非酒精性脂肪性肝病患者葡萄糖代謝率與血清炎癥指標(biāo)變化的關(guān)系

余啟馨，葉建紅，林 旋，王家樂，何東盈，勞美鈴

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405；2.佛山市中醫(yī)院 內(nèi)分泌科，廣東 佛山528000)

目前非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發(fā)病機制仍未完全明確，胰島素抵抗是NAFLD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。而炎癥因子又與胰島素抵抗關(guān)系密切，近年來研究顯示，炎癥因子如超敏-C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等可以通過影響信號傳導(dǎo)通路引起胰島素抵抗[1]，可能是胰島素抵抗的主要分子機制。本研究采用評估胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)—高胰島素正常血糖鉗夾實驗，定量檢測葡萄糖代謝率(M)，精確評估胰島素抵抗程度，探討NAFLD患者胰島素抵抗與血清炎癥因子hs-CRP、IL-6、TNF-α水平變化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

所有研究對象均來自佛山市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，根據(jù)2018年中華醫(yī)學(xué)會肝臟病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)分會提出的NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]篩選NAFLD患者30例，其中男18例，女12例，年齡32-60歲。排除已明確診斷為糖尿病、合并嚴(yán)重肝、腎功能損害、心腦血管病、甲狀腺疾病等患者。另選擇同期年齡、性別相匹配的健康體檢者30例為對照組，男19例，女11例，經(jīng)檢測血糖、血脂、肝功能、血壓均正常。

1.2 方法

1.2.1生化指標(biāo)與血清炎癥指標(biāo)測定 采用酶化學(xué)發(fā)光法測定胰島素， C 肽及皮質(zhì)醇；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測 hs-CRP，IL-6，TNF-α，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2高胰島素-正常血糖鉗夾試驗 所有受試者均進(jìn)行高胰島素-正常血糖鉗夾試驗，具體操作方法參考賈偉平[3]的報道以及我們改進(jìn)的方法[4]。 操作方法：試驗前一晚8點后禁食，試驗當(dāng)天上午8點排空小便后平靜臥床。分別于兩側(cè)上肢建立靜脈通道，一側(cè)上肢置于溫度為45±3℃的恒溫套中以獲得動脈化的靜脈血樣，輸注生理鹽水以維持取血，另一側(cè)用于輸注20%葡萄糖液和胰島素溶液。在鉗夾試驗開始10 min內(nèi)輸注負(fù)荷量胰島素溶液(Novolin R，40 U/mL，丹麥Novo公司)，使血漿胰島素水平迅速升高，隨后140 min內(nèi)以40 mU·m-2·min-1速率持續(xù)輸注，在此期間，每5 min測定1次動脈化的靜脈血葡萄糖。鉗夾期間每10 min取血測定胰島素，每30 min取血標(biāo)本測 C肽和皮質(zhì)醇。計算鉗夾過程中120-150 min(穩(wěn)態(tài)期)的M，作為評價IR程度的指標(biāo)。所有血樣均離心分離血清，-20℃保存待測胰島素，C肽及皮質(zhì)醇。實驗結(jié)束后留取小便測定尿糖濃度。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計分析在SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包上完成，采用兩獨立獨立樣本t檢驗、秩和檢驗，相關(guān)分析采用Pearson法。顯著性水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD組與對照組基線資料、生化指標(biāo)與炎癥指標(biāo)比較

見表1。兩組在性別、年齡等方面無顯著差異(P>0.05)，資料具有可比性；兩組在TC、LDL-C等方面無顯著性差異(P>0.05)，NAFLD組的WC，BMI，2hPG，F(xiàn)INS，TG，ALT、AST等均顯著高于對照組(P<0.01)，HDL-C顯著低于對照組(P<0.01)； NAFLD 組hs-CRP、IL-6 和 TNF-α 水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 對照組與NAFLD組臨床資料、生化指標(biāo)IL-6、hs-CRP、TNF-α比較

