復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭和亞?wèn)|鮭抗氧化、非特異性免疫及消化酶指標(biāo)的影響

孫學(xué)亮，楊樹(shù)元，陳書(shū)奇，孟凡亮，陳成勛，郭永軍，于宏

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津市西青區(qū)楊柳青鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，天津 300380；3.天津豐沛水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，天津 300000）

冷水性魚(yú)類白點(diǎn)鮭Salvelinus pluvius，隸屬于鮭科紅點(diǎn)鮭屬，原產(chǎn)于日本河川、溪流中。白點(diǎn)鮭體呈紡錘型，被很小的圓鱗，體色為青灰色，因體背、側(cè)部有白色斑點(diǎn)而得名[1,2]。亞?wèn)|鮭Salmo trutta fario系與褐鱒同物異名，是鮭科魚(yú)類中重要養(yǎng)殖種，在西藏亞?wèn)|地區(qū)有分布，為國(guó)外引進(jìn)種[3-5]。隨著養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)增，水產(chǎn)藥物的使用對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。在養(yǎng)殖過(guò)程中，長(zhǎng)期使用抗生素、重金屬等大量化學(xué)合成藥劑既增加養(yǎng)殖動(dòng)物的抗藥性，也會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，危害人類食用健康，因此尋找環(huán)保的替代藥物尤為重要。

中草藥在我國(guó)歷史悠久，資源豐富，價(jià)格低；具有抗微生物、增強(qiáng)免疫力、營(yíng)養(yǎng)和抗應(yīng)激作用；不易產(chǎn)生抗藥性、無(wú)殘留、副作用小、不污染環(huán)境。研究證明：中草藥可以提高機(jī)體免疫力，防治疾病有很好療效[6-9]，現(xiàn)正逐漸受到重視和青睞[10,11]。

本試驗(yàn)遵循中藥配伍原則，在基礎(chǔ)飼料中添加0.5%復(fù)方中草藥（大黃、黃芪、連翅、黃苓和丹皮），通過(guò)研究復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭和亞?wèn)|鮭的影響，旨在為復(fù)方中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用健康白點(diǎn)鮭及亞?wèn)|鮭取自天津市豐沛水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司，平均體質(zhì)量分別為（224.14±26.73）g 和（152.12±7.46）g。

將購(gòu)于當(dāng)?shù)刂兴幏康拇簏S、黃芪、連翅、黃苓和丹皮先分別用粉碎機(jī)超微粉碎，再過(guò)120 目鋼篩，最后按等比例混合均勻制成復(fù)合中草藥，干燥通風(fēng)處存放備用。

1.2 方法

1.2.1 飼料制備

本試驗(yàn)用的基礎(chǔ)飼料為丹麥艾樂(lè)牌魚(yú)類配合飼料，其營(yíng)養(yǎng)組成為粗脂肪15%、粗蛋白45%、無(wú)氮浸出物21.9%、灰分6.9%、粗纖維3.3%、Na 0.2%、P 0.9%和Ca 0.8%。每kg 礦物質(zhì)預(yù)混料含：Zn 70 mg、Cu 5 mg 和Mn 12 mg。每kg 維生素預(yù)混料含：VD 1000 IU、VE 200 mg 和VA 10000 IU。首先將基礎(chǔ)飼料用粉碎機(jī)超微粉碎過(guò)100 目篩，再按0.5%的比例添加復(fù)方中草藥（大黃、黃芪、連翅、黃苓和丹皮），混合均勻后用制粒機(jī)制成顆粒料，干燥通風(fēng)處存放備用。

1.2.2 飼養(yǎng)管理

將白點(diǎn)鮭和亞?wèn)|鮭用基礎(chǔ)飼料馴養(yǎng)2 周后，選擇健康無(wú)傷和規(guī)格統(tǒng)一的魚(yú)隨機(jī)分成10 組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾。用添加0.5%復(fù)方中草藥后的飼料投喂，日投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的1%，以全部攝食為準(zhǔn)，每天投喂2 次。每天清理池底一次，日換水量不超過(guò)水體1/3。試驗(yàn)期間，24 h 曝氣，水溫10～12℃，pH6.5～7.5。溶氧量不低于7.0 mg/L，投喂試驗(yàn)持續(xù)28 d。

