線粒體損傷介導的藥源性臟器損傷評價模型研究進展

魏桂林 何青青 金強 楊凌

摘要 線粒體是細胞的能量工廠，同時線粒體還參與細胞分化、維持細胞內環境平衡、細胞信息傳遞和調節細胞凋亡等過程。線粒體受到核DNA和線粒體DNA的雙重調控，使得線粒體對于各種外源及內源性毒性物質更加敏感。藥物破壞線粒體結構與功能可導致細胞壞死或凋亡。近年來研究發現多種臟器細胞線粒體是藥物毒性作用的主要靶標之一，藥物可通過多種途徑致線粒體毒性，線粒體損傷是許多藥物器官毒性反應早期的重要特征。本文主要綜述常見的誘導不同器官線粒體毒性的臨床藥物并簡要探討藥物介導線粒體毒性的機制。此外，我們還將重點討論目前常用的線粒體毒性評價模型和評價技術，以期為預防和診斷藥源性器官損傷提供思路。

關鍵詞 線粒體;線粒體毒性;器官毒性;臨床藥物;中藥;評價模型;評價技術;高通量

Research Progress on Evaluation Model of Drug-induced Organ Damage Mediated by Mitochondrial Damage

WEI Guilin，HE Qingqing，JIN Qiang，YANG Ling

（Institute of Interdisciplinary Integrative Medicine Research，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Mitochondria are the energy factories of cells.Meanwhile，mitochondria are also involved in processes such as cell differentiation，maintenance of the intracellular homeostasis，cell information transmission and regulation of cell apoptosis etc.Mitochondria are dually regulated by nuclear DNA and mitochondrial DNA，making mitochondria more sensitive to various exogenous and endogenous toxic substances.The destruction of mitochondrial structure and function by drugs can lead to cell necrosis or apoptosis.In recent years，studies have found that the mitochondria of various organ cells are one of the main targets of drug toxicity.Drugs can cause mitochondrial toxicity through a variety of ways.Mitochondrial damage is an important feature of many drug organ toxicity in the early stage.This paper mainly reviews common clinical drugs that induce mitochondrial toxicity in different organs and briefly discusses the mechanism of drug-mediated mitochondrial toxicity.In addition，we will also focus on the current commonly used mitochondrial toxicity evaluation models and evaluation techniques in order to provide ideas for the prevention and diagnosis of drug-mediated organ damage.

Keywords Mitochondria; Mitochondrial toxicity; Organ toxicity; Clinical drugs; Chinese medicines; Evaluation model; Evaluation technology; High throughput

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.001

線粒體是由雙層膜包裹的細胞器，是細胞的主要能量來源，線粒體以ATP的形式儲存能量，并以ATP水解釋放能量以供生命活動之需，如用于肌肉收縮和細胞分裂，蛋白質生物合成、折疊和降解以及膜電位的產生和維持等[1-2]。除了細胞呼吸和產生能量外，線粒體還參與其他代謝過程，包括糖類、脂肪以及蛋白質三大營養物質的最終氧化，氨基酸、血紅素的生物合成，鈣信號傳導、應激反應以及一般的細胞信號中樞。此外，線粒體還參與細胞凋亡、壞死與衰老等過程。因此，線粒體在人類身體健康中發揮著重要作用。

線粒體功能紊亂通常會誘發細胞損傷乃至死亡，故而線粒體也是許多疾病治療的靶點[3]。開發靶向干擾線粒體功能的藥物一直也是很多醫藥公司設計和開發針對治療目的的主要策略[4]。但是，對于大多數制藥公司而言，藥物的安全性愈發變的不可忽視。越來越多的實驗和臨床研究表明，線粒體是許多藥物毒性產生的靶點，嚴重不良反應可能是藥物或代謝中間體直接或間接破壞線粒體結構與功能造成的[5-6]。擾亂線粒體的藥物通常是通過抑制電子傳遞鏈的呼吸復合物，抑制或解偶聯氧化磷酸化，誘導線粒體氧化應激，降低線粒體膜電位，擾亂細胞內鈣離子穩態，或抑制DNA復制、轉錄或翻譯等過程產生的[7]。線粒體毒性是上市藥物撤藥以及器官毒性的一個重要原因，FDA等機構也明確要求線粒體毒性作用應納入藥物的安全評價中[8]。因此，在藥物發現的早期階段檢測藥物誘導的線粒體功能障礙是至關重要的，構建高效地線粒體毒性評價模型來減少候選藥物的后期消耗，降低藥物不良反應，并設計出更安全的藥物對于整體醫藥產業、人類健康意義重大。

本綜述主要圍繞藥物誘導器官、組織細胞的線粒體毒性，并舉例說明了藥物誘導的線粒體毒性的多種機制;概述了藥物誘導的線粒體功能改變的傳統和新穎評價模型和評價技術，以期為預防、診斷、干預或改善外源性藥物引起的臟器損傷和相關疾病提供思路。

1 線粒體結構與功能

線粒體由雙層膜結構將線粒體分為外膜、膜間隙、內膜和線粒體基質四大部分。外膜平整光滑，相當于細胞膜，外膜主要參與調控線粒體與內質網等細胞器以及細胞質之間的物質交換。外膜和內膜之間的區域是膜間隙，由于外膜上分布有孔蛋白構成的通道，通透性很高，所以膜間隙中的離子環境與胞質的幾乎相同。內膜包裹著線粒體基質，蛋白含量高，部分內膜向內折疊形成嵴，在不同種類的細胞中，線粒體嵴的數目、形態和排列方式有較大差別，嵴的形成增加了線粒體內膜的表面積，因此，內膜通透性低并且在內膜上進行著更多的生化反應。線粒體基質含有參與三羧酸循環、脂肪酸氧化、氨基酸降解等生化反應的酶等眾多蛋白質，所以較細胞質基質黏稠，線粒體基質中一般還含有線粒體DNA，RNA和核糖體。

線粒體是細胞的動力工廠，是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，細胞中95%以上的能量來源于線粒體[9]。同時，線粒體還參與調解鈣離子穩態，活性氧的產生以及細胞內信息傳導平臺，調控細胞死亡，如凋亡、壞死以及自噬等。

