾病[1-2]，其慢性并發癥對患者的生活質量造成極大影響。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是DM的常見并發癥，是終末期腎病的主要病因[3]。DN患者存在復雜的糖脂代謝紊亂、氧化應激反應、血液高凝狀態、腎臟毛細血管功能受損等問題[4]。中醫學認為，DN歸屬于“消渴”“消癉”“水腫”“關格”等范疇，“從脾論治”是其主要的治療觀點之一[5]。滋脾通絡方主要成分為黃芪、當歸、赤芍、川牛膝等，有滋陰補氣、活血通絡的作用。據海南省中醫院治未病中心10余年的臨床應用反饋，該方可改善DN患者的血糖水平及腎功能[6]。本研究使用滋脾通絡方治療DN模型大鼠，探究其治療DN的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗儀器與試劑 H2050R-1型高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；AL204型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；卓越金采血糖儀[羅氏診斷產品(上海)有限公司]；SA-6000型全自動血流變測試儀(北京賽科希德科技發展有限公司)；BK-400型全自動生化分析儀(BIOBASE博科控股集團有限公司)。鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)、羧甲基纖維素鈉、枸櫞酸、枸櫞酸三鈉(杭州天動立化學品有限公司)，其余試劑均為分析純。

1.2實驗藥品 根據動物體表面積比率換算，每千克大鼠體重對應藥量為：黃芪4.50 g，山藥1.80 g，當歸1.80 g，赤芍1.35 g，懷牛膝1.80 g，生大黃0.45 g，鬼箭羽1.35 g，水蛭0.90 g，三七粉0.27 g。藥材由海南省中醫院制劑室制備并提供，制備方法：每次制備10份量，以水作溶劑煎煮提取兩次，第1次用水量為總藥材劑量的10倍，第2次為5倍，每次提取2.5 h，合并兩次提取藥液，濾布過濾后真空袋包裝冷凍儲存。

1.3實驗動物及分組 成年SPF級雄性SD大鼠30只，體重80～100 g，購自浙江省醫學科學院，生產許可證號：SCXK(浙)20140001。采用隨機數字表法將大鼠隨機分為3組：糖尿病腎病模型組(DN組)、滋脾通絡方干預組(DZ組)及正常對照組(O組)，每組10只。實驗過程符合國家及單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.4實驗方法 大鼠適應性飼養7 d后，O組給予正常飼料飼養。DN組及DZ組大鼠給予高糖高脂飼料(熱量為4.43 kcal/g)喂養4周，然后按35 mg/kg腹腔注射1%STZ枸櫞酸緩沖液，夜間禁食喂養3 d后，每隔24 h自尾靜脈采血測空腹血糖值，連續3 d空腹血糖≥16.7 mmol/L，視為造模成功。O組大鼠腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。造模成功1周后，DZ組按體重給予對應藥物灌胃，DN組及O組給予羧甲基纖維素鈉灌胃，連續給藥8周。

1.5指標檢測 造模成功后，觀察大鼠一般情況。在第1、2、4、6、8周，每周一稱量大鼠體重，測尾靜脈血糖。第8周周六將大鼠放入代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液，檢測尿蛋白含量。第9周周一麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，檢測血清生化指標和血液流變學指標。取左側腎臟，生理鹽水洗凈吸干后，稱量腎臟質量，計算腎臟指數。腎臟指數=左側腎臟重量/體重。取右側腎臟處理后制備HE染色切片，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變情況。

1.6指標分析 通過大鼠一般情況、腎功能(腎臟指數及24 h尿蛋白)、腎臟病理、體重及血糖、血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平對大鼠DN病情進行綜合分析。通過血清生化指標中的總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，血液流變學指標中的全血高、中、低切變率(300 /s、115 /s、1 /s)下的全血黏度(WBV)、血漿黏度(MPAs)、全血還原黏度(WBRV)對大鼠的脂代謝、血液流變學和瘀血阻絡證候進行分析。

1.7統計學處理 采用SPSS 19.0軟件行統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組大鼠一般情況比較 O組大鼠一般情況正常。DN組及DZ組大鼠造模成功后體重降低，多飲多尿，反應呆板，毛色晦暗，肢體末端顏色發暗。經藥物干預后DZ組大鼠癥狀有所緩解。

