姜黃素對衰老大鼠內皮祖細胞功能的影響

宰青青，葉 蘭，秦 臻，潘 婷

（1.銅仁職業技術學院，貴州 銅仁 554300；2貴州醫科大學基礎醫學院，貴州 貴陽 550025）

衰老是復雜多變的一個過程，也是生物體發展的必定趨向。構成生物體的單位是細胞，所以細胞的衰老是造成整個機體衰老的前提。EPCs是能分化成內皮細胞的干細胞，有非常強的增殖能力，分布在骨髓和外周血等組織里，可以促進損傷內皮的修復和參與新生血管的生成[1]。遺傳因素和機體自身環境都會對其功能和增殖分化能力造成影響。研究表明伴隨機體的衰老，EPCs會表現出動員不夠、數目變少、增殖分化能力顯著下降等老化的現象，此外，衰老機體自身的危險因素也會加快EPCs的衰老，使其難以發揮對血管內皮的更新和修復作用[2-3]。姜黃素是一種抗衰老的中藥且具有安全有效特點，通過觀察實驗中姜黃素對衰老大鼠骨髓源性EPCs功能影響，探討姜黃素對衰老EPCs機制可能的結果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD雄性大鼠50只，體重在210～270g，本次實驗大鼠來源于貴州醫科大學實驗動物中心標準飼料飼養的大鼠，合格證號：SCXK（黔）2018-0001。

1.2 主要試劑和儀器

姜黃素（Sigma公司）；D-半乳糖（Sigma公司）；M199培養液（HyClone公司）；胎牛血清（PAA公司）；D i l 標記的乙酰化低密度脂蛋白（奕源生物科技有限公司）；FITC標記的荊豆凝集素1（Sigma公司）；transwell小室（Corning公司）；CO2培養箱（Thermo Forma公司）；酶標儀（Bio-tek公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS公司）。

1.3 動物分組處理

按體重將SD雄性大鼠隨機分成5組，即對照組、模型組和姜黃素高、中、低劑量組各10只。參照文獻方法造模[4]，4個實驗組天天腹腔注射D-半乳糖100 mg/kg，持續60天，注射的同時干預給藥。姜黃素高、中、低劑量組每天予以400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg姜黃素進行灌胃，同時另外兩組灌胃等量的生理鹽水，持續60天。

1.4 EPCs的分離、培養及鑒定[5]

脫頸處死大鼠后，無菌環境下進行股骨和脛骨的分離，用M199培養液將細胞沖至離心管中，對200目細胞進行篩濾，1000 r/min×5 min離心后重懸；將重懸液按1：1慢慢加到大鼠骨髓淋巴細胞分離液的上面，2000 r/min×20 min離心，小心的用吸管吸出位于第二層的單個核細胞層，然后用M199培養液1500 r/min×5 min離心洗滌兩次。用M199全培養液重懸后計數，以5×106cells/mL的接種在24孔板上，各組細胞分別置于37℃、5% CO2培養箱中，3d換液1次。

將培養至第7 d的貼壁細胞棄上清，先加入含2.4 mg/L Dil-ac-LDL的M199培養液，1h后固定于4%多聚甲醛中，隨后再加含有10mg/L FITC-UEA-1的M199培養液，置培養箱中作用1h，經過PBS漂洗，避光封片處理后。 用倒置熒光顯微鏡觀察制作好的片子，吞噬ac-LDL的細胞發紅光，結合UEA-1的細胞發綠光，同時吞噬ac-LDL及結合UEA-1的細胞為正在分化的大鼠EPCs。

1.5 EPCs功能的檢測

1.5.1 EPCs細胞集落形成能力檢測

培養至第7 d，鏡下隨機選取5個培養孔計算各組EPCs集落形成的數量。

1.5.2 EPCs增殖力檢測

收集各組培養至第7d的細胞，并進行計數，將等量的EPCs接種于96孔板上，各組設復孔5個，細胞貼壁后加20μL5%的MTT，持續培養4h后棄上清，加150μL的二甲基亞砜充分震蕩，放入酶標儀選用490nm測其吸光值，實驗重復3次。

1.5.3 EPCs遷移力檢測

將之前收集好的各組等量細胞液加在transwell小室的上室，下室是含有50 mg/L VEGF的培養液，1 d后用PBS淋洗，下室中加1mL4%多聚甲醛進行固定30 min，適當吹干后，Geimsa染色30 min，用PBS淋洗，取出濾膜封片，隨機選5個視野進行計數，實驗重復3次。

1.5.4 EPCs成小管力檢測

按照試劑盒操作，將膠液和稀釋液過夜凍融，900 μL膠液中加入100 μL稀釋液混勻加入96孔板，每孔50 μL，孵育l h凝固成膠；將各組細胞以5×103 cell/孔接種于膠上；培養1 d后，鏡下觀察小管生成狀況，隨機選5個視野進行計數，實驗重復3次。

1.6 統計學處理方法

用SPSS 17.0軟件處理，用（±s)表示計量資料，當方差齊性時，用單因素方差進行組間對比分析，當方差不齊時，用Kruskal-Wallis秩和檢驗，P＜0.05表示差異具有顯著性，P＜0.01表示差異具有極顯著性。

2 結 果

2.1 EPCs 的鑒定（圖1）

貼壁細胞分別經過Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1處理，用熒光顯微鏡觀察，同時攝取Dil-ac-LDL和結合FITC-UEA-1的細胞為所需的EPCs。

2.2 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的骨髓EPCs功能的影響（見表1）

與對照組對比，模型組骨髓EPCs的功能嚴重受損（P＜0.05）；與模型組對比，姜黃素高、中兩個組均可提高EPCs的各項能力（P＜0.05，P＜0.01）。該結果顯示姜黃素可明顯改進衰老大鼠受損EPCs的功能，延緩細胞衰老。

圖1 EPCs的鑒定（×200）

表1 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影響（±s，n=3）

表1 姜黃素對D-半乳糖所致衰老大鼠的EPCs功能的影響（±s，n=3）

注：和對照組作比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；和模型組作比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 集落數(個) 增殖力(OD) 遷移力(cells×200) 成小管力 (cells×200)對照組 2.4±1.14* 0.31±0.02** 55.6±5.13** 36.8±7.26**模型組 0.6±0.55△ 0.22±0.04△△ 35.4±4.39△△ 22.4±3.78△△姜黃素高劑量組 2.2±1.48* 0.30±0.04** 52.4±4.39** 36.2±6.26**姜黃素中劑量組 1.8±1.30 0.28±0.03* 44.8±4.44** 31.8±4.82*姜黃素低劑量組 0.8±0.84 0.26±0.02 40.4±5.59 25.4±4.04

3 討 論

隨著經濟的發展和人口的老齡化，動脈粥樣硬化、阿爾茨海默病、癌癥等與衰老相關疾病的發病率和死亡率日益增高，如何安全有效地延緩衰老已變成人們關注的焦點，因而抗衰老藥物及其機制的研究已變成目前研究的熱點。現代藥理學研究顯示[6]姜黃素有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血糖等作用，對衰老的各個方面都有一定的抑制作用。本實驗通過在整體水平上觀察姜黃素對EPCs衰老的干預效果，表明姜黃素可明顯增進衰老EPCs的數目并改進其功能，促進衰老EPCs的活性，有效延緩細胞的老化進程，但其具體的信號通路還需進一步深入研究。