2 線粒體損傷模式及機制

線粒體損傷包括結構和功能上損傷。很多藥物可以破壞線粒體膜完整性，導致線粒體裂解，從而喪失功能[10-11]。另一方面，絕大部分線粒體毒性藥物都是通過破壞線粒體功能從而誘發線粒體能量障礙，最后引起細胞的凋亡或壞死。藥物引起線粒體功能的方式主要包括4個方面：1）產生過量ROS;2）鈣離子紊亂和線粒體通透性轉變;3）阻斷線粒體呼吸鏈;4）損傷線粒體DNA[12-14]。見圖1。

線粒體電子呼吸鏈泄露的電子攻擊O2是線粒體產生ROS的主要原因，這些ROS會攻擊磷脂，蛋白質和線粒體DNA從而損傷線粒體功能[15]。正常情況下，線粒體超氧化物歧化酶將超氧化物分解為過氧化氫，然后通過谷胱甘肽過氧化物酶將其轉化為水。此外，胞質超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可提供細胞具有針對ROS的其他抗氧化劑防御機制。但是，很多外源性藥物或代謝生成的活性中間體可直接產生大量的ROS，引起氧化應激[16]，線粒體作為產生ROS的主要細胞器，因此也成為主要被攻擊

研究表明，藥物或其反應性代謝產物可通過改變線粒體的結構或功能來誘導線粒體通透性轉換孔（Mitochondrial Permeability Transition，mPTP）。目前認為主要有2種機制，一種機制涉及促凋亡分子BAX/BAK在線粒體外膜上形成孔[19]。由藥物或其他有毒化學物誘導的細胞應激與BH3蛋白的激活有關。這些蛋白質通過激活BAX/BAK促進線粒體介導的細胞死亡，進而誘導線粒體外膜上的孔形成。通過這些孔釋放的線粒體促凋亡蛋白CytC，EndoG和AIF啟動細胞凋亡。第二種機制是由于鈣穩態的改變或mtROS產生的增加而引起的mPTP誘導，從而導致線粒體內膜破裂[20]。線粒體是鈣離子儲存的主要場所之一，在線粒體內，鈣離子會增加三羧酸循環和ATP產生至關重要的幾種酶的活性，激活了線粒體的代謝，增加了有氧條件下許多能量消耗過程中ATP的供應。線粒體對鈣離子的攝取和外排共同維持細胞內鈣離子的穩態，并與內質網、細胞膜共同參與調節胞質內游離鈣離子濃度，維持細胞內鈣離子的穩態。很多藥物或代謝物會直接或間接破壞鈣離子平衡，導致大量線粒體鈣離子外流進入胞質中，鈣離子濃度的劇降抑制ATP合成，最終引起氧化磷酸化過程障礙。

化合物在線粒體中氧化產生的NADH和FADH2通過電子傳遞鏈（Electron Transfer Chain，ETC）將質子和電子傳給O2生成水分子，電子傳遞鏈的抑制在某種程度上意味著細胞能量代謝障礙，甚至細胞生命的終結。許多藥物或其親電子代謝物可以抑制線粒體電子傳輸鏈并導致活性氧（ROS）形成，從而觸發MMP和細胞色素c的釋放[21]。另一方面，在完整的線粒體內，電子傳遞與磷酸化是緊密偶聯在一起的，很多藥物可通過氫穿梭穿過膜或通過通道形成或僅通過破壞脂質雙層來充當解偶聯劑，導致電子傳遞與ATP的形成這2個過程分開，則只進行電子傳遞而不能生成ATP[22]。

線粒體DNA是獨立于細胞核染色體外的基因組，能夠單獨進行復制、轉錄及合成蛋白質。但是由于mtDNA是裸露的，缺乏保護，且處于線粒體呼吸鏈產生的高活性氧環境中，因此，mtDNA極易受氧自由基的侵害[16]。并且氧化損傷引起的線粒體DNA突變或其基因產物丟失又會進一步促進活性氧的釋放，進而又加重線粒體DNA的損傷[23]。

3 藥源性線粒體毒性

線粒體由于其膜腔呈弱堿性（pH≈8），且處于負膜電位狀態，使得很多帶正離子藥物很容易由于電勢差而進入線粒體內部，大量富集造成線粒體功能障礙。不同類別藥物由于其各自獨特的結構特征，使其對線粒體毒性機制存在差異。以下列舉了引起線粒體不同毒性機制的藥物。見表1。

3.1 非甾體抗炎藥 非甾體抗炎藥（NSAIDs）是一類不含有甾體結構特征的藥物，這類藥物通常需要弱酸性基團（羧酸）結合到COX2酶的花生四烯酸鹽結合位點上，抑制COX2活性來發揮藥效，具有抗炎、抗風濕、止痛、退熱和抗凝血等作用。越來越多證據表明該酸基團的脂溶性與細胞線粒體內膜磷脂相互作用，起質子體的作用，損傷線粒體功能。吲哚美辛，雙氯芬酸和其他NSAIDs，包括選擇性COX-2抑制劑，在離體大鼠心臟制劑中顯示出可解除呼吸耦合并減少ATP產生[22]。另外，在大鼠心肌細胞和鼠新生心肌細胞中，NSAIDs可能通過抑制線粒體電子運輸鏈來增加ROS的產生。Masubuchi等人發現大多數NSAID的結構成分二苯胺可解偶聯氧化磷酸化，降低肝臟ATP含量，導致線粒體腫脹，從而誘發大鼠肝制備中的肝細胞損傷[24]。NSAIDs解耦效果的順序為氟芬那酸>雙氟尼醛>甲苯磺酸>甲芬那酸酸>雙氯芬酸>吲哚美辛>萘普生，非諾洛芬>水楊酸[25]。而不含二苯胺結構的對乙酰氨基酚和阿司匹林也具有明顯的肝細胞線粒體毒性，則是因為對乙酰氨基酚可以被代謝激活，其代謝物與線粒體蛋白結合并誘導氧化應激，導致線粒體通透性轉變[26]。同樣，阿司匹林的主要代謝產物水楊酸酯可提高對開放mPTP的敏感性。尼美舒利可通過解耦線粒體呼吸并誘導離體大鼠肝細胞和培養的人肝癌細胞中的mPTP來破壞線粒體ATP的產生，表明該藥物對線粒體具有直接毒性，而不需要代謝激活[27]。

