蛋白酶體抑制劑Oprozomib對順鉑耐藥卵巢癌細胞的作用及機制研究

任方芳，趙太強

四川省醫學科學院/四川省人民醫院/電子科技大學附屬醫院檢驗科，成都 610072

順鉑(cisplatin，DDP)是廣泛應用于多種實體腫瘤的有效抗癌藥物，其作用機制為誘發DNA雙鏈間或鏈內相鄰兩個鳥嘌呤之間產生交聯，引起DNA損傷[1-3]。DDP的臨床應用主要受到其耐藥性的限制[4-5]。對耐藥細胞株的研究發現，DDP耐藥是由多種因素導致的，包括細胞內藥物運輸系統功能異常導致胞內有效藥物濃度不足[6]，強化的DNA修復系統導致細胞能夠耐受藥物引起的DNA損傷[7]，抗凋亡信號通路異常活化等[8]。最近研究發現，谷胱甘肽(GSH)作為胞內重要的解毒劑，可能參與鉑類耐藥。DDP作用產生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)具有細胞毒作用，而GSH依賴還原性巰基與過氧化物結合，可促進ROS及時清除，具有細胞保護作用[9-11]。卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，病死率居婦科腫瘤性疾病之首[12]，耐藥是其預后較差的關鍵因素，尋找潛在的藥物耐受靶點對提供可行的用藥選擇具有指導意義。本研究以二代蛋白酶體抑制劑Oprozomib (OZ)[13]作為增敏劑，研究其對DDP耐藥卵巢癌細胞SKOV3/DDP和A2780/DDP的作用及機制，以期為改善耐藥卵巢癌患者的預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞株(上海酶研生物科技有限公司)；CCK-8檢測試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司)；GSH、ROS檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；蛋白酶體活性檢測試劑盒(美國A bcam公司)；DDP、OZ、四甲基哌啶(Tempol)(美國Selleck公司)；兔抗人谷胱甘肽合成酶(GSS) IgG單克隆抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)；GSH分子(美國Sigma-Aldrich公司)。FLx800TM熒光/發光酶標儀(美國Biotek公司)；Cytomics FC 500流式細胞儀(美國Beckman公司)；ChemiDoc化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2細胞培養 用含10%胎牛血清的DMEM培養基于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞株，每24 h換液一次，待融合至90%時傳代，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.3CCK-8法檢測細胞活力 將SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞分別以1×104個細胞/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入藥物進行處理。研究OZ對細胞活力的影響時，將OZ設為9個濃度梯度(0、3、9、27、81、243、729、2187、6561 nmol/L)， 與細胞共培養24 h。研究DDP對細胞活力的影響時，根據處理因素不同分為DPP組和DDP+OZ組：DDP+OZ組加入500 nmol/L OZ 50 ml，其工作濃度為125 nmol/L，DDP組加入相應體積的溶劑。3 h后，兩組均加入相應濃度DDP(0、3、9、27、81、243、729、2181、6561 nmol/L)至終體積200 μl，24 h時每孔加入20 μl CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30～60 min，采用FLx800TM熒光/發光酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度(OD)值，計算IC50。IC50=最小值+(最大值-最小值)/[1+10(logEC50-X)×最大斜率的絕對值]。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡情況 將SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞分別以5×105/孔密度接種于6孔板，待細胞貼壁后，根據處理因素不同分為對照組、DDP組(各細胞在OZ作用下的IC50濃度)、OZ組(各細胞的IC50濃度)和DDP+OZ組。采用0.5%胰酶消化收集處理細胞，500 r/min離心5min，棄上清，用預冷的PBS洗3次，離心后用結合緩沖液重懸細胞，調整濃度為1×106個/ml，混勻后取100 μl，加入鈣磷脂結合蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和溴化丙錠(PI)各5 μl，室溫避光染色20 min，采用Cytomics FC 500流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5蛋白酶體糜蛋白酶(CT-L)活性檢測 實驗分為對照組和OZ組。研究不同濃度OZ對蛋白酶體CT-L活性的影響時，OZ組采用0～512 nmol/L(覆蓋IC50值)濃度梯度處理細胞。研究OZ處理時間對蛋白酶體CT-L活性的影響時，將固定濃度(IC50)OZ與細胞共培養12、24 h。收集細胞，4 ℃下PBS洗3次，0.5% NP-40重懸裂解，4 ℃下12 000 g離心15 min，取上清20 μl，稀釋至100 μl，加入1 μl底物，37 ℃避光孵育30 min，采用FLx800TM熒光/發光酶標儀進行檢測(激發光波長為350 nm，發射光波長為440 nm)，計算相對熒光單位(RFU)。