1.2.3 樣品采集

在投喂0d、7d、14d、21d、28d 時(shí)，每次各組所有平行均分別隨機(jī)采集5 尾，記錄每尾魚(yú)體質(zhì)量和體長(zhǎng)，注射器吸取少量肝素后從魚(yú)尾柄腹側(cè)處抽血。先將抽出的血放入離心管中，于4℃下離心10 min，取上清液放入干凈的離心管中，做好標(biāo)記于-80℃冰箱中保存。抽血后立即解剖，取腸道放入離心管中，做好標(biāo)記后裝入封口塑料袋，于-80℃冰箱中保存。測(cè)定時(shí)，準(zhǔn)確稱量組織后，按1∶9 的比例添加生理鹽水，用高通量組織研磨器研磨10 min 后，用低溫高速離心機(jī)4℃離心10 min，取上清液測(cè)定各指標(biāo)。

1.2.4 樣品測(cè)定

SOD、CAT、T-AOC、AKP、ACP、溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性及MDA 和NO 含量均采用南京建成生物工程技術(shù)研究所的試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。用Excel 2003 及SPSS18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和單因素方差分析（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭抗氧化指標(biāo)的影響

由表1 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料21d 時(shí)的亞?wèn)|鮭血液T-AOC 活力顯著高于0d 和28d（P＜0.05），7d、14d 和21d 間差異不顯著（P＞0.05）；MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）；14d 時(shí)SOD 活力顯著高于0d 和7d（P＜0.05），14d、21d 和28d 時(shí)差異不顯著（P＞0.05）；CAT 活力差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭血液抗氧化指標(biāo)的影響

由表2 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料14d 的白點(diǎn)鮭血液T-AOC 活力顯著高于其他組（P＜0.05），0d 與7d 差異不顯著（P＞0.05）；MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）；SOD 活力差異不顯著（P＞0.05）；21d 時(shí)CAT 活力顯著高于其他組（P＜0.05），其他組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭血液非特異性免疫指標(biāo)的影響

復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭血液非特異性免疫指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表。由表3 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料7d 和14d 的亞?wèn)|鮭血液AKP 活力顯著高于其他組（P＜0.05），14d 與0d 時(shí)差異顯著（P＜0.05）；7d和14d 時(shí)ACP 活力顯著高于其他組（P＜0.05），14d與0d 時(shí)差異顯著（P＜0.05）；14d 時(shí)NO 濃度在顯著高于其他組（P＜0.05）；14d 時(shí)LZM活性與0d 差異顯著（P＜0.05），與7d、21d 和28d 差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭血液非特異性免疫指標(biāo)的影響

由表4 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料的白點(diǎn)鮭的AKP 活力差異不顯著（P＞0.05）；7d、14d 和21d 時(shí)ACP 活力顯著高于其他組（P＜0.05），0d 與其他時(shí)間段差異顯著（P＜0.05）；NO 濃度在7d 和14d 顯著高于其他組（P＜0.05）；21d 時(shí)LZM 含量顯著高于其他組（P＜0.05），0d、7d 和14d 時(shí)差異不顯著（P＞0.05）。

表1 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭血液抗氧化指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood antioxidant indicators in salmon Salmo trutta fario

表2 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭血液抗氧化指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood antioxidant indicators in charr Salvelinus pluvius

2.5 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭腸道消化酶指標(biāo)的影響

由表5 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料的亞?wèn)|鮭腸道蛋白酶活力差異不顯著（P＞0.05）；淀粉酶活力在14 d 顯著高于其他組（P＜0.05）；14 d 時(shí)脂肪酶活力在顯著高于其他組（P＜0.05），7 d 和14 d 差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭腸道消化酶指標(biāo)的影響