3.2 抗菌藥 抗菌藥根據結構可分為喹諾酮類藥物、β-內酰胺類、大環內酯類和氨基糖苷類。喹諾酮類，氨基糖苷類和β-內酰胺類被證明可通過抑制線粒體ETC導致線粒體功能受損，從而導致哺乳動物細胞中ROS的生成增加，進而導致氧化性組織損傷[28]。體外研究表明氨基糖苷類可以靶向線粒體核糖體，干擾蛋白質合成，β-內酰胺類抑制線粒體肉堿/酰基肉堿轉運蛋白而抑制脂肪酸β氧化，嚴重時導致腎毒性[29]。相較而言，四環素和大環內酯類抗菌藥似乎對線粒體功能沒有不利影響。由于細菌和線粒體核糖體的相似性，用于嚴重耐藥革蘭氏陽性細菌感染的利奈唑胺，可抑制線粒體蛋白質的合成，特別是抑制呼吸鏈復合體IV[30]。

3.3 抗逆轉錄病毒藥物 抗逆轉錄病毒藥物主要通過抑制線粒體DNA合成和氧化損傷DNA。盡管抗逆轉錄病毒藥物結構差異導致不同程度線粒體功能異常，總體上這類藥物通過抑制線粒體DNApoly導致mtDNA缺失，從而損害線粒體呼吸功能，引起細胞內脂質蓄積和高乳酸血癥[31]。齊多夫定（AZT）或司他夫定（d4T）作為胸腺嘧啶類似物;去羥肌苷（腺苷類似物）;扎西他濱或拉米夫定為胞嘧啶類似物;阿巴卡韋和阿巴卡韋（鳥嘌呤類似物）是核苷和核苷酸逆轉錄酶抑制劑，用于預防AIDS患者中HIV病毒的復制。然而，由于這些藥物也抑制線粒體DNA聚合酶γ，因此在患病患者中線粒體DNA復制也受到部分影響。這些藥物線粒體毒性大小依次為：扎西他濱>地達松>司他夫定>拉米夫定>齊多夫定>阿巴卡韋[31]。

3.4 抗癌藥 抗癌藥物依據作用機制不同一般分為抑制DNA合成、直接破壞DNA結構或與DNA結合、抑制蛋白質的合成、抑制有絲分裂等四大類。研究顯示醌類抗腫瘤藥物如絲裂霉素C、阿霉素等具有顯著線粒體毒性。絲裂霉素C的對苯二酚結構可作為親電試劑與基因組DNA以及單和二烷基化DNA形成交聯，從而防止腫瘤細胞增殖。但是，在這些有氧條件下，絲裂霉素C引起線粒體功能障礙，因為線粒體還原酶代謝產生的絲裂霉素半醌自由基中間體可與氧反應形成氧化還原循環，從而形成可氧化生物分子的ROS?？鼓[瘤藥物阿霉素介導的線粒體功能障礙似乎是由線粒體外膜NADH：b5還原酶和內膜復合物I還原而形成的半醌自由基間接引起的，它通過使電子從呼吸鏈轉移而損害了氧化磷酸化。隨后，半醌中間體與氧氣反應形成超氧化物，變成過氧化氫[32]。順鉑是另一種用于實體瘤的抗癌藥物，順鉑誘導線粒體毒性涉及ROS的形成，ATP降低，抗氧化劑防御和線粒體呼吸[33]。

3.5 麻醉藥 體外研究表明，全身麻醉藥主要通過抑制電子傳遞鏈來降低線粒體功能。在短期全身麻醉藥（揮發性麻醉劑，異丙酚，神經肌肉阻滯劑，苯二氮艸卓類藥物和阿片類藥物）抑制線粒體呼吸而不影響線粒體復合物的酶活性或氧化磷酸化偶聯[34]。麻醉藥異丙酚線粒體毒性可能包括抑制呼吸鏈上電子傳遞，破壞脂肪酸氧化，及抑制細胞色素C氧化酶活性[35]。在一項研究中，異丙酚通過消耗完仔豬大腦中的糖原和線粒體ATP來改變線粒體的代謝。氯胺酮的超臨床濃度可通過線粒體途徑誘導神經元凋亡，涉及線粒體膜電位降低，ROS水平升高，線粒體裂變增加和Caspase-3活性[36]。而氯胺酮增加ROS，降低線粒體ATP的內在機制主要是由于其可抑制線粒體電子傳遞鏈[37]。局部麻醉藥布比卡因和依替卡因的嚴重心臟毒性和肌毒性限制了它們的用途，并歸因于其線粒體的解偶聯能力。作為高度親脂性的兩親性胺，它們可以通過質子傳遞機制，通過質子穿過線粒體膜并刺激分離的線粒體呼吸[38]。布比卡因還比羅哌卡因更有效地使心臟細胞線粒體解偶聯，特別是在復合物I處，而利多卡因在解偶聯上的活性低得多[39]。布比卡因誘導的肌毒性和肌病的機制被認為是由于線粒體毒性導致ATP耗竭，Ca2+超載和ROS形成，從而導致通透性轉變開孔[40]。

3.6 降血脂藥 他汀類藥物是抑制HMG-CoA還原酶抑制藥，是目前最有效的降脂藥物。長期使用他汀藥物可導致肝毒性和肌毒性，研究顯示這些不良反應與線粒體功能紊亂有關。西伐他汀，洛伐他汀，辛伐他汀可以顯著降低線粒體膜電位，改變線粒體膜轉換孔，降低線粒體氧化磷酸化從而破壞肝細胞線粒體功能[41]。而他汀類藥物骨骼肌線粒體毒性則主要與消耗線粒體mtDNA關聯[42]。另一類降脂藥如非諾貝特、氯貝丁酯也有一定的線粒體毒性，它們則主要通過抑制線粒體呼吸鏈復合物I活性而導致線粒體功能障礙[43]。