1.6Western blotting檢測GSS蛋白表達水平 實驗分為對照組和OZ組[固定濃度(IC50)OZ與細胞共培養]。24 h后收集細胞，用RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 g離心15 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量，加入相應體積5×上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳分離蛋白(濃縮膠、分離膠聚丙烯酰胺濃度分別為8%、10%)，每組上樣20 μg，采用兩步法(S1：80 V，15 min；S2：100 V，1.5 h)電泳，250 mA橫流轉膜1 h，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。GSS一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1:2000)室溫孵育1 h。采用ChemiDoc化學發光成像系統進行檢測，Image J軟件計算各條帶灰度值，半定量分析GSS蛋白表達 水平。

1.7GSH水平檢測 實驗分為對照組和OZ組[固定濃度(IC50)OZ與細胞共培養]。收集細胞，參照GSH檢測試劑盒說明書步驟，采用FLx800TM熒光/發光酶標儀檢測412 nm波長處的OD值，根據標準曲線計算GSH濃度。

1.8R O S 水平檢測 實驗分為對照組、D D P組、OZ組、DDP+OZ組、DPP+OZ+GSH組和D P P+O Z+Te m p o l 組。D D P、O Z 濃 度 如 上 所述，DPP+OZ+GSH組另加入50 μmol/L GSH，DPP+OZ+Tempol組另加入1 μmol/L Tempol。24 h后收集細胞，參照ROS檢測試劑盒說明書步驟，采用FLx800TM熒光/發光酶標儀(激發光為488 nm，發射光為525 nm)檢測ROS水平。

1.9統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1O Z 和D D P 對耐藥卵巢癌細胞活性的影響 C C K-8 法檢測結果顯示，O Z 濃度范圍為3～6500 nmol/L時，SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞的IC50分別為140、350 nmol/L，選取該濃度進行后續實驗(圖1A)。無OZ作用時，DDP在兩株細胞中的IC50分別為10 120、6040 nmol/L；與OZ聯用時，DDP在兩株細胞中的IC50分別降至154、232 nmol/L， 選取該濃度進行后續實驗(圖1B)。

圖1 OZ和DDP對耐藥卵巢癌細胞活性的影響(n=4)Fig.1 Effects of OZ and DDP on the activities of SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

2.2OZ增強耐藥卵巢癌細胞對DDP的敏感性 流式細胞術檢測結果顯示，與各自對照組比較，使用DDP處理SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞時，兩株細胞的凋亡率(SKOV3/DDP為4.94%±4.29%，A2780/DDP為3.93%±2.89%)差異均無統計學意義(P>0.05)；與各自DDP組比較，DDP與OZ聯用時，兩株細胞的凋亡率均明顯增高(SKOV3/DDP為30.88%±4.84%，A2780/DDP為40.94%±11.40%，P<0.01，圖2)。

2.3OZ抑制耐藥卵巢癌細胞蛋白酶體CT-L活性

蛋白酶體CT-L活性檢測結果顯示，OZ抑制CT-L活性的作用隨濃度增加而增強，并呈劑量依賴性(圖3A)。OZ處理12 h時，與對照組比較，OZ組SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞CT-L活性均明顯降低[分別為(174.43±67.34) U vs. (562.30±33.94) U、(281.23±55.93) U vs. (682.03±139.32) U，P<0.01]；OZ處理24 h時，與對照組比較，OZ組SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞CT-L活性均明顯降低[(404.32±39.91) U vs. (610.23±81.94) U、(394.55±29.93) U vs. (893.90±39.50) U，P<0.01]。與OZ處理12 h時比較，OZ處理24 h時兩株細胞CT-L活性差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

2.4OZ抑制耐藥卵巢癌細胞內GSH合成 GSH水平檢測結果顯示，OZ可明顯抑制SKOV3/DDP、A2780/DDP胞內GSH生成(P<0.01，圖4A)。OZ處理12h時，與對照組比較，OZ組兩株細胞內GSH水平均明顯降低[(4.85±2.33) μmol/L vs. (15.45±3.84) μmol/L、(5.34±1.39) μmol/L vs. (27.43±4.90) μmol/L，P<0.01]。Western blotting檢測結果顯示，與各自對照組比較，兩株細胞GSS蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01，圖4B)。