由表6 可知，攝食含復(fù)方中草藥飼料的白點(diǎn)鮭腸道蛋白酶活力差異不顯著（P＞0.05）；14 d 時(shí)淀粉酶活力顯著高于其他組（P＜0.05），其他組差異不顯著（P＞0.05）；脂肪酶活力差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭血液抗氧化指標(biāo)的影響

血液是反應(yīng)機(jī)體免疫代謝等的重要組織。血液中的SOD、CAT、MDA 和AOC 是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。SOD 和CAT 是機(jī)體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，MDA 是反映機(jī)體過(guò)氧化和損傷程度的常用指標(biāo)，T-AOC 是反映機(jī)體內(nèi)總抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)水平的重要指標(biāo)。吳彬[12]研究表明，飼料中添加黃芩、金銀花、板藍(lán)根、黃芪可以顯著提升吉富羅非魚(yú)Oreochromis niloticus 幼魚(yú)的SOD 和CAT 活力。張照紅[13]研究表明，添加復(fù)方中草藥可以顯著影響羅非魚(yú)和草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus 的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，14d 時(shí)亞?wèn)|鮭SOD 活力顯著高于0 d，這與孫學(xué)亮等[14]對(duì)復(fù)方中草藥促進(jìn)山女鱒Oncorhynchus masou masou、白點(diǎn)鮭和亞?wèn)|鮭肝臟的SOD 活力的研究結(jié)果一致，也與譚娟等[15]對(duì)復(fù)方中草藥對(duì)草魚(yú)幼魚(yú)的SOD 影響的研究結(jié)果一致。在7d、14d 和21d 時(shí)，亞?wèn)|鮭AOC 活力與0d 差異顯著，在21d 時(shí)較顯著，14d 時(shí)白點(diǎn)鮭AOC 活力顯著高于0d，這與崔惟東等[16]研究的蝦青素和角黃素對(duì)虹鱒肌肉著色和肝臟總抗氧化能力的影響結(jié)果一致。在21d 時(shí)白點(diǎn)鮭CAT 活力顯著高于0d，與史瑋琪[17]對(duì)飼料中添加復(fù)方中草藥能一定程度促進(jìn)吉富羅非抗氧化能力的研究結(jié)果一致。綜上所述，復(fù)方中草藥可以提高亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭的抗氧化能力，但是，活力達(dá)到最高后下降。這說(shuō)明復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭、亞?wèn)|鮭具有雙向調(diào)節(jié)作用，適量添加有促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體免疫的作用，而過(guò)量添加會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)作用。

表3 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭血液非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood non-specific immune indicators in salmon Salmo trutta fario

表4 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭血液非特異性免疫指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of compound Chinese herbal medicine on blood non-specific immune indicators in charr Salvelinus pluvius

表5 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭腸道消化酶指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of compound Chinese herbal medicine on activities of digestive enzymes in digestive tract of salmon Salmo trutta fario

表6 復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭腸道消化酶指標(biāo)的影響Tab.6 Effects of compound Chinese herbal medicine on activities of digestive enzymes in intestine of charr Salvelinus pluvius