3.7 抗糖尿病藥 雙胍類藥物（二甲雙胍、苯乙雙胍、丁福明）的抗糖尿病作用以及誘導的乳酸性酸中毒都可能歸因于線粒體呼吸復合物I的抑制[44]。復合體I的抑制機制尚不清楚，但可能涉及雙胍分子的烴部分與膜磷脂的烴鏈結合，質子化胍基的正電荷與磷脂磷酸基相互作用。噻唑烷二酮類降糖藥包括曲格列酮，羅格列酮和吡格列酮，這些藥也通過抑制線粒體復合物I，從而降低糖異生作用，并可能具有抗糖尿病作用[45]。它們通過抑制復合物I活性，引起骨骼肌或大鼠肝勻漿中的乳酸釋放，從而導致毒性。曲格列酮可通過降低線粒體膜電位，減少ATP合成而誘導線粒體毒性。

3.8 抗癲癇藥 研究顯示許多抗癲癇藥具有不同程度的線粒體毒性。丙戊酸是一種廣譜抗癲癇藥，用量不適時也會引起線粒體毒性，其中肝毒性最明顯。丙戊酸可在肝臟中被代謝激活，活性產物可結合到還原的乙酰輔酶A上，從而被攝入線粒體基質內，抑制多種線粒體酶并降低線粒體脂肪酸氧化[46]。此外，研究還發現丙戊酸可抑制線粒體呼吸鏈復合物II，誘導脂質過氧化和膜電位降低，引起ROS產生增加，進而引起線粒體功能異常[47]。其他抗癲癇藥如苯妥因納、卡馬西平，苯巴比妥也可誘發線粒體功能障礙，它們對線粒體毒性大小依次為苯妥因納>苯巴比妥>卡馬西平[48]。

3.9 抗精神病藥 抗精神病藥依據結構主要包括吩噻嗪類（氯丙嗪）、硫雜蒽類（泰爾登）、丁酰苯胺（氟哌啶醇）及其他類藥物。研究表明，很多抗精神病藥會破壞線粒體功能，特別是對線粒體呼吸鏈復合物I活性有抑制作用。研究抗精神病藥（典型的抗精神病藥）對人腦微血管內皮細胞的作用，證實了這些發現，其中線粒體呼吸鏈復合物I和III的活性被所有抗精神病藥抑制[48]。吩噻嗪類如氯丙嗪等衍生物可通過mPTP開放和細胞色素c釋放導致線粒體損傷，最后引起細胞凋亡[49]。氯氮平的線粒體毒性機制則主要包括破壞線粒體形態、降低線粒體膜電位及耗竭線粒體ATP[50]。

3.10 抗抑郁藥 大量的體外和體內研究表明，常用的抗抑郁藥會抑制線粒體功能并增加氧化應激。阿米替林誘導的線粒體毒性與線粒體蛋白表達降低，線粒體含量，ATP水平降低，ROS生成增加，線粒體膜通透性轉變有關[51]。其他抗抑郁藥，例如氯米帕明，地昔帕明，天肽，氟西汀對線粒體有作用。研究顯示氟西汀和天肽可有效抑制線粒體呼吸，但氯米帕明，地昔帕明和去甲氟西汀則由于降低線粒體膜電位和抑制線粒體復合物活性而導致凋亡[52]。長時間使用舍曲林導致ATP耗竭，mPTP誘導和抑制ETC而導致不可逆的線粒體損傷和細胞死亡[53]。奈法西酮由于抑制膜電位和線粒體呼吸道復合物I和IV活性，從而引起嚴重肝毒性[54]。

4 線粒體毒性與臟器損傷

每年都有相當大比例的藥物由于出現臨床前期或中期未發現的不良反應而被撤出市場。越來越多的證據表明，這些不良反應很多是線粒體功能障礙引起的心臟、肝臟和腎臟毒性作用。下表列舉了主要經由線粒體途徑的心肝腎毒性藥物[3，13，55-56]。見表2。

4.1 線粒體損傷致肝毒性 肝臟作為藥物代謝的重要臟器，也是藥物引發損傷的主要靶器官。一些抗病毒藥物、抗腫瘤藥物和抗生素等可顯著誘導肝臟線粒體損傷。很多肝毒性藥物主要通過改變線粒體結構、酶的活性或減少線粒體DNA的合成，進一步破壞脂肪酸β氧化和肝細胞的氧化能力，最終誘發肝損傷。線粒體在哺乳動物的肝細胞中含量非常豐富，其參與肝細胞內電解質穩態平衡的調控、離子跨膜轉運、氧自由基生成、細胞信號轉導和細胞凋亡等一系列的細胞生理活動。同時，線粒體也是最容易受損的一個細胞器，其可以顯示細胞受損的程度。越來越多的研究表明，線粒體損傷可能是藥源性肝損傷誘發因素和經由途徑[13]。因此，認識和深入研究線粒體損傷在藥源性肝損傷發生中的重要作用，可為藥源性肝損傷臨床早期診斷、預防及治療提供新思路。藥物誘導的線粒體損傷主要包括結構改變和功能紊亂。線粒體結構的改變主要表現為線粒體腫脹、體積顯著增大、內外膜完整性破壞甚至出現膜溶解、線粒體脊斷裂及大量空泡化，線粒體結構基本喪失。藥物經由線粒體誘發肝損傷的機制主要有干擾線粒體呼吸鏈上的電子傳遞、氧化磷酸化的解偶聯、抑制線粒體脂肪酸β氧化、干擾線粒體Ca2+紊亂、促進mPTP開放、破壞線粒體DNA等途徑。胺碘酮是常用抗心律失常藥物，研究顯示胺碘酮誘導肝細胞線粒體功能障礙而發生肝損傷的主要機制是其抑制呼吸鏈復合物Ⅰ，阻斷呼吸鏈中電子的傳遞，最終降低ATP的生成[17]。中草藥雷公藤對細胞免疫和體液免疫均有抑制作用，其主要的有效成分和毒性成分為雷公藤甲素。雷公藤甲素引起肝損傷與直接損害肝線粒體的結構和功能有關，線粒體損傷可能是雷公藤甲素致肝損傷的機制之一[57]。研究表明雷公藤甲素肝毒性主要體現在肝細胞線粒體呼吸鏈的電子傳遞障礙，線粒體膜電位降低，顯著地抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅳ等。二苯胺類非甾體抗炎藥不僅可以降低線粒體膜電位，還可刺激基礎氧消耗并抑制ADP呼吸，使得線粒體氧化磷酸化解耦聯，ATP生成急劇減少，導致能量代謝障礙從而誘發肝損傷。丙戊酸是一種抗驚厥藥，越來越多研究表明丙戊酸可以消耗肉堿，減少輔酶A供應和抑制β氧化的三大功能酶，從而阻礙線粒體β氧化，并且其代謝產物還能與脂質競爭相關的酶，這些都是丙戊酸誘導肝毒性的主要原因[47]。一些抗結核藥如異煙肼和利福平的肝毒性則主要與線粒體氧化應激和線粒體mPTP異常開放密切相關[58]。此外線粒體具有自己獨立的遺傳信息，能夠獨立進行基因的轉錄、翻譯及蛋白質的表達。很多核苷類及單核苷酸類逆轉錄酶抑制劑在臨床長期治療時，會抑制線粒體DNA聚合酶，導致線粒體酶合成受阻、特別是氧化磷酸化中ETC關鍵蛋白的表達受到影響，導致嚴重的能量代謝障礙。并且這些藥物也還能與DNA聚合酶結合，終止DNA復制，從而減少mtDNA含量而損傷線粒體[59]。