2.2各組大鼠腎功能比較 與O組相比，DN組大鼠的腎臟指數及24 h尿蛋白水平升高；與DN組相比，DZ組大鼠的腎臟指數及24 h尿蛋白水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3各組大鼠腎臟組織病理學表現 O組大鼠腎臟組織正常；DN組大鼠腎小球結構紊亂，細胞增生明顯；DZ組大鼠腎小球結構有所恢復，細胞增生好轉，腎小管水腫減輕(圖1)。

表1 滋脾通絡方對各組大鼠腎功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

表1 滋脾通絡方對各組大鼠腎功能的影響(±s，n=10)Tab.1 Effects of Zipitongluo Formula on renal function in each group (±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

圖1 各組大鼠光鏡下腎臟組織病理變化(HE ×400)Fig.1 Light microscopic pathology of renal in three groups of rats (HE ×400)

2.4各組大鼠體重及血糖水平比較 造模成功后，DN組及DZ組大鼠體重低于O組，差異有統計學意義(P<0.01)。DN組大鼠體重自造模成功后逐漸下降，而DZ組大鼠在滋脾通絡方治療后體重逐漸上升，第4、6、8周時，DZ組體重明顯高于DN組，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。造模成功后，DN組及DZ組大鼠血糖水平明顯高于O組，差異有統計學意義(P<0.01)。采用滋脾通絡方治療后，DZ組血糖水平逐漸下降，第4、6、8周時，DZ組血糖水平明顯低于DN組，差異有統計學意義(P<0.01，表3)。

2.5各組大鼠的血清生化指標比較 DN組及DZ組的Scr、BUN、TC、TG、LDL-C、HDL-C均高于O組，DZ組的BUN、TC、TG、LDL-C均低于DN組，差異有統計學意義(P<0.05)。DZ組及DN組的Scr及HDL-C差異無統計學意義(P>0.05，表4)。

2.6各組大鼠的血液流變學指標比較 DN組及DZ組大鼠的WBV、MPAs及WBRV均明顯高于O組，差異有統計學意義(P<0.05)。與DN組相比，DZ組大鼠的WBV、MPAs及WBRV均有明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05，表5)。

表2 各組大鼠體重比較(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

表2 各組大鼠體重比較(g，±s，n=10)Tab.2 Comparison of weight of rats in each group (g,±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O組 359.00±10.75 382.00±11.60 438.40±22.55 469.00±18.77 523.80±18.40 DN組 321.80±11.17(1) 318.00±6.67(1) 316.20±11.95(1) 307.60±11.17(1) 306.60±8.32(1)DZ組 319.60±17.81(1) 327.80±14.17(1) 339.80±15.83(1)(2) 350.80±10.21(1)(2) 353.40±10.64(1)(2)F 13.18 46.94 69.90 180.08 375.99 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表3 各組大鼠血糖水平比較(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

表3 各組大鼠血糖水平比較(mmol/L，±s，n=10)Tab. 3 Comparison of blood glucose level of rats in each group (mmol/L,±s, n=10)

與O組比較，(1)P<0.01；與DN組比較，(2)P<0.01。

組別 第1周 第2周 第4周 第6周 第8周O組 4.80±0.89 4.86±0.71 4.90±1.07 4.82±0.38 4.46±0.43 DN組 21.18±1.10(1) 20.70±2.03(1) 20.28±1.51(1) 23.26±5.41(1) 20.40±1.72(1)DZ組 20.50±1.60(1) 20.26±1.54(1) 18.24±1.14(1)(2) 16.68±1.90(1)(2) 16.22±2.55(1)(2)F 174.97 222.93 39.65 106.28 48.22 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表4 各組大鼠血清生化指標比較(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

表4 各組大鼠血清生化指標比較(±s，n=10)Tab.4 Comparison of serum biochemistry of rats in each group (±s, n=10)