2.5OZ抑制耐藥卵巢癌細胞內ROS清除 ROS水平檢測結果顯示，與對照組比較，DDP組SKOV3/DDP、A2780/DDP胞內ROS水平無明顯變化，OZ組、DDP+OZ組兩株細胞內ROS水平均升高(P<0.05或P<0.01)。與DDP+OZ組比較，DDP+OZ+GHS組兩株細胞內ROS水平均明顯降低(P<0.05，圖5)。

圖2 OZ對耐藥卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響(n=3)Fig.2 Effect of OZ on DDP sensitivity of SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=3)

圖3 OZ對耐藥卵巢癌細胞蛋白酶體糜蛋白酶活性的影響(n=4)Fig.3 Effect of OZ on the activity of proteasome chymotrypsin in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

圖4 OZ對耐藥卵巢癌細胞內GSH合成、GSS蛋白表達的影響Fig.4 Effect of OZ on GSH synthesis and GSS expression in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells

2.6ROS清除劑Tempol逆轉OZ對DDP的增敏作用 ROS水平檢測結果顯示，在兩株細胞中，Tempol導致DDP+OZ聯用提高的ROS水平降低(P<0.05，P<0.01，圖6A)。細胞凋亡檢測結果顯示，與DDP+OZ組相比，DDP+OZ+Tempol組SKOV3/DDP、A2780/DDP細胞凋亡率均明顯降低(12.43%±3.10% vs. 37.59%±4.33%、22.49%±5.66% vs. 58.39%±10.86%，P<0.01，圖6B、C)。

圖5 OZ抑制耐藥卵巢癌細胞內ROS清除(n=4)Fig.5 OZ inhibits the ROS clearance in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

3 討 論

OZ作為第二代具有口服生物活性的蛋白酶體抑制劑，可與蛋白酶體N端蘇氨酸共價結合抑制20S亞基的CT-L活性[14]。蛋白酶體抑制劑可有效抑制20S蛋白酶體活性，誘發氧化應激而發揮殺傷腫瘤細胞的作用[15]。GST是胞內至關重要的抗氧化酶，可調節多種ROS毒性，發揮細胞保護作用，其含量或活性異常與腫瘤的發生發展有關。卵巢癌細胞內GST水平顯著高于正常細胞，GST及其同工酶的表達和活性與卵巢癌的預后呈負相關[16]。GST參與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥。在DDP耐藥卵巢癌細胞中，GST活性明顯高于敏感株[17]；在乳腺癌細胞中，抑制GST活性可明顯逆轉細胞對多柔比星的耐藥[18]。GST參與細胞耐藥并催化機體內親電性化合物與GSH結合，后者作為胞內重要的還原劑，在細胞對抗氧化應激、中和ROS毒性過程中起至關重要的作用。GSH可促使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出胞外[19]。GST作為下游重要的效應分子，可干擾GSH的清道夫作用，可能具有潛在的逆轉腫瘤耐藥作用。本研究以耐藥卵巢癌細胞應對氧化應激的能力為切入點尋找潛在的耐藥靶點。

本研究發現，在效應層面，OZ可有效協助DDP誘導耐藥卵巢癌細胞凋亡，而DDP或OZ單獨作用均不能有效誘導細胞凋亡；OZ單獨作用可提高ROS水平，但與DDP+OZ聯用相比，提高幅度有限，推測大幅度提高的ROS是誘導細胞凋亡的主要原因。GSH廣泛存在于正常細胞內。藥物處理可誘導細胞產生大量ROS，導致抗氧化系統能力相對降低，使細胞質膜發生脂質過氧化，引發持續的細胞損傷甚至凋亡。GSH依賴其活性巰基(-SH)等功能基團與ROS結合，保護細胞重要蛋白巰基不被后者氧化[17]。本研究為證實GSH與ROS之間的關系，在DDP+OZ聯用時加入外源GSH，有效降低了ROS水平，提示GSH合成受阻與ROS水平升高有直接關系。本研究為證明ROS過剩是提高DDP敏感性的關鍵，在DDP+OZ聯用時加入ROS清除劑Tempol，明顯降低了ROS水平，細胞凋亡率亦明顯下降，表明降低ROS水平對細胞具有保護作用。此外，本研究結果顯示，OZ可下調GSS表達，進而減少GSH合成，GSH合成抑制后，ROS水平明顯升高。

綜上，筆者推測強化的ROS清除能力參與了DDP耐藥，GSH可通過清除ROS發揮細胞保護作用。在耐藥卵巢癌細胞中，DDP未能有效提高ROS水平可能是細胞耐藥的關鍵，而OZ存在時，GSH減少導致ROS清除能力受阻，依賴后者的細胞毒作用誘導細胞凋亡。