4.2 線粒體損傷致腎毒性 腎臟由于其功能和解剖學特點，是藥物毒性的重要靶器官之一，藥物誘導的急性腎損傷是藥物研發過程中常見的問題。急性腎毒性以近端腎小管損傷為主要特征，表現為腎小管腫脹、腎小管上皮細胞壞死、管型形成、間質炎性反應及細胞凋亡等。腎小管，尤其是近端小管，對離子、葡萄糖及營養物質的重吸收均需要通道和轉運蛋白的主動運輸才能完成，需要維持線粒體正常功能以保證能量供應[55]。腎臟是一個高能量需求的器官。由于腎臟的再吸收過程對能量（ATP）的持續和高度依賴，使得線粒體功能障礙成為可能參與藥物誘導的急性腎毒性的關鍵發病機制。因此，藥物引起的線粒體損傷可以中斷化學物質的再吸收過程，在急性腎毒性的發病機制中起著至關重要的作用。常見的具有引起急性腎毒性傾向的藥物有抗生素、化療藥物、免疫抑制藥物、抗病毒藥物、中藥、非甾體抗炎藥物、質子泵抑制劑等。諸多研究均在AKI模型中觀察到腎小管上皮細胞線粒體嵴消失、線粒體碎片化及質量下降、線粒體腫脹等表現。

近端腎小管對許多化學物質的重吸收過程嚴重依賴于Na+/K+ATP酶產生的電化學梯度。Na+/K+ATP酶是一種存在于多種細胞質膜中的酶。這種泵在不同的生理過程中起著至關重要的作用，如從胃腸道吸收化學物質或通過神經元傳遞脈沖。Na+/K+ATP酶將Na+泵出細胞，同時將K+泵入細胞，兩者都是逆濃度梯度轉運。Na+/K+ATP酶活性依賴于ATP。在腎臟中，Na+泵出提供的驅動力用于將幾種化學物質，如氨基酸、葡萄糖、磷酸鹽、蛋白質、維生素和其他一些有機化合物導入近端小管細胞，進而進入血流。因此，細胞內ATP含量的任何改變都會損害其功能。腎小管內層細胞含有大量線粒體，為化學物質的主動轉運和再吸收提供足夠的能量。近端小管細胞具有較高的代謝率，可通過線粒體氧化磷酸化產生大量ATP。近端小管細胞對ATP的高度依賴性使其成為外源性毒物誘導的線粒體損傷和能量危機的潛在靶細胞。對線粒體功能的干擾會破壞能量代謝和ATP的產生。因此，細胞ATP耗竭可導致Na+/K+ATP酶抑制和破壞化學物質再吸收過程和血清電解質的紊亂。

有毒物質靶向蓄積于腎臟也是藥物誘導腎臟毒性的一個主要原因，這與腎小管細胞膜表面蛋白、有機陽離子轉運體、銅離子轉運體等密切相關。由于近端小管細胞線粒體豐富，因此藥物在近端小管的蓄積，勢必會損傷其內含量豐富的線粒體，進而觸發線粒體損傷。研究表明線粒體參與了藥物誘導的急性腎損傷的病理過程。線粒體動力學失衡將導致線粒體碎片化，進而可導致線粒體質量下降[60]。線粒體碎片化是AKI發生時線粒體最早期變化，發生于腎損傷及細胞凋亡前。線粒體動力學紊亂一方面參與腎小管上皮細胞損傷機制，由此參與多種因素導致的腎小管損傷。腎小管細胞凋亡和氧化應激損傷是藥物誘導腎毒性的明顯病理學特征，其中，線粒體介導的內源性細胞凋亡途徑對于藥物誘導的腎毒性的發生發展十分關鍵。同時由于腎臟近端小管的抗氧化防御系統相對薄弱，而線粒體又是機體活性氧生成的主要場所，因而腎臟對線粒體功能障礙更加敏感。另一方面，腎近端小管上皮細胞由于對這些藥物的高吸收和積累能力而經常受到藥物的影響。這一事件將增加由于過度暴露于外源性藥物引起的腎臟組織損傷的風險。綜上所述，藥物在近端小管的蓄積是DAKI的物質基礎，結合腎臟近端小管線粒體富集這一生理特點以及相關病理學特征，可認為線粒體損傷是藥源性急性腎損傷的重要病理學機制。

總而言之，D-AKI過程中線粒體損傷主要表現為結構改變與功能障礙，具體涉及到氧化應激損傷、線粒體動力學過程紊亂、線粒體自噬水平不足、線粒體生物合成不足、線粒體呼吸鏈缺陷等多方面因素。多種因素彼此之間相互交叉、相互關聯，共同加劇了D-AKI的發生發展。