Scr. 血肌酐；BUN. 尿素氮；TC. 總膽固醇；TG. 三酰甘油；LDL-C. 低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C. 高密度脂蛋白膽固醇；與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 Scr(μmol/L) BUN(mmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) LDL-C(mmol/L) HDL-C(mmol/L)O組 68.54±2.32 5.90±0.46 1.38±0.18 0.29±0.05 1.08±0.24 0.32±0.11 DN組 122.80±5.36(1) 31.42±4.07(1) 8.76±0.74(1) 2.71±0.14(1) 3.14±0.19(1) 1.78±0.29(1)DZ組 120.24±4.35(1) 25.92±3.67(1)(2) 7.26±0.44(1)(2) 1.80±0.09(1)(2) 2.36±0.30(1)(2) 1.76±0.15(1)F 596.21 201.46 664.29 158.40 199.50 202.19 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表5 各組大鼠血液流變學指標比較(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

表5 各組大鼠血液流變學指標比較(mPa·s，±s，n=10)Tab.5 Comparison of hemorheology indicators of rats in each group (mPa·s,±s, n=10)

WBV. 全血黏度；MPAs. 血漿黏度；WBRV. 全血還原黏度；與O組比較，(1)P<0.05；與DN組比較，(2)P<0.05。

組別 WBV MPAs WBRV高切 中切 低切O組 2.58±0.07 3.19±0.11 0.62±0.07 9.72±0.11 1.42±0.12 DN組 5.32±0.17(1) 6.02±0.14(1) 1.72±0.16(1) 16.27±0.31(1) 3.17±0.08(1)DZ組 2.91±0.12(1)(2) 3.45±0.09(1)(2) 0.79±0.08(1)(2) 10.07±0.19(1)(2) 1.52±0.06(1)(2)F 27.62 69.27 70.92 23.47 58.91 P<0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 討 論

根據國際糖尿病聯盟公布的最新數據，2019年全球約4.63億成人患DM，預計到2045年，DM患者可能達到7億，其中90%為2型DM[7]。DM并發癥已成為嚴重的公眾健康問題，其主要發生原因為微血管病變，而血液流變學改變和高血糖導致的內皮損傷是導致微血管病變的關鍵因素，在DN的發病機制中起重要作用[8-9]。因此，控制血糖、降低血液黏度是DN治療的關鍵。

現代中醫學將DN歸屬于“消渴”“消癉”等范圍，基本病機為氣陰兩虛、燥熱內生[10]，同時認為血脂、血流變等指標變化反映了DN的瘀血阻絡證候[11]。基于此，本研究選用滋脾通絡方對DN大鼠進行治療，其中黃芪、山藥共為君藥，黃芪甘溫，補脾胃之氣，山藥甘平，補氣養陰；當歸、赤芍、川牛膝共為臣藥，三種藥物起到養血活血，抑制血小板聚集的作用；大黃、鬼箭羽、三七共為佐使，起到破瘀通絡的作用[6]。

此前的大部分現代藥理研究認為，黃芪及當歸對D N 的治療作用是通過抑制轉化生長因子-β(TGF-β)/Smad信號通路，改善腎間質纖維化達成的。另外，黃芪及當歸還具有改善微循環、抗血小板聚集、保護血管內皮細胞等功能[12-13]，山藥多糖也具有降低血糖、血脂的作用[14]。本研究結果提示，滋脾通絡方可明顯降低DN大鼠的血液黏度、血脂及血糖水平，改善大鼠腎臟病理情況。其治療DN的機制可能是通過改善大鼠的血液流變學及脂代謝，起到改善腎臟功能、降低血糖水平的作用。具體機制可能是滋脾通絡方對血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)具有拮抗作用。TXA2是一種具有強烈促進血管收縮及血小板聚集作用的活性物質，在DN的發生發展中起重要作用。黃芪中的毛蕊異黃酮在中低劑量情況下可抑制TXA2的合成[15]，當歸中的有效成分阿魏酸也可以選擇性抑制TXA2合成酶活性，從而減少TXA2合成，抑制血小板聚集。

綜上所述，滋脾通絡方可通過改善血液流變學及脂代謝，發揮改善微循環、降低血糖水平、保護腎臟功能的作用。