3.2 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭非特異性免疫指標(biāo)的影響

魚(yú)類雖為低等動(dòng)物，但具有較完善的免疫系統(tǒng)。溶菌酶（LSZ）是魚(yú)類非特異性免疫的第一道屏障，是一種具有抗菌活性的水解酶，能溶解細(xì)胞壁使細(xì)胞破裂，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有溶菌的作用[18]。測(cè)定魚(yú)體的LSZ 活力，可以在一定程度上反映魚(yú)類非特異性體液免疫狀態(tài)[19]，是非常重要的非特異性免疫評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。NO 可直接進(jìn)入靶細(xì)胞與酶結(jié)合作用于平滑肌使血管擴(kuò)張[20]，一定程度上增強(qiáng)魚(yú)類的免疫力。酸性磷酸酶是吞噬溶酶體的重要組成部分，主要參與磷酸酯的代謝，在魚(yú)類體內(nèi)更是溶酶體的標(biāo)志酶[21]，具有調(diào)節(jié)代謝及信號(hào)傳導(dǎo)等功能。堿性磷酸酶一種膜結(jié)合蛋白，在鈣磷分泌和吸收中，尤其是免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22,23]。本研究表明，14d 時(shí)亞?wèn)|鮭的LSZ 活力顯著高于0d；21d 白點(diǎn)鮭LSZ 活性在顯著高于0d、7d、14d，與其他組差異不顯著。這與Zhang 等[24]和Tang 等[25]用添加2 種復(fù)方中草藥提取物的飼料投喂胭脂魚(yú)Myxocyprinus asiaticus 和羅非魚(yú)能顯著提高魚(yú)血清中LSZ 活性的結(jié)果一致。亞?wèn)|鮭AKP 活力在7d 和14d 時(shí)顯著高于其他組，ACP 活力在7d 和14d 時(shí)顯著高于其他組，白點(diǎn)鮭ACP 活力7d、14d 和21d 顯著高于其他組，0d 與其他組差異顯著，這與馬維波[26]對(duì)復(fù)方中草藥能提升香魚(yú)Plecoglossus altivelis 機(jī)體內(nèi)ACP 和AKP 酶活力的研究結(jié)果一致。NO 濃度在7d 和14d顯著高于其他組，這與孔江紅[27]的研究結(jié)果一致。其研究結(jié)果表明，兩種復(fù)方中草藥能提高斜帶石斑魚(yú)Epinephelus coioides 非特異性免疫功能。綜上所述，復(fù)方中草藥可以提高亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭非特異性免疫能力，但是這些指標(biāo)都在達(dá)到最顯著之后開(kāi)始下降，說(shuō)明復(fù)方中草藥對(duì)白點(diǎn)鮭和亞?wèn)|鮭非特異性免疫有雙重調(diào)節(jié)作用，過(guò)量添加會(huì)產(chǎn)生副作用。

3.3 復(fù)方中草藥對(duì)亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭腸道消化酶活性的影響

本研究表明，亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭腸道淀粉酶活力在14d 顯著高于其他組；白點(diǎn)鮭脂肪酶活力在14d顯著高于0d、21d 和28d，這與相關(guān)研究結(jié)果一致。劉慧吉等[28]的研究表明：飼料中添加復(fù)方中草藥可以顯著提高花鱸Lateolabrax maculatus 腸道淀粉酶和蛋白酶的活力。文國(guó)樑等[29]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方中草藥可以提高凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei 的淀粉酶和蛋白酶活力。李金龍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加中草藥可顯著提高黃鱔Monopterus albus 淀粉酶和蛋白酶活性。但是，魚(yú)類腸道消化酶活性與中草藥的品種、養(yǎng)殖動(dòng)物的種類、生長(zhǎng)階段、飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平等有關(guān)。

3.4 結(jié)論

給亞?wèn)|鮭和白點(diǎn)鮭投喂添加復(fù)方中草藥的飼料28 d 后表明：（1）投喂14 d 時(shí)，亞?wèn)|鮭血液抗氧化能力、非特異性免疫及消化酶指標(biāo)明顯提高，其中SOD、AKP、ACP、NO 和淀粉酶差異顯著；（2）投喂14 d 時(shí)，白點(diǎn)鮭血液抗氧化性、非特異性及消化酶指標(biāo)明顯提高，其中SOD、ACP、T-AOC 和淀粉酶活性差異顯著。

綜上所述，投喂添加0.5%復(fù)方中草藥的飼料，對(duì)白點(diǎn)鮭、亞?wèn)|鮭血液抗氧化能力、非特異性免疫及消化酶指標(biāo)有促進(jìn)作用，投喂14 d 時(shí)效果最佳。