注：△P>0.05 vs對照組，*P<0.01 vs對照組，IL-6、hs-CRP、TNF-α用中位數(shù)(上-下1/4)表示。

2.2 高胰島素-正常血糖鉗夾技術(shù)的建立與評估

2.2.1鉗夾過程中血糖、血清胰島素水平 基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組血糖水平分別為(5.07±0.60) mmol/L和(5.58±0.63) mmol/L，在鉗夾試驗開始30 min后直至試驗結(jié)束，血糖穩(wěn)定在目標(biāo)值5.0 mmol/L，血糖變異度<5%。基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組胰島素水平分別為(9.03±3.30) mIU/L和(12.96±5.06)mIU/L，正常血糖鉗夾開始后，血清胰島素水平迅速升高，在10 min達(dá)到高峰，對照組和NAFLD組分別為(97.28±8.61) mIU/L和(125.51±11.78) mIU/L，隨后維持在一個高水平直至鉗夾結(jié)束，對照組和NAFLD組分別為(66.75±5.67) mIU/L和(73.64±6.59) mIU/L。

2.2.2鉗夾過程中內(nèi)源性胰島素分泌與皮質(zhì)醇變化 如表2所示，基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組C肽水平分別為(415.35±189.66) pmol/L和(601.54±201.23) pmol/L，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比，兩組C肽水平在整個鉗夾過程各個時點中均呈下降趨勢。基礎(chǔ)狀態(tài)對照組和NAFLD組皮質(zhì)醇水平分別為(211.84±121.37)nmol/L 和(224.74±105.38)nmol/L ，與基礎(chǔ)狀態(tài)相比較，兩組皮質(zhì)醇水平在整個鉗夾過程各個時點中均無異常升高。

2.2.3高胰島素正常鉗夾實驗中葡萄糖代謝 葡萄糖輸注率在鉗夾試驗的前60 min內(nèi)上升較快，NAFLD組的葡萄糖輸注率在60 min時為(3.48±0.29) mg·kg-1·min-1，對照組為(6.75±0.43)mg·kg-1·min-1，此后兩組趨于緩慢上升，在120 min時達(dá)到穩(wěn)態(tài)。穩(wěn)態(tài)時(120-150 min)對照組和NAFLD組的M分別為(8.65±1.63 )mg·kg-1·min-1和(4.72±1.37)mg·kg-1·min-1，NAFLD組的M顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 M值與各指標(biāo)的相關(guān)分析

在NAFLD組，與M相關(guān)的臨床指標(biāo)有WC、BMI、TG、HDL-C、FINS，r值分別為-0.483、-0.449、-0.565、0.433、-0.578，P分別為0.005、0.012、0.001、0.015、0.001，IL-6、hs-CRP及TNF-α均與M呈負(fù)相關(guān)(r=-0.563、-0.580、-0.598，P=0.001、0.001 、0.001)，見表3。

表2 鉗夾試驗中對照組與NAFLD組C肽與皮質(zhì)醇變化

表3 NAFLD組M值與各指標(biāo)的相關(guān)分析

3 討論

NAFLD的發(fā)病機制尚未全明了，也缺乏特異的針對性治療藥物。已有相關(guān)細(xì)胞實驗，動物實驗以及臨床研究等表明，胰島素抵抗可能是NAFLD的重要發(fā)病機制之一[5，6]。然而在既往的研究中，評估胰島素胰島素抵抗的方法大多采用HOMA-IR，這一方法雖簡單易行，而最大局限是干擾因素太多，也不能精確、定量評估胰島素抵抗程度。為此，我們采用評估胰島素抵抗的“金標(biāo)準(zhǔn)”—高胰島素正常血糖鉗夾技術(shù)，檢測NAFLD患者的M，評估其胰島素抵抗程度。本研究結(jié)果顯示，NAFLD患者的M顯著低于正常人群，表明其有明顯的胰島素抵抗。同時，本研究中也發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者具有明顯的超重，高血脂，糖耐量異常等臨床特征，提示NAFLD與代謝綜合征(MS)具有密切的聯(lián)系，其胰島素抵抗的發(fā)生可能是諸多代謝紊亂共同導(dǎo)致的結(jié)果，也提示我們在NAFLD的防治中更應(yīng)注重整體的綜合治療。