4.3 線粒體損傷致心毒性 藥物心臟毒性是因外源性藥物對心血管系統造成多種復雜的病理生理損害，臨床表現為心肌炎、心肌病、心律失常、心瓣膜損害、心肌缺血及與心肌梗死等一系列心臟功能和器質性的改變。心臟結構復雜，有毒藥物可通過與各種受體、離子通道的相互作用，參與氧化應激反應，造成細胞器損傷及影響細胞凋亡等多種途徑對其造成損傷。線粒體在心肌細胞中占了很大的比例，位于肌原纖維之間、內質膜下方。線粒體顯著的地位和數量保證了為心臟收縮、新陳代謝和離子動態平衡提供集中高效的ATP運輸系統[61]。線粒體在心肌細胞的存亡中起著關鍵的作用。多種證據表明，多種常用的抗癌藥，抗病毒化合物和抗糖尿病或非法濫用藥物，例如乙醇，可卡因，甲基苯丙胺，搖頭丸和合成大麻素涉及與線粒體相關的直接或間接毒性，主要包括干擾線粒體呼吸鏈（例如，解偶聯）或重要線粒體酶的抑制（氧化磷酸化，三羧酸循環，線粒體DNA復制，ADP/ATP易位），最終導致線粒體膜電位喪失，線粒體氧化/硝化應激增加，和細胞死亡。需要更透徹的了解線粒體心血管毒性的常見機制，以開發靈敏且高通量的線粒體毒性篩選方法和體內模型，以更好地預測新型化合物的不可預見的心臟毒性問題，并基于更具選擇性的靶向性設計新的心臟保護策略預防上述普通藥物嚴重心血管不良后果的特定線粒體過程。

5 線粒體毒性評價模型

近年來，越來越多的研究表明，線粒體是藥物毒性作用的重要靶標，其功能異常通常會導致或加速細胞死亡，線粒體毒性評價已成為候選藥物安全性評價的重要指標[62]。因此評估線粒體的各項指標對于內源性或外源性物質的安全性評價意義重大。

合適的實驗模型對于線粒體毒性的評估至關重要。盡管體內嚙齒動物實驗提供了相當多的毒性數據，但嚙齒動物模型存在種屬差異大，通量低，毒性評價周期長等問題。離體的線粒體或培養的細胞體外毒性實驗被廣泛的用于線粒體毒性機制評價，不但可以進行高通量的體外篩選，而且通常比嚙齒動物體內進行的分析更有效。目前基于細胞的線粒體機制效應或毒性模型是不夠的，因為培養的細胞系存在高度糖酵解、有氧代謝最小化以及線粒體生理功能的改變等問題。因此，近年來，像斑馬魚、秀麗隱線蟲等可進行高通量篩選的體內動物模型逐漸被廣泛應用于體內毒性評價[63]。

5.1 離體線粒體 離體線粒體通常被用于體外評估外源性藥物對線粒體功能的影響，以確定線粒體毒性在特定器官損傷中的作用。線粒體可以從不同臟器組織、培養的細胞中分離出來。所選組織被機械均質化破壞形成組織勻漿，然后用差速離心法分離出線粒體[64];線粒體也可通過細胞裂解分離，然后進行差速離心分離和純化[65]。使用離體的線粒體來測量有毒物質對氧氣消耗的影響，可以避免細胞或整個生物體中存在任何非線粒體呼吸源，包括過氧化物酶體的呼吸[66]。離體線粒體中的氧化磷酸化作用不受代謝和細胞信號傳導的影響，因此，檢測離體線粒體中的氧化磷酸化作用只能獲得完整細胞或動物整體呼吸作用的一部分信息。但是，線粒體的分離會破壞線粒體結構并可能改變線粒體功能。離體的線粒體類似于球形單位，具有相對均勻的大小和形狀，線粒體分離會破壞通常情況下線粒體不均勻的分支結構，并產生相對均勻的球形細胞器[67]。在組織均質化過程中，線粒體網狀膜結構會被破裂，必須迅速重新組裝才能產生明顯的“完整”細胞器?？赡茉诰€粒體膜短暫破裂、又重新組裝的過程中，可溶性基質酶從線粒體基質中丟失，從而稀釋氧化磷酸化或活性氧解毒所需的基質成分，破壞了線粒體內膜及其呼吸鏈復合物的結構完整性。因此，使用離體的線粒體檢測線粒體功能具有一點的缺陷性。

5.2 活細胞水平 目前，藥物毒性評價常用的體外細胞模型有正常細胞系、癌細胞系和原代細胞系等，主要采用2D培養的方式，但是2D培養難以維持細胞立體結構形態和細胞間的聯系，導致細胞培養與體內器官真實情況相差較大。3D培養跨越二維細胞培養和機體整體，模擬體內環境，3D模型可增強細胞之間的黏附以及維持細胞骨架，增加細胞間交流[68]。細胞形態和信號轉導通常比常規的2D細胞培養更具有生理學特性。在平面2D組織培養基質上生長的細胞在形態，細胞-細胞和細胞-基質相互作用以及與在更接近生理環境的3D培養中生長的細胞在功能檢測等方面可能存在很大的差異。但3D培養模型模仿體內組織狀況的能力各不相同而且缺乏血管系統以及小分子信號傳導等，通常模仿靜態或者短期狀態很難代表體內系統[69]。

原代細胞系是評估外源性藥物或內源性物質線粒體毒性的理想模型。然而，原代細胞培養費時，價格昂貴，以及它們在培養中的短暫存活力，共同限制了原代細胞在藥物開發領域的效用。由于這些原因，腫瘤來源的、不朽的細胞系已成為用于藥物發現和檢測線粒體毒性的常用細胞模型。癌細胞具有永生化的分裂能力，而且生長能力比較強。即使在氧氣充足的條件下，癌細胞也能通過糖酵解產生幾乎所有的ATP，然后進行乳酸發酵[70]。因此，以葡萄糖為底物時癌細胞對線粒體毒物的敏感性較低。細胞有氧呼吸被高濃度的葡萄糖抑制，從早期的細胞培養開始，為了方便，細胞一直在含有25 mm葡萄糖的培養基中生長，這比正常水平高出5倍。在這種情況下，細胞不會大量使用線粒體來產生ATP，因此當評估候選藥物在這些細胞中的潛在毒性時，即使存在非常強的線粒體毒素，也不會檢測到細胞死亡。一種可能的辦法是更換底物，以半乳糖代替培養基中的葡萄糖。半乳糖很難被轉換為葡萄糖，無法通過糖酵解產生ATP，用于生長的能量通過谷氨酰胺代謝獲得[70-71]。谷氨酰胺被線粒體谷氨酰胺酶分解為谷氨酸，然后通過谷氨酸脫氫酶轉化為酮戊二酸，并在三羧酸循環中進一步處理，最后結合磷酸化產生ATP[72-73]。因此，在培養基中用半乳糖代替葡萄糖可迫使細胞依賴氧化磷酸化（OXPHOS）來產生必要的ATP，增加細胞對線粒體毒性物質的敏感性[74-75]。

5.3 體內評估體系 離體的線粒體，培養的細胞和整個生物體之間有許多重要的線粒體功能不同。這些差異包括細胞內能量轉移、細胞間基質作用以及核受體等機體的調控作用，可能影響藥物對線粒體毒性的敏感性。體內評估體系是在整個生物體的背景下檢測線粒體，使其在生理上更具相關性。體內模型也是研究線粒體功能失調對早期發育影響的理想方法[76]。

斑馬魚和秀麗隱桿線蟲的體積小，可以像細胞一樣培養在多孔板中，繁殖力強且發育迅速，因此非常適合進行體內毒理學和藥物發現研究。斑馬魚和秀麗隱桿線蟲作為廉價的動物模型，在獲得體內關鍵數據的同時，可測量體內多個功能指標，實現實時高通量藥物的體內檢測，不僅可以在體內篩選化學藥物，而且也可以對其作用機制進行深入分析。也可以進行跨代研究，因為它們繁殖力強而且胚胎是半透明的，可以可視化體內的細胞和亞細胞現象，研究人員可以輕松地監視器官的發育[77-78]。此外，秀麗隱桿線蟲和斑馬魚的基因可進行處理，轉基因體和遺傳突變體也很容易獲得，因此增加了實驗可行性。已被用作多個線粒體高通量檢測平臺的模型，包括使用熒光報告基因分析斑馬魚體內神經元線粒體，利用XFe24細胞能量分析儀測定斑馬魚幼蟲線粒體生物能，利用秀麗隱桿線蟲檢測環境污染物的線粒體毒性等[79-80]。

不同動物、不同組織線粒體對毒性物質的敏感性不同[81-83]。有文獻報道，在相同濃度的膽紅素暴露下，腦線粒體磷酸化幾乎完全解耦聯，而肝臟線粒體僅不到50%解耦聯。線粒體產能的閾值會隨著年齡的增長或缺乏運動而減少，這表明，與年輕活躍的嚙齒動物比較，久坐不動的年老嚙齒動物可能更適合研究藥物誘發的線粒體功能障礙[84-85]。因此，動物模型的選擇應考慮線粒體的易感性。

6 線粒體毒性評價技術

線粒體結構復雜，功能多樣，不僅是細胞的供能場所，還參與細胞死亡、腫瘤形成、細胞分化等重要過程。線粒體也是最容易受損的一個細胞器，其可以顯示細胞受損的程度。開發實時監測線粒體結構和功能指標變化的分析方法對于預防和診斷藥源性線粒體損傷相關疾病具有重要的意義。

6.1 熒光成像技術 線粒體內含有各種生物活性物質，如活性氧、活性硫、活性氮、各種生物活性離子等，它們在人體各種生理和病理過程中發揮著重要作用，其含量水平的異常都可直接影響線粒體功能并導致臟器功能降低，嚴重時甚至危及生命。因此，精確檢測線粒體內活性成分含量變化對于從分子水平上研究藥物毒性與臟器功能之間的關系具有非常重要的生物醫學意義。熒光標記技術作為一種可視化、實時、動態的演示技術，熒光探針在活細胞中具有高靈敏度、高空間分辨率和實時成像等優點，在研究線粒體活動過程中被廣泛地應用，通過熒光成像技術研究藥物對線粒體功能影響已成為熒光探針領域的熱點。目前常用特異靶標熒光探針結合共聚焦熒光顯微鏡和流式細胞儀進行藥物線粒體毒性評價。線粒體成像熒光探針主要對線粒體成像和對線粒體內各種活性物質成像，通過熒光成像技術對線粒體結構和功能進行研究，如線粒體形態變化、線粒體內環境（pH值、黏度、電位等）變化、線粒體內源性活性氧物質的檢測、ATP、谷胱甘肽等。近年來，人們對各種用于檢測線粒體功能的熒光探針進行了廣泛的研究，靶向定位于線粒體，常見的線粒體功能評價探針有線粒體膜電位探針（JC10、羅丹明123，四甲基羅丹明甲酯）、Ca2+離子探針（Fluo-4）、ROS探針（DCFH-DA）、線粒體質量探針（MitoTracker Green FM，MitoTracker Deep Red FM）、GSH探針（mBCl）[86]。

傳統的熒光成像技術雖然可以實現活細胞層面監測藥物對線粒體功能的動態影響，但是存在檢測通量低，操作繁瑣等局限性。高內涵分析（HCA）是一種基于細胞表型分析的高效新藥篩選技術，能夠在保持細胞結構和功能完整的前提下，同時檢測待測樣品對細胞的形態、生長、周期、遷移、調亡、代謝途徑及信號傳導等方面的影響，從單一實驗中獲取大量有關信息，從而確定化合物的生物活性以及潛在毒性[87]。目前HCA能夠實時監測體外肝細胞與毒性機制相關的多個重耍標志分子，包括細胞核的形態和數量、線粒體膜電位以及氧化應激狀態、調亡與早期DNA損傷的變化等，是體外評價化合物潛在肝毒性、從機制上預測候選藥物安全性的高效手段[88]。該方法能夠彌補動物試驗靈敏度低、試驗周期長，不能量化的缺點，因此，高通量毒性評價技術己成為藥品質量風險與安全風險評估的新的技術趨勢。多指標同步量化對藥物的毒性進行了較為全面的分析，并可對其毒性作用機制做出初步的判斷。

6.2 生化技術 線粒體是細胞的能量源，利用氧化磷酸化（OXPHOS）產生細胞約95%的ATP[9]。這一過程是由氧化磷酸化復合物（I，II，IV和V）完成的。因此，OXPHOS復合物的抑制會導致線粒體毒性。目前，已經開發出基于細胞/組織的免疫捕獲或傳統的生化方法用于測定參與氧化磷酸化的蛋白復合物的活性[89]。線粒體結構復雜，包含13個多肽且都是參與氧化磷酸化的蛋白質亞基，由mtDNA編碼并在線粒體核糖體上合成。位于線粒體內的所有其他蛋白質都是核DNA編碼，在胞質核糖體上合成，然后輸入到線粒體中。干擾mtDNA或mtDNA編碼蛋白合成的藥物會損害氧化磷酸化，導致細胞ATP供應減少。傳統上，采用免疫蛋白印跡法和測流試紙免疫測定法進行這些化合物的檢測，然而，這2種方法都不適合高通量篩選[90-91]。

線粒體具有復雜的多腔結構，是一種復雜的細胞器，存在于每一個普通細胞中。除了產生能量外，線粒體還是活性氧（ROS）的來源，并在許多過程的調控中發揮核心作用，如細胞凋亡或二級信使的存儲[92]。生物傳感器提供了一種創新的工具，用于測量生物體內代謝產物的動態變化。此外，生物傳感器更具有底物特異性，并且由基因編碼，且不會引起不同細胞對探針攝取的異質性問題[93]）。而且，通過選擇合適的啟動子，可以在時間上或空間上限制傳感器的表達。同樣，空間表達可以在細胞內進行調節，通過將引導傳感器的前導肽連接到特定的細胞器或隔室，或者通過產生與定位蛋白質融合的傳感器嵌合體。因此，有可能測量單細胞的單個細胞器中的代謝物，而不是群體。目前，多種生物傳感器已被廣泛應用到線粒體中，用于檢測線粒體功能。

6.3 細胞能量代謝 線粒體最重要的功能是通過OXPHOS為細胞產生能量，因此，線粒體健康的主要標志是呼吸作用[94]。傳統上，利用克拉克電極或將線粒體和整個細胞的耗氧量進行體外檢測，但是缺乏高通量，利用pH和O2敏探針檢測胞外酸化率（糖酵解）及線粒體電子傳遞鏈的功能[95-96]。目前較新的方法（例如使用Seahorse細胞外通量分析儀的方法）可以測量多孔板（24和96孔）中的呼吸（耗氧量）[97]。這種儀器可測量高達10 dpf的完整活斑馬魚和幼蟲的耗氧量與細胞外酸化，以及從器官中仔細解剖的器官幼體和成年斑馬魚。

6.4 代謝組學分析技術 代謝組學（Metabonomics/Metabolomics）是效仿基因組學和蛋白質組學的研究思想，對生物體內所有代謝物進行定量分析，小如細胞，復雜如動物或人，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方式，是系統生物學的組成部分[98-99]。目前，代謝組學在診斷線粒體毒性方面的應用已在涉及抑制脂肪酸β氧化的案例中得到證實?；诖x組學的分析可以很容易地檢測線粒體毒性或遺傳病，而無需分離線粒體。近年來，定量磁共振成像代謝組學已被應用于體外藥物誘導線粒體毒性的研究。這種方法被用于研究C2C12肌管的整體變化，這些肌管被氧化磷酸化復合物I抑制劑（魚藤酮）或氧化磷酸化復合物III抑制劑（抗霉素A）處理[100]。

6.5 電鏡 先進的測試表征技術是認識微觀世界的重要手段，對于尺度和維度觀的培養具有重要意義。不同于傳統光學顯微鏡和電子顯微鏡，原子力顯微鏡是通過其探針原子與樣品的表面原子的作用力來實現對樣品表面形貌觀測的。傳統的光學顯微鏡和電子顯微鏡是通過放大微觀結構，然后直觀的看，但是分辨率有一定的局限性，導致無法觀測表面的細微結構。而AFM是通過與樣品表面的“觸覺”響應來重現事物的形貌。

冷凍電鏡技術是樣品在低溫條件下迅速冷凍后，通過低溫電鏡進行觀察和處理數據。電子顯微鏡在線粒體中的應用主要包括：1）觀察由線粒體調控的細胞凋亡，即觀察凋亡基因蛋白復合體動態變化的結構解析過程;2）觀察有機物在線粒體內膜上的呼吸作用，同時有多種呼吸鏈蛋白復合體共同參與，冷凍電鏡技術可以高效對這類大分子復合物的結構解析?？傊?，冷凍透射電子顯微鏡主要用于高效率地觀察與線粒體活性相關的蛋白復合體的結構解析[101]。

7 結論與展望

總之，線粒體作為細胞內重要細胞器，藥物誘導線粒體功能異常通常與機體臟器損傷密切相關。高效監控線粒體功能與結構動態變化對于藥物安全性評價及相應機體損傷機制研究意義重大。中藥材成分極其復雜，毒性機制涉及多因素，且作用涉及多靶點多途徑，各種成分相互影響、相互作用，使得中藥毒性研究具有極大的挑戰性。未來需要在傳統的離體線粒體及完整細胞評價模型基礎上，開發更具仿生性人源性器官評價模型，同時選擇更加靈敏的線粒體毒性靶標，應用高通量高內涵篩選技術，進行規?；闹形魉幘€粒體毒性評價。此外，線粒體過去被認為是在細胞內相互孤立的細胞能量供應中心，而實際上，其在細胞中相互連接形成網狀結構，并通過不斷的融合與分裂處于一定的動態平衡之中。對于研究藥物致使的器官損傷，在評估線粒體功能時也應該考慮其他細胞器的功能，將細胞內部細胞器作為一個整體網絡進行監測，將有助于理解藥物引起各種損傷機制及病變過程。

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（2020-11-19收稿 責任編輯：王明）