近年來，炎癥機制與胰島素抵抗的關(guān)系已成為當(dāng)今研究的熱點。研究表明，2型糖尿病及肥胖狀態(tài)下白色脂肪組織中積聚的巨噬細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞可分泌大量炎癥因子，各種炎癥因子主要通過 IKK/NF-κB通路導(dǎo)致胰島素抵抗。在既往的研究發(fā)現(xiàn)，MS人群的M明顯降低，血漿炎癥抑制白介素10明顯降低[7]，炎癥因子白介素18明顯升高，提示MS人群的胰島素抵抗與炎癥變化有關(guān)。此外，我們進(jìn)行了MS人群M與血清脂肪因子關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明[8]， MS人群的葡萄糖代謝率明顯降低，血清脂聯(lián)素明顯降低，瘦素與抵抗素水平明顯升高，其胰島素抵抗與血清脂聯(lián)素降低，瘦素與抵抗素升高有關(guān)。為了進(jìn)一步探討與MS關(guān)系密切的NAFLD患者的胰島素抵抗與炎癥因子的關(guān)系，本研究檢測了評估慢性炎癥狀態(tài)的代表性指標(biāo)TNF-α，IL-6與hs-CRP水平。結(jié)果顯示，NAFLD 患者血清的TNF-α，IL-6與hs-CRP水平均顯著升高，提示本組NAFLD患者體內(nèi)存在明顯的慢性炎癥狀態(tài)。

CRP主要在肝臟合成，為維持其作為急性期反應(yīng)物的作用，肝臟中CRP的產(chǎn)生在很大程度上受促炎細(xì)胞因子IL-6和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的影響， IL-6似乎在調(diào)節(jié)CRP表達(dá)中起著更重要的作用，TNF-α可通過刺激IL-6的表達(dá)從而增強肝臟CRP的合成，反過來CRP也可以刺激單核細(xì)胞釋放IL-6，IL-1和TNF-α，發(fā)揮致炎作用。Lee[9]等研究證實，健康人hs-CRP水平的升高可增加NAFLD的危險性，升高的hs-CRP水平與肝臟的脂肪含量正相關(guān)。Yeniova等[10]的研究證實，hs-CRP與肥胖的NAFLD患者脂肪組織和肝臟的脂肪變性密切相關(guān)，并可作為預(yù)測NAFLD肝脂肪變性的指標(biāo)。

目前研究顯示IL-6 可導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素抵抗[11]， IL-6是否可導(dǎo)致脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗?尚存在爭議。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IL-6 在脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞通過SOCS-3 導(dǎo)致胰島素抵抗。Klover等[12]發(fā)現(xiàn)持續(xù) 5 天輸注hIL-6 并沒有改變小鼠骨骼肌胰島素敏感性。

TNF-α主要由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)肥胖的嚙齒類動物脂肪組織中TNF-α過度表達(dá)，TNF-α水平升高與脂肪組織，肝臟與骨骼肌等的胰島素抵抗均有密切關(guān)系[13]。很早以前就有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α至少是鼠類胰島素敏感性的重要調(diào)節(jié)因子。TNF-α在體外可引起胰島素受體底物-1(IRS-1)的絲氨酸磷酸化，而絲氨酸磷酸化的IRS-1會抑制胰島素受體激酶活性及下游包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)在內(nèi)的信號通路的激活。

有動物的體內(nèi)和體外實驗研究證實，TNF-α，IL-6與hs-CRP水平升高與NF-κB，MAPK及AMPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[14]。而NF-κB，MAPK及AMPK均與胰島素抵抗發(fā)生有著密切關(guān)系，這提示炎癥因子TNF-α，IL-6與hs-CRP可能通過NF-κB，MAPK及AMPK通路導(dǎo)致NAFLD胰島素抵抗。而臨床NAFLD患者的胰島素抵抗是否與炎癥因子有關(guān)呢？本研究相關(guān)分析結(jié)果證實，本組NAFLD患者的葡萄糖代謝率均與TNF-α，IL-6及hs-CRP水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示NAFLD患者的胰島素抵抗與TNF-α，IL-6及hs-CRP水平升高有關(guān)。而具體機制是否涉及NF-κB，MAPK及AMPK通路，有待進(jìn)一步